賈鵬博，姜秀煜，王玉紅，陳維建

(1.黑龍江省帶嶺林業(yè)科學(xué)研究所，黑龍江 伊春 153103；2.吉林省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院)

小興安嶺地區(qū)野生藍(lán)莓菌根真菌的分離和鑒定

賈鵬博1，姜秀煜1，王玉紅1，陳維建2

(1.黑龍江省帶嶺林業(yè)科學(xué)研究所，黑龍江 伊春 153103；2.吉林省林業(yè)調(diào)查規(guī)劃院)

試驗(yàn)利用2種不同的根段消毒方法從野生藍(lán)莓植株的根系內(nèi)分離出9株菌根真菌，其中5株分別命名為L1-L5，并對(duì)其進(jìn)行形態(tài)觀察與分子生物學(xué)鑒定，篩選出其中3株為杜鵑花科菌根真菌，結(jié)果如下：菌株L1屬于杜鵑花類菌根真菌Meliniomycesvariabilis屬真菌；菌株L2、L3為Phialocephalafortinii杜鵑花科菌根真菌；L4、L5為Fusariumoxysporum鐮刀菌屬。

野生藍(lán)莓;菌根真菌;分離;鑒定

藍(lán)莓(Blue Berry)為杜鵑花科(Ericaceae)越桔屬(VacciniumLinn.)植物，多年生灌木，其果實(shí)營養(yǎng)豐富，經(jīng)濟(jì)效益高，是潛力巨大的經(jīng)濟(jì)林樹種。它為淺根系植物，根系不發(fā)達(dá)，無根毛，主要分布在淺土層。在自然條件下，藍(lán)莓根系通常易與杜鵑花類菌根真菌形成互利共生的關(guān)系，它們形成一種特殊的菌根結(jié)構(gòu)(又稱歐石楠類菌根，ERM)。這類菌根可以促進(jìn)藍(lán)莓對(duì)營養(yǎng)元素的吸收，它可以幫助藍(lán)莓直接利用土壤中的有機(jī)氮，并促進(jìn)其對(duì)無機(jī)氮的吸收；促進(jìn)藍(lán)莓對(duì)難溶性P，特別是無機(jī)P 的吸收；還可以促進(jìn)藍(lán)莓對(duì)S、Ca、Cu、Zn、Mn、Fe 等其他元素的吸收；而當(dāng)重金屬元素供應(yīng)過量時(shí)，又能起到緩解作用，有菌根真菌侵染的植株，明顯表現(xiàn)出生長量大而且產(chǎn)量高[1]。菌根真菌還可以分泌有機(jī)酸，促使一些不易溶解的無機(jī)和有機(jī)化合物轉(zhuǎn)化為可溶態(tài)養(yǎng)分，被藍(lán)莓吸收。

篤斯越桔(Vacciniumuliginosum)，又稱野生藍(lán)莓，在小興安嶺地區(qū)資源豐富，蘊(yùn)含豐富的菌根真菌資源。本試驗(yàn)觀察并分離小興安嶺地區(qū)篤斯越桔的菌根真菌，并對(duì)分離出的菌根真菌進(jìn)行鑒定，為進(jìn)一步保護(hù)和應(yīng)用野生藍(lán)莓菌根真菌資源做好基礎(chǔ)工作。

1 試驗(yàn)材料

1.1 植物材料

2015年5月從伊春市友好區(qū)翠北林場采集健康野生藍(lán)莓附帶根基土壤的根樣，用已滅菌的采樣袋帶回實(shí)驗(yàn)室，存放在4℃冰箱內(nèi)，盡快取樣并觀察、分離菌根真菌。

1.2 菌種用培養(yǎng)基

分離菌種采用PDA培養(yǎng)基：配置1L溶液所需材料(馬鈴薯去皮切成小塊200 g，葡萄糖20g，瓊脂16～18g，蒸餾水1000mL)，于電磁爐上煮沸保持20min，用4層紗布過濾得到濾液，pH自然；121℃滅菌20min，待用[2]。

2 試驗(yàn)方法

2.1 根樣品預(yù)處理

取出野生藍(lán)莓菌根真菌根樣，選擇新鮮、健康的根樣，輕輕去除其表面的苔蘚及土壤，放在自來水下沖洗，沖洗時(shí)間約為2h，沖洗干凈后的菌根用干凈的吸水紙吸掉根表面的水分，剪成0.5cm的根段，備用。

