皇甫永冠，閆寶松，張躍新，宗憲春

(1.東北林業(yè)大學鹽堿地研究中心，哈爾濱 150040；2.黑龍江省林副特產研究所，黑龍江省非木質林產品研發(fā)重點實驗室，黑龍江 牡丹江 157011；3 牡丹江師范學院，黑龍江 牡丹江 157000)

猴頭菇DNA條形碼的構建及驗證

皇甫永冠1，閆寶松2，張躍新2，宗憲春3

(1.東北林業(yè)大學鹽堿地研究中心，哈爾濱 150040；2.黑龍江省林副特產研究所，黑龍江省非木質林產品研發(fā)重點實驗室，黑龍江 牡丹江 157011；3 牡丹江師范學院，黑龍江 牡丹江 157000)

為構建猴頭菇品種專屬的DNA條形碼。應用分子生物學方法、選定β-tubulin基因作為條形碼序列的目標基因，依據NCBI中猴頭菇β-tubulin基因序列的全長，設計了一對用于擴增目標基因的引物：Betu-F1:ATGCGTGAAATCGTCCACC；Betu-R2:GAAGACGGGGGAAAGGAAC。應用上述引物對現有的19個猴頭菇的品種進行PCR鑒定。測序后的序列結合BLAST、Clustal、MEGA、BioEdit等軟件分析、比對得到多態(tài)性位點，分析多態(tài)性位點設計出構建條形碼序列的特異性引物。經驗證表明，猴頭菇RT9品種的3個特有的條形碼成功獲得。試驗結果表明，實驗成功獲得的DNA條形碼序列可以將猴頭菇RT9品種與猴頭菇的其它品種區(qū)分鑒定。

猴頭菇；DNA條形碼；內含子多態(tài)性

Abstract:The aim was to construct the DNA barcode of Hericium erinaceus. Using molecular biology method,Selected β-tubulin gene as the target gene of bar code sequence,A pair of primers for amplification of the target gene was designed according to the full-length of the β-tubulin gene sequence of NCBI:Betu-F1:ATGCGTGAAATCGTCCACC；Betu-R2:GAAGACGGGGGAAAGGAAC.The above primers were used to identify the 19 species of Hericium erinaceus of PCR.Sequencing of the sequence with BLAST, Clustal, MEGA, BioEdit and other software analysis, comparison of polymorphic loci,Analysis of polymorphic loci was designed to construct a specific primer sequence. The results showed that the three unique bar codes of Hericium erinaceus RT9 were successfully obtained.The experiment result shows:the DNA barcode sequence obtained from the experiment can distinguish the RT9 and other varieties of Hericium erinaceus

