皇甫永冠，閆寶松，張躍新，宗憲春

(1.東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地研究中心，哈爾濱 150040；2.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所，黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 牡丹江 157011；3 牡丹江師范學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157000)

猴頭菇DNA條形碼的構(gòu)建及驗(yàn)證

皇甫永冠1，閆寶松2，張躍新2，宗憲春3

(1.東北林業(yè)大學(xué)鹽堿地研究中心，哈爾濱 150040；2.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所，黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 牡丹江 157011；3 牡丹江師范學(xué)院，黑龍江 牡丹江 157000)

為構(gòu)建猴頭菇品種專(zhuān)屬的DNA條形碼。應(yīng)用分子生物學(xué)方法、選定β-tubulin基因作為條形碼序列的目標(biāo)基因，依據(jù)NCBI中猴頭菇β-tubulin基因序列的全長(zhǎng)，設(shè)計(jì)了一對(duì)用于擴(kuò)增目標(biāo)基因的引物：Betu-F1:ATGCGTGAAATCGTCCACC；Betu-R2:GAAGACGGGGGAAAGGAAC。應(yīng)用上述引物對(duì)現(xiàn)有的19個(gè)猴頭菇的品種進(jìn)行PCR鑒定。測(cè)序后的序列結(jié)合BLAST、Clustal、MEGA、BioEdit等軟件分析、比對(duì)得到多態(tài)性位點(diǎn)，分析多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)出構(gòu)建條形碼序列的特異性引物。經(jīng)驗(yàn)證表明，猴頭菇RT9品種的3個(gè)特有的條形碼成功獲得。試驗(yàn)結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)成功獲得的DNA條形碼序列可以將猴頭菇RT9品種與猴頭菇的其它品種區(qū)分鑒定。

猴頭菇；DNA條形碼；內(nèi)含子多態(tài)性

Abstract:The aim was to construct the DNA barcode of Hericium erinaceus. Using molecular biology method,Selected β-tubulin gene as the target gene of bar code sequence,A pair of primers for amplification of the target gene was designed according to the full-length of the β-tubulin gene sequence of NCBI:Betu-F1:ATGCGTGAAATCGTCCACC；Betu-R2:GAAGACGGGGGAAAGGAAC.The above primers were used to identify the 19 species of Hericium erinaceus of PCR.Sequencing of the sequence with BLAST, Clustal, MEGA, BioEdit and other software analysis, comparison of polymorphic loci,Analysis of polymorphic loci was designed to construct a specific primer sequence. The results showed that the three unique bar codes of Hericium erinaceus RT9 were successfully obtained.The experiment result shows:the DNA barcode sequence obtained from the experiment can distinguish the RT9 and other varieties of Hericium erinaceus