2.2 侵染率計(jì)算

將預(yù)處理根樣于FAA固定液中固定24h，取出后放在10%KOH溶液中水浴(90℃)20～60min；然后取出用自來水輕輕沖洗根系至無色；將上述處理的根段進(jìn)行錐蟲藍(lán)染色(染液配方：錐蟲藍(lán)0.05g+苯酚20g+乳酸20mL+甘油40mL+蒸餾水20mL)，室溫下12h；將染色的根段取出于甘油中脫色，于光學(xué)顯微鏡下觀察，計(jì)算侵染率。

2.3 菌根菌的分離、純化

采用PDA培養(yǎng)基，利用根段直接分離法分離菌根真菌。將洗凈的根系，用以下兩種方式進(jìn)行根系表面滅菌：①將根段放入75%的酒精溶液中，滅菌30s，用無菌水沖洗3次，然后用0.1%的氯化汞溶液消毒2min，無菌水沖洗3次。②將根段放入75%的酒精溶液中滅菌2min，再用5%NaClO溶液浸泡12min，用無菌水沖洗3次。在超凈工作臺(tái)中將滅菌的根段切成1cm長，將根段放入平皿上，每個(gè)培養(yǎng)皿中放入3個(gè)根段，將培養(yǎng)皿放入培養(yǎng)箱中，25℃恒溫避光倒置培養(yǎng)，每種處理設(shè)3個(gè)重復(fù)。待根段切口處長出菌絲后用接種環(huán)挑取菌絲將其移至無菌空白PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純化培養(yǎng)，直至得到單一菌落。

2.4 菌根真菌鑒定

2.4.1 形態(tài)觀察。將純化后的菌種在PDA培養(yǎng)基上進(jìn)行純培養(yǎng)后，對(duì)其菌落的形態(tài)特征進(jìn)行觀察和記錄。

2.4.2 分子鑒定

2.4.2.1 儀器耗材：通過rDNA的18S序列進(jìn)行菌株鑒定。

表1 實(shí)驗(yàn)主要儀器耗材

(1)真菌基因組提取

1)從培養(yǎng)基中挑取真菌，盡量去除瓊脂。

2)加入200μL植物lysis buf，研磨至粉狀。

3)加入600μL植物lysis buf，0.8μL β巰基乙醇，充分混勻。

4)65℃水浴40min，12000rpm，10min離心。

5)去上清，加等體積氯仿抽提，12000rpm，5min離心。

6)加入700μL植物Binding buf，上柱靜置5min。

7)12000rpm，2min離心。

8)加入500μL 80%乙醇洗2次，12000rpm，1min離心。

8)室溫靜置10min揮發(fā)晾干，加40μL H2O，靜置5～10min。

9)換新管，13000rpm，2min離心，管底即為基因組。

目的片段擴(kuò)增：

引物合成：

NS1：GTAGTCATATGCTTGTCTC

NS8：TCCGCAGGTTCACCTACGGA

反應(yīng)體系

表2 反應(yīng)體系

反應(yīng)條件：

回收PCR產(chǎn)物

1)2.0%瓊脂糖凝膠電泳，切取目的片斷。

2)加入回收試劑溶液A 300μL/0.1g，6 0℃水浴至膠完全溶化。

3)加入50μL回收試劑溶液B，混勻。

4)將溶液置于離心柱中，靜置5min，12000rpm，1min，棄液體。

5)加入500μL 80%乙醇，12000rpm，離心1min，棄液體，重復(fù)1次。

6)12000rpm，離心5min，甩干余液，棄液體，晾干5～8min。

7)將離心柱置于新的離心管中，加入30μL滅菌雙蒸水，靜置10min。

8)13000rpm，離心3min，管底即為純化產(chǎn)物，取3μL電泳檢測。

(2)測序比對(duì)

以上試驗(yàn)由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司完成，所得的產(chǎn)物序列通過National Center Biotechnology Information(NCBI)核算數(shù)據(jù)庫利用Blast程序搜索得到結(jié)果。

3 結(jié)果與分析

3.1 侵染率

經(jīng)錐蟲藍(lán)染色法染色后真菌組織呈藍(lán)色，按照侵染率計(jì)算公式計(jì)算，通過光學(xué)顯微鏡觀察，野生藍(lán)莓內(nèi)生菌根菌的侵染率約為60%。實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)野生藍(lán)莓菌根真菌侵染率高的根段為分枝多直徑很細(xì)的根段，粗壯分枝少的根系侵染率很低。說明小興安嶺地區(qū)野生藍(lán)莓根系菌根真菌資源豐富。見圖1。

圖1 左為野生藍(lán)莓根段 右為野生藍(lán)莓菌根侵染形態(tài)