Keywords:Hericiumerinaceus; DNA barcoding; Intron polymorphis

0 緒論

猴頭菇因營養(yǎng)豐富、味道鮮美及具抗癌等功效，近些年來成為相關行業(yè)的研究熱點，但對它的研究多集中在深加工等方面。中國現有的猴頭菇有幾十種到數百種，它們的營養(yǎng)成分及功效各不相同，而且名稱混亂，給引種、栽培和開發(fā)利用工作帶來較大的麻煩[1]。猴頭菇菌種的區(qū)分鑒定對于今后的育種工作及種質資源的保護意義重大，但由于現在多數只是從形態(tài)學的角度來鑒定菌種，其準確性不是十分的可靠，研究表明，將分子標記應用在菌種鑒定上將會大幅度的增加鑒定效率。根據前人對物種的鑒定研究來看，DNA條形碼技術在區(qū)分物種時具簡單、快速、準確性高等優(yōu)點，因此本實驗結合內含子多態(tài)性，力爭構建出猴頭菇的專屬DNA條形碼，為今后食用菌行業(yè)的種質資源鑒定提供行之有效的手段。自Hebert等[2-3]提議使用線粒體基因細胞色素C氧化酶(COI)基因片段作為動物的DNA條形碼后，DNA條形碼技術得以迅速發(fā)展，在動物、植物、微生物的鑒定及分類上開始廣泛的應用[4]。DNA barcoding技術在動物中的研究進展：COI基因通常作為動物的條形碼[5-6]目前主要運用于鳥類[7-16]、魚類[17-21]、昆蟲[22-24]的分類鑒定。DNA barcoding在植物中研究進展：2009年國際生命條形碼聯盟植物工作組(Consortiumfor the Barcode of Life Plant Working Group)初步確定，并推薦使用葉綠體基因片段的rbcL和matK作為植物的DNA條形碼基因[25]。DNA barcoding技術在微生物中的研究進展：目前主要在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)突變菌株的識別[26]，毛霉屬(Mucor)[27]、青霉屬(Penicillium)[28]、口蘑屬(Tricholoma)[29]等物種鑒別中有應用。相比于動物、植物，菌物DNA barcoding技術的研究起步相對較晚，研究的也較少，到目前為止菌物的DNA條形碼的標準序列還沒有選定。依據Zhao等[30]、Samson et al.[31]，分別對叢赤殼類真菌、青霉亞屬的代表性菌株進行的序列分析表明，β-tubulin基因在真菌鑒定中是一種理想的DNA barcoding標記基因，無論是在PCR鑒定還是測序上都表現出很高的成功率，而且不存在種間和種內的交疊，鑒定效果優(yōu)于ITS。因此，本實驗選定β-tubulin 基因作為構建猴頭菇品種的條形碼的目標基因，構建猴頭菇品種的專屬條線碼。本研究針對19個猴頭菇的品種構建猴頭菇品種的DNA條形碼，經驗證成功構建的條形碼序列在所有猴頭菇品種中均適用，因此，DNA條形碼技術在菌物鑒定中應用切實可行，為今后菌物菌種鑒定提供了技術手段。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

供試菌株見表1。

表1 供試菌種

續(xù)表1

序號名稱采集地9野猴3黑龍江省牡丹江市三道關林區(qū)野生10RT9黑龍江省農業(yè)經濟學院11RT10黑龍江省農業(yè)經濟學院12RT11黑龍江省農業(yè)經濟學院13RT12黑龍江省農業(yè)經濟學院14RT13黑龍江省農業(yè)經濟學院15RT14黑龍江省農業(yè)經濟學院16RT16黑龍江省農業(yè)經濟學院17RT17黑龍江省農業(yè)經濟學院18RT18黑龍江省農業(yè)經濟學院19RT19黑龍江省農業(yè)經濟學院

1.2 實驗方法

1.2.1 DNA條形碼的構建

(1)選取材料：19個猴頭菇品種(見表1)。

(2)獲得及培養(yǎng)19個猴頭菇品種的菌絲體。

(3)DNA的提取：本實驗采用CTAB法對供試菌株的DNA進行提取。

(4)設計引物及擴增基因

設計引物

依據NCBI中猴頭菇β-tubulin基因的全長設計了一對引物如下：Betu-F:ATGCGTGAAATCGTCCACC；Betu-R:GAAGACGGGGGAAAGGAAC。

擴增目的基因

PCR的體系：10×buffer 緩沖液 2 μL,d NTP(2.5mM each) 1.6 μL,上游引物(10μM) 1 μL,下游引物(10μM) 1 μL,r-Taq DNA 聚合酶(5U/ μL) 0.3 μL,基因組 DNA 1 μL,用滅過菌的去離子水補足至20μL。

PCR反應程序：94℃預變性5min；94℃變性30s,55℃退火30s , 72℃延伸1min20s,35個循環(huán),72℃再延伸 20 min。

(5)T-A克隆

目的基因的回收及檢測

利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對目標條帶進行切膠回收，1%的凝膠濃度對回收的目的基因進行檢測。

連接反應

體系10μL:2×Rapid ligation Buffer 5μL,pGEM-T Easy vector 1μL,PCR product,1μL,T4 DNA Ligase,1μL,ddH2O,2μL,16℃過夜連接不超過16h。