Keywords:Hericiumerinaceus; DNA barcoding; Intron polymorphis

0 緒論

猴頭菇因營(yíng)養(yǎng)豐富、味道鮮美及具抗癌等功效，近些年來(lái)成為相關(guān)行業(yè)的研究熱點(diǎn)，但對(duì)它的研究多集中在深加工等方面。中國(guó)現(xiàn)有的猴頭菇有幾十種到數(shù)百種，它們的營(yíng)養(yǎng)成分及功效各不相同，而且名稱(chēng)混亂，給引種、栽培和開(kāi)發(fā)利用工作帶來(lái)較大的麻煩[1]。猴頭菇菌種的區(qū)分鑒定對(duì)于今后的育種工作及種質(zhì)資源的保護(hù)意義重大，但由于現(xiàn)在多數(shù)只是從形態(tài)學(xué)的角度來(lái)鑒定菌種，其準(zhǔn)確性不是十分的可靠，研究表明，將分子標(biāo)記應(yīng)用在菌種鑒定上將會(huì)大幅度的增加鑒定效率。根據(jù)前人對(duì)物種的鑒定研究來(lái)看，DNA條形碼技術(shù)在區(qū)分物種時(shí)具簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)，因此本實(shí)驗(yàn)結(jié)合內(nèi)含子多態(tài)性，力爭(zhēng)構(gòu)建出猴頭菇的專(zhuān)屬DNA條形碼，為今后食用菌行業(yè)的種質(zhì)資源鑒定提供行之有效的手段。自Hebert等[2-3]提議使用線粒體基因細(xì)胞色素C氧化酶(COI)基因片段作為動(dòng)物的DNA條形碼后，DNA條形碼技術(shù)得以迅速發(fā)展，在動(dòng)物、植物、微生物的鑒定及分類(lèi)上開(kāi)始廣泛的應(yīng)用[4]。DNA barcoding技術(shù)在動(dòng)物中的研究進(jìn)展：COI基因通常作為動(dòng)物的條形碼[5-6]目前主要運(yùn)用于鳥(niǎo)類(lèi)[7-16]、魚(yú)類(lèi)[17-21]、昆蟲(chóng)[22-24]的分類(lèi)鑒定。DNA barcoding在植物中研究進(jìn)展：2009年國(guó)際生命條形碼聯(lián)盟植物工作組(Consortiumfor the Barcode of Life Plant Working Group)初步確定，并推薦使用葉綠體基因片段的rbcL和matK作為植物的DNA條形碼基因[25]。DNA barcoding技術(shù)在微生物中的研究進(jìn)展：目前主要在釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)突變菌株的識(shí)別[26]，毛霉屬(Mucor)[27]、青霉屬(Penicillium)[28]、口蘑屬(Tricholoma)[29]等物種鑒別中有應(yīng)用。相比于動(dòng)物、植物，菌物DNA barcoding技術(shù)的研究起步相對(duì)較晚，研究的也較少，到目前為止菌物的DNA條形碼的標(biāo)準(zhǔn)序列還沒(méi)有選定。依據(jù)Zhao等[30]、Samson et al.[31]，分別對(duì)叢赤殼類(lèi)真菌、青霉亞屬的代表性菌株進(jìn)行的序列分析表明，β-tubulin基因在真菌鑒定中是一種理想的DNA barcoding標(biāo)記基因，無(wú)論是在PCR鑒定還是測(cè)序上都表現(xiàn)出很高的成功率，而且不存在種間和種內(nèi)的交疊，鑒定效果優(yōu)于ITS。因此，本實(shí)驗(yàn)選定β-tubulin 基因作為構(gòu)建猴頭菇品種的條形碼的目標(biāo)基因，構(gòu)建猴頭菇品種的專(zhuān)屬條線碼。本研究針對(duì)19個(gè)猴頭菇的品種構(gòu)建猴頭菇品種的DNA條形碼，經(jīng)驗(yàn)證成功構(gòu)建的條形碼序列在所有猴頭菇品種中均適用，因此，DNA條形碼技術(shù)在菌物鑒定中應(yīng)用切實(shí)可行，為今后菌物菌種鑒定提供了技術(shù)手段。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

供試菌株見(jiàn)表1。

表1 供試菌種

續(xù)表1

序號(hào)名稱(chēng)采集地9野猴3黑龍江省牡丹江市三道關(guān)林區(qū)野生10RT9黑龍江省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院11RT10黑龍江省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院12RT11黑龍江省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院13RT12黑龍江省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院14RT13黑龍江省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院15RT14黑龍江省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院16RT16黑龍江省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院17RT17黑龍江省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院18RT18黑龍江省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院19RT19黑龍江省農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 DNA條形碼的構(gòu)建

(1)選取材料：19個(gè)猴頭菇品種(見(jiàn)表1)。

(2)獲得及培養(yǎng)19個(gè)猴頭菇品種的菌絲體。

(3)DNA的提?。罕緦?shí)驗(yàn)采用CTAB法對(duì)供試菌株的DNA進(jìn)行提取。

(4)設(shè)計(jì)引物及擴(kuò)增基因

設(shè)計(jì)引物

依據(jù)NCBI中猴頭菇β-tubulin基因的全長(zhǎng)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物如下：Betu-F:ATGCGTGAAATCGTCCACC；Betu-R:GAAGACGGGGGAAAGGAAC。