3.2 菌根真菌的分離

本試驗(yàn)采用根段培養(yǎng)法，采取兩種消毒方法進(jìn)行培養(yǎng)。

培養(yǎng)5天后，根段切面處長出白色菌絲(圖2)，可以推測此菌絲為藍(lán)莓根段內(nèi)共生真菌。采用的兩種消毒方法中，方法1分離出3個(gè)菌落，方法2分離出6個(gè)菌落。方法1分離出來的菌落較少，可能是由于酒精、升汞處理的造成菌絲的死亡。但是方法2的消毒方法根段污染率明顯高于方法1。

圖2 分離出的菌根真菌

圖3 2種方法對(duì)菌根真菌分離數(shù)量的影響

采用根段直接培養(yǎng)法分離野生藍(lán)莓菌根真菌，采用2種根段表面消毒法。不同消毒方法得到的菌落數(shù)不同，方法2得到的菌落數(shù)稍多，但是根段污染率極高，不易純化，而方法1消毒方法根段幾乎沒有污染，純化簡單。說明消毒時(shí)間及方法不同分離得到的真菌數(shù)量不同，純化難易程度也不相同。經(jīng)過篩選，淘汰了常見的腐生性真菌，初步得到5株單菌落。分別命名為L1～L5。

3.3 菌株培養(yǎng)特征

表3 分離得到的菌落特征(PDA培養(yǎng)基，25℃)

3.4 菌株鑒定

本研究通過對(duì)真菌的rDNA的ITS序列分析，對(duì)5個(gè)菌株進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，通過18s rDNA檢測技術(shù)，從核酸水平鑒定菌株并進(jìn)行分類鑒定可以很大程度地提高菌種分類鑒定的準(zhǔn)確率。

利用以上真菌的rDNA的ITS作為通用引物對(duì)供試的菌株擴(kuò)增得到rDNA序列，將得到的序列通過GeneBank上的BLAST局部相似性查詢系統(tǒng)，搜索和待測菌株最相似的序列，并比較分析。菌株L1屬于杜鵑花類菌根真菌Meliniomycesvariabilis屬真菌。菌株L2、L3為Phialocephalafortinii杜鵑花科菌根真菌。L4、L5為Fusariumoxysporum鐮刀菌屬。5株菌株中有2株為鐮刀菌屬，說明可能植物本身正處在非內(nèi)生性病原菌感染的初期，這樣我們分離得到的真菌就不是目的內(nèi)生真菌。

表4 4株內(nèi)生真菌的BLAST結(jié)果

采用的根段分離法對(duì)野生藍(lán)莓菌根真菌進(jìn)行分離，此法雖然是國內(nèi)外分離歐石楠類菌根真菌最普遍的方法，但其本身也存在其自身的局限性。首先，即使選取的根系沒有病害癥狀等，但也可能有潛在的病原菌存在，本試驗(yàn)中，分離出的鐮刀菌屬被確定是潛在的致病菌。第二，有些菌根真菌并不一定能在人工培養(yǎng)基上生長，從而不能將其從植物組織內(nèi)的內(nèi)生真菌全部被分離出來，第三，菌根真菌長期生活在植物組織內(nèi)部，與宿主植物協(xié)同進(jìn)化，為適應(yīng)微環(huán)境其形態(tài)特征會(huì)發(fā)生一定變化，因此，傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)分類標(biāo)準(zhǔn)能否準(zhǔn)確反映出真實(shí)分類地位有待探討。

由此可見，創(chuàng)建從活體植物根系組織內(nèi)直接檢測和鑒定內(nèi)生真菌的技術(shù)體系是非常必要的。對(duì)植物根段的消毒時(shí)間也是影響分離效果的主要因素，何映霞研究珙桐內(nèi)生真菌的實(shí)驗(yàn)表明，不同的消毒時(shí)間分離得到的真菌數(shù)量是不同的。消毒時(shí)間過長，可能會(huì)殺死一些內(nèi)生真菌，從而不能完全分離出植株內(nèi)生真菌；消毒時(shí)間過短，可能不會(huì)完全殺死植物根系組織表面的雜菌，干擾實(shí)驗(yàn)結(jié)果[3]。

我們將用本次試驗(yàn)分離出的杜鵑花科菌根真菌接種于藍(lán)莓苗中，觀察其對(duì)藍(lán)莓植株生長的促進(jìn)作用，為實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

[1]顧姻，賀善安.藍(lán)漿果與蔓越橘[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社.2001

[2]鄭文龍，朱慧芳.產(chǎn)紫杉醇內(nèi)生真菌EFY-21的鑒定與生物學(xué)特性研究[J].菌物研究，2010，8(1)：35-39.

[3]何映霞.珙桐產(chǎn)黃酮內(nèi)生真菌的分離及鑒定[J].貴州，貴州大學(xué)，2008.

2017-06-09

S663.9

A

DOI.∶10.13268/j.cnki.fbsic.2017.05.008