轉化

熱激轉化：16℃連接過夜后，將10μL連接產物加入到感受態(tài)細胞中(DH5a)中，冰浴30min，42℃熱激90s，在冰浴2min，向其中加入500μL B液體培養(yǎng)基，37℃180轉震蕩培養(yǎng)40～60min，取震蕩培養(yǎng)后的菌液200μL涂布在加有AMP+IPTG+X-Gal的固體LB培養(yǎng)基的平板上(藍白斑篩選)，為防止因立即倒置培養(yǎng)，造成菌液流動現象，將涂布后的菌版在37℃正向培養(yǎng)1h，之后倒置過夜培養(yǎng)，篩選陽性單菌落。

篩選重組子

挑取藍白斑篩選平板上白色的單菌落，至5mL含AMP 的LB液體培養(yǎng)基中，將震蕩培養(yǎng)箱的溫度調制37℃、轉速調至180r/min，培養(yǎng)約6h左右至菌液渾濁，進行菌液PCR檢測。

體系20μL：10×buffer 緩沖液 2 μL,d NTP(2.5mM each) 1.6 μL,上游引物(10μM) 1 μL,下游引物(10μM) 1 μL,r-Taq DNA 聚合酶(5U/ μL) 0.3 μL,菌液 1 μL,用滅過菌的去離子水定容至20μL。

PCR反應程序：94℃預變性5min；94℃變性 30s,60℃退火 30s,72℃延伸1min20s 35個循環(huán),72℃再延伸 5 min。

PCR產物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳對其進行檢測，陽性菌液保存?zhèn)溆谩?/p>

重組子測序

取出保存的陽性菌液送至生物公司(promega)進行測序。

測序結果分析

測序成功的序列結合primmer5.0對其進行整理，用BLAST軟件對單一序列進行比對，得到有效的序列，利用Clustal軟件對有效的序列進行多重比對，找出每個品種的代表性序列，再將代表性序列應用MEGA 5.1的鄰接法(Neighbor-Joining)構建系統發(fā)育樹進、應用BioEdit軟件做出更直觀的多態(tài)性位點圖，分析整體多態(tài)性位點的分布情況，再將系統發(fā)育進化樹的每個大的分支的序列，應用BioEdit及Clustal軟件進行多重比對，分析每個大分支的多態(tài)性位點，進而找出成功設計DNA條形碼的多態(tài)性位點。

(6)確定特異引物并合成

分析多態(tài)性位點，結合primer軟件設計每個特異品種的特有引物(如果后續(xù)的條形碼驗證成功，此引物則為條形碼序列的特異引物)。將構建的特異引物送至生物公司(上海生工)合成。

1.2.2 DNA條形碼的驗證

(1)現有菌種中的驗證：應用上述合成的特異性引物，分別對猴頭菇19個品種的基因組DNA進行PCR驗證，具體步驟如下：

①從樣品組織中提取基因組DNA；

②用步驟1所提取的基因組DNA為模板，用上述合成的特異性引物，進行聚合酶鏈式反應；

③對步驟2擴增得到的PCR產物進行電泳檢測，其特征是擴增片段長度，應與合成的特異性引物所擴增出目標條帶大小一致。

(2)所有猴頭菇品種中的適用性驗證：把上述已構建成功的DNA條形碼序列與GenBank數據庫中已發(fā)表的含有猴頭菇β-tubulin基因的序列(序列登錄號：>gi|386872545|>gi|63333592|>gi|84626253|>gi|84626251| >gi|84626249| >gi|84626247|>gi|84626245|>gi|84626243| >gi|84626241|>gi|84626239|>gi|84626237| >gi|84626235| >gi|84626233| >gi|84626231|>gi|84626229| >gi|84626227|>gi|84626225| >gi|84626223| >gi|84626221|>gi|84626219|>gi|84626217|>gi|84626215|>gi|84626213|>gi|84626212| >gi|84626210| >gi|84626208|>gi|84626206|>gi|84626204| >gi|84626202|>gi|84626200| >gi|84626198| >gi|84626196| >gi|84626194| >gi|84626192|>gi|84626190|>gi|84626188| >gi|84626186| >gi|84626184|>gi|84626182| )進行比對如果構建成功的條形碼序列與已發(fā)表的序列間存在差異，說明該條形碼序列可以很好地將此品種與其他的猴頭菇品種區(qū)分開。