擴(kuò)增目的基因

PCR的體系：10×buffer 緩沖液 2 μL,d NTP(2.5mM each) 1.6 μL,上游引物(10μM) 1 μL,下游引物(10μM) 1 μL,r-Taq DNA 聚合酶(5U/ μL) 0.3 μL,基因組 DNA 1 μL,用滅過(guò)菌的去離子水補(bǔ)足至20μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s,55℃退火30s , 72℃延伸1min20s,35個(gè)循環(huán),72℃再延伸 20 min。

(5)T-A克隆

目的基因的回收及檢測(cè)

利用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行切膠回收，1%的凝膠濃度對(duì)回收的目的基因進(jìn)行檢測(cè)。

連接反應(yīng)

體系10μL:2×Rapid ligation Buffer 5μL,pGEM-T Easy vector 1μL,PCR product,1μL,T4 DNA Ligase,1μL,ddH2O,2μL,16℃過(guò)夜連接不超過(guò)16h。

轉(zhuǎn)化

熱激轉(zhuǎn)化：16℃連接過(guò)夜后，將10μL連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中(DH5a)中，冰浴30min，42℃熱激90s，在冰浴2min，向其中加入500μL B液體培養(yǎng)基，37℃180轉(zhuǎn)震蕩培養(yǎng)40～60min，取震蕩培養(yǎng)后的菌液200μL涂布在加有AMP+IPTG+X-Gal的固體LB培養(yǎng)基的平板上(藍(lán)白斑篩選)，為防止因立即倒置培養(yǎng)，造成菌液流動(dòng)現(xiàn)象，將涂布后的菌版在37℃正向培養(yǎng)1h，之后倒置過(guò)夜培養(yǎng)，篩選陽(yáng)性單菌落。

篩選重組子

挑取藍(lán)白斑篩選平板上白色的單菌落，至5mL含AMP 的LB液體培養(yǎng)基中，將震蕩培養(yǎng)箱的溫度調(diào)制37℃、轉(zhuǎn)速調(diào)至180r/min，培養(yǎng)約6h左右至菌液渾濁，進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)。

體系20μL：10×buffer 緩沖液 2 μL,d NTP(2.5mM each) 1.6 μL,上游引物(10μM) 1 μL,下游引物(10μM) 1 μL,r-Taq DNA 聚合酶(5U/ μL) 0.3 μL,菌液 1 μL,用滅過(guò)菌的去離子水定容至20μL。

PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性5min；94℃變性 30s,60℃退火 30s,72℃延伸1min20s 35個(gè)循環(huán),72℃再延伸 5 min。

PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)，陽(yáng)性菌液保存?zhèn)溆谩?/p>

重組子測(cè)序

取出保存的陽(yáng)性菌液送至生物公司(promega)進(jìn)行測(cè)序。

測(cè)序結(jié)果分析

測(cè)序成功的序列結(jié)合primmer5.0對(duì)其進(jìn)行整理，用BLAST軟件對(duì)單一序列進(jìn)行比對(duì)，得到有效的序列，利用Clustal軟件對(duì)有效的序列進(jìn)行多重比對(duì)，找出每個(gè)品種的代表性序列，再將代表性序列應(yīng)用MEGA 5.1的鄰接法(Neighbor-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)、應(yīng)用BioEdit軟件做出更直觀的多態(tài)性位點(diǎn)圖，分析整體多態(tài)性位點(diǎn)的分布情況，再將系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的每個(gè)大的分支的序列，應(yīng)用BioEdit及Clustal軟件進(jìn)行多重比對(duì)，分析每個(gè)大分支的多態(tài)性位點(diǎn)，進(jìn)而找出成功設(shè)計(jì)DNA條形碼的多態(tài)性位點(diǎn)。