2 結果與分析

2.1 DNA提取

提取的DNA采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，結果顯示所有樣本DNA均成功提取，見圖1。

圖1 DNA提取檢測

2.2 目的基因切膠回收

依據NCBI中猴頭菇β-tubulin基因的全長設計的一對引物Betu-F1:ATGCGTGAAATCGTCCACC;Betu-R2:GAAGACGGGGGAAAGGAAC，用其對目的基因進行擴增，PCR產物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測。所有樣本均成功擴增，條帶大小約1.3kb，切膠回收電泳結果見圖2。

圖2 目的基因切膠回收

2.3 陽性鑒定

在藍白斑篩選的平板上挑取白色菌落，放入LB液體培養(yǎng)基內搖菌，做菌液PCR，PCR產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測篩選出陽性菌。因為，所需要的陽性菌并非一次性檢出，所以實驗過程中將每次檢測出的陽性菌液均進行保存，待實驗結束后將所有檢測出的陽性菌的菌液PCR產物集中電泳(見圖3)。

圖3 菌液陽性鑒定

2.4 系統發(fā)育進化樹

應用MEGA軟件對代表性序列進行分析得出系統發(fā)育進化樹圖(見圖4)，從圖片上可直觀看出猴頭菇RT9品種是一條獨立的分支，說明RT9品種與其它猴頭菇品種間親緣關系較遠，構建條形碼的成功率會增加。

圖4 系統發(fā)育進化樹

注：圖1中2.3、2.4、2.5為猴99的代表性序列；4.1、4.2為野猴3的代表性序列；RT16-2、RT16-3為RT16的代表性序列；HAI1、HAI3為海猴的代表性序列；RT17-1、RT17-2為RT17的代表性序列；RT18-2、RT18-3為RT18的代表性序列；RT19-1、RT19-2為RT19的代表性序列；RT10-3、RT10-4為RT10的代表性序列；RT13-1、RT13-2為RT13的代表性序列；RT12-1、RT12-2為RT12的代表性序列；RT9-1、RT9-3為RT9的代表性序列；RT11-4、RT11-5為RT11的代表性序列；RT14-3、RT14-4為RT14的代表性序列；HOU4-1、HOU4-2為猴4的代表性序列；HA2、HA5為HA的代表性序列；HOU2、HOU3為猴的代表性序列；HOU5-1、HOU5-2為猴5的代表性序列；HOU9-2、HOU9-3為猴9的代表性序列。

2.5 多態(tài)性位點分析

將測序后的所有序列應用BLAST、Clustal軟件篩查分析，得到每個品種具有代表性的序列，結合MEGA軟件構建系統發(fā)育進化樹(見圖4)。但是由于序列過多，導致分析多態(tài)性位點、設計特異性引物難度增加，為此，將系統發(fā)育進化樹的每個大的分支的序列，應用Clustal軟件分別進行多重比對，每個分支的多重序列比對結果見附錄1，由于比對結果占篇幅龐大，附錄1中僅列出構建成功的條形碼序列所在的分支的多重比對結果，根據多重比對的結果分析多態(tài)性位點，在此基礎上找出成功設計DNA條形碼的多態(tài)性位點(附錄1已標明)，設計出每個品種特有的專屬條形碼引物。

2.6 條形碼驗證

分析多態(tài)性位點設計出了幾十對用于構建條形碼的引物，經逐一驗證發(fā)現，猴頭菇RT9的3個條形碼成功構建(見圖5-a；5-b)，應用這三條條形碼序列可以將RT9與猴頭菇的其他18個品種區(qū)分開。對應的3個引物為CRT9-3F1：CGGTACGAGGATCGCGCAAAC；CRT9-3R1GCGACCGTCTT

CCCACA；(擴增序列長度為353bp)、CRT9-3F1：CGGTACGAGGATCGCGCAAAC；CRT9-3R2：GTGTCAAGTCGCAAAAAT(擴增序列長度為483bp)、RT9-2F：TCCTCACACACACTGGTAC；RT9-2R：GTACGGATGTTGCAGTAG(擴增序列長度為723bp)，應用這3對引物擴增出的條形碼序列。