(6)確定特異引物并合成

分析多態(tài)性位點(diǎn)，結(jié)合primer軟件設(shè)計(jì)每個(gè)特異品種的特有引物(如果后續(xù)的條形碼驗(yàn)證成功，此引物則為條形碼序列的特異引物)。將構(gòu)建的特異引物送至生物公司(上海生工)合成。

1.2.2 DNA條形碼的驗(yàn)證

(1)現(xiàn)有菌種中的驗(yàn)證：應(yīng)用上述合成的特異性引物，分別對(duì)猴頭菇19個(gè)品種的基因組DNA進(jìn)行PCR驗(yàn)證，具體步驟如下：

①?gòu)臉悠方M織中提取基因組DNA；

②用步驟1所提取的基因組DNA為模板，用上述合成的特異性引物，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；

③對(duì)步驟2擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，其特征是擴(kuò)增片段長(zhǎng)度，應(yīng)與合成的特異性引物所擴(kuò)增出目標(biāo)條帶大小一致。

(2)所有猴頭菇品種中的適用性驗(yàn)證：把上述已構(gòu)建成功的DNA條形碼序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的含有猴頭菇β-tubulin基因的序列(序列登錄號(hào)：>gi|386872545|>gi|63333592|>gi|84626253|>gi|84626251| >gi|84626249| >gi|84626247|>gi|84626245|>gi|84626243| >gi|84626241|>gi|84626239|>gi|84626237| >gi|84626235| >gi|84626233| >gi|84626231|>gi|84626229| >gi|84626227|>gi|84626225| >gi|84626223| >gi|84626221|>gi|84626219|>gi|84626217|>gi|84626215|>gi|84626213|>gi|84626212| >gi|84626210| >gi|84626208|>gi|84626206|>gi|84626204| >gi|84626202|>gi|84626200| >gi|84626198| >gi|84626196| >gi|84626194| >gi|84626192|>gi|84626190|>gi|84626188| >gi|84626186| >gi|84626184|>gi|84626182| )進(jìn)行比對(duì)如果構(gòu)建成功的條形碼序列與已發(fā)表的序列間存在差異，說(shuō)明該條形碼序列可以很好地將此品種與其他的猴頭菇品種區(qū)分開(kāi)。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取

提取的DNA采用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示所有樣本DNA均成功提取，見(jiàn)圖1。

圖1 DNA提取檢測(cè)

2.2 目的基因切膠回收

依據(jù)NCBI中猴頭菇β-tubulin基因的全長(zhǎng)設(shè)計(jì)的一對(duì)引物Betu-F1:ATGCGTGAAATCGTCCACC;Betu-R2:GAAGACGGGGGAAAGGAAC，用其對(duì)目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物采用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。所有樣本均成功擴(kuò)增，條帶大小約1.3kb，切膠回收電泳結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 目的基因切膠回收

2.3 陽(yáng)性鑒定

在藍(lán)白斑篩選的平板上挑取白色菌落，放入LB液體培養(yǎng)基內(nèi)搖菌，做菌液PCR，PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)篩選出陽(yáng)性菌。因?yàn)?，所需要的?yáng)性菌并非一次性檢出，所以實(shí)驗(yàn)過(guò)程中將每次檢測(cè)出的陽(yáng)性菌液均進(jìn)行保存，待實(shí)驗(yàn)結(jié)束后將所有檢測(cè)出的陽(yáng)性菌的菌液PCR產(chǎn)物集中電泳(見(jiàn)圖3)。

圖3 菌液陽(yáng)性鑒定

2.4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

應(yīng)用MEGA軟件對(duì)代表性序列進(jìn)行分析得出系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)圖(見(jiàn)圖4)，從圖片上可直觀看出猴頭菇RT9品種是一條獨(dú)立的分支，說(shuō)明RT9品種與其它猴頭菇品種間親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，構(gòu)建條形碼的成功率會(huì)增加。