圖5-a DNA條形碼驗證

圖5-b DNA條形碼驗證

2.7 3個條形碼在整個猴頭菇品種中的適用性檢測

把上述已構建成功的3個猴頭菇RT9的DNA條形碼序列與GenBank數據庫中已發(fā)表的含有猴頭菇β-tubulin基因的序列(序列登陸號見1.2.2)進行比對，發(fā)現這3個條形碼序列與已發(fā)表的序列間存在差異，因此應用這3個序列可以很好地將RT9與其它的猴頭菇品種區(qū)分開，所以這3個序列可以作為鑒定猴頭菇RT9的專屬條形碼。

3 討論

3.1 構建條形碼目標基因的選擇

動物中通常作為條形碼片段的基因為COI基因[5-6]，也是目前研究最為完善的。最初作為植物條形碼片段的基因為葉綠體基因片段的rbcL和matK[25]，后來研究人員對高等植物、真菌、藻類的大量ITS2序列進行研究分析，結果顯示，ITS2在種級分辨上表現出很高的鑒定成功率。所以，建議以ITS2可以作為新的DNA條形碼，在鑒定綠色植物及部分真菌時使用[32-33]。

相比于動物、植物，菌物DNA條形碼的研究及應用起步較晚，目前為止也沒有明確作為菌物條形碼片段的基因，前人研究發(fā)現，β-tubulin基因在叢赤殼類真菌的研究中表現出高的 PCR 和測序成功率，且沒有種間及種內的交疊，在一些菌種鑒定過程中，β-tubulin基因表現出了ITS2還要高的鑒定成功率[30-31]，因此，本實驗選擇了β-tubulin基因作為條形碼片段的目標基因，并依據NCBI中猴頭菇β-tubulin基因的全長設計了一對引物用于擴增目的基因。

3.2 假陽性分析

依據多態(tài)性位點合成的幾十對用于擴增特異性條形碼的引物，在條形碼驗證時僅有RT9的3個條形碼成功獲得，可能導致此結果的原因如下：①在測序時相關的堿基錯讀或缺失，②菌液PCR過程中可能發(fā)生堿基錯配等原因。

3.3 實驗體系優(yōu)化

重組子鑒定過程中，開始陽性檢出率非常低，存在非特異性擴增現象，經分析可能是如下原因：①可能實驗體系存在問題，如，Taq酶、T載體等的使用是否合適，②可能由于PCR的退火溫度過低，這樣雖然可以增加擴增的產量，但引物和模板之間的錯配現象也會相應增加，就會導致非特異性擴增。改進措施如下：①將實驗原來用的生工的T載體更換為大連寶生物的pGEM-T載體。②將最初使用的Taq酶(上海生工)更換為r-Taq酶(大連寶生物)。③通過提高PCR的退火溫度，由原來的55℃增至60℃。實驗體系經上述優(yōu)化后，陽性檢出率低、非特異性擴增的現象均有所改進。

4 結論

本實驗應用分子生物學的研究手段，成功構建出猴頭菇RT9品種的3個條形碼。經驗證表明，這3個特異性條形碼在所有猴頭菇品種中均適用。因此，DNA條形碼技術在菌物的鑒定中應用切實可行。

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ConstructionandVerificationofDNABarcodeforHericiumerinaceus

Huangfu Yongguan1, Yan Baosong2, Zhang Yuexin2, Zong Xianchun3

(1.Northeast Forestry University/Saline and alkaline land resources and Environment Research Center,Harbin 150040;2.Heilongjiang Forest Products Research Institute,Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Non-wood Forest Product Development，Mudanjiang， Heilongjiang 157011;3.Mudanjiang Normal University/College of life science and technology,Mudanjiang 157000)

2017-05-06

林業(yè)公益性行業(yè)科研專項經費(201404703-3)

皇甫永冠(1990-)，女，博士，從事植物抗逆基因與逆境脅迫應答的分子機理研究，E-mail:595287087@qq.com.

S759.81

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.05.003