圖4 系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)

注：圖1中2.3、2.4、2.5為猴99的代表性序列；4.1、4.2為野猴3的代表性序列；RT16-2、RT16-3為RT16的代表性序列；HAI1、HAI3為海猴的代表性序列；RT17-1、RT17-2為RT17的代表性序列；RT18-2、RT18-3為RT18的代表性序列；RT19-1、RT19-2為RT19的代表性序列；RT10-3、RT10-4為RT10的代表性序列；RT13-1、RT13-2為RT13的代表性序列；RT12-1、RT12-2為RT12的代表性序列；RT9-1、RT9-3為RT9的代表性序列；RT11-4、RT11-5為RT11的代表性序列；RT14-3、RT14-4為RT14的代表性序列；HOU4-1、HOU4-2為猴4的代表性序列；HA2、HA5為HA的代表性序列；HOU2、HOU3為猴的代表性序列；HOU5-1、HOU5-2為猴5的代表性序列；HOU9-2、HOU9-3為猴9的代表性序列。

2.5 多態(tài)性位點(diǎn)分析

將測(cè)序后的所有序列應(yīng)用BLAST、Clustal軟件篩查分析，得到每個(gè)品種具有代表性的序列，結(jié)合MEGA軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)(見(jiàn)圖4)。但是由于序列過(guò)多，導(dǎo)致分析多態(tài)性位點(diǎn)、設(shè)計(jì)特異性引物難度增加，為此，將系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)的每個(gè)大的分支的序列，應(yīng)用Clustal軟件分別進(jìn)行多重比對(duì)，每個(gè)分支的多重序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)附錄1，由于比對(duì)結(jié)果占篇幅龐大，附錄1中僅列出構(gòu)建成功的條形碼序列所在的分支的多重比對(duì)結(jié)果，根據(jù)多重比對(duì)的結(jié)果分析多態(tài)性位點(diǎn)，在此基礎(chǔ)上找出成功設(shè)計(jì)DNA條形碼的多態(tài)性位點(diǎn)(附錄1已標(biāo)明)，設(shè)計(jì)出每個(gè)品種特有的專(zhuān)屬條形碼引物。

2.6 條形碼驗(yàn)證

分析多態(tài)性位點(diǎn)設(shè)計(jì)出了幾十對(duì)用于構(gòu)建條形碼的引物，經(jīng)逐一驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，猴頭菇RT9的3個(gè)條形碼成功構(gòu)建(見(jiàn)圖5-a；5-b)，應(yīng)用這三條條形碼序列可以將RT9與猴頭菇的其他18個(gè)品種區(qū)分開(kāi)。對(duì)應(yīng)的3個(gè)引物為CRT9-3F1：CGGTACGAGGATCGCGCAAAC；CRT9-3R1GCGACCGTCTT

CCCACA；(擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為353bp)、CRT9-3F1：CGGTACGAGGATCGCGCAAAC；CRT9-3R2：GTGTCAAGTCGCAAAAAT(擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為483bp)、RT9-2F：TCCTCACACACACTGGTAC；RT9-2R：GTACGGATGTTGCAGTAG(擴(kuò)增序列長(zhǎng)度為723bp)，應(yīng)用這3對(duì)引物擴(kuò)增出的條形碼序列。

圖5-a DNA條形碼驗(yàn)證

圖5-b DNA條形碼驗(yàn)證

2.7 3個(gè)條形碼在整個(gè)猴頭菇品種中的適用性檢測(cè)

把上述已構(gòu)建成功的3個(gè)猴頭菇RT9的DNA條形碼序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已發(fā)表的含有猴頭菇β-tubulin基因的序列(序列登陸號(hào)見(jiàn)1.2.2)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)這3個(gè)條形碼序列與已發(fā)表的序列間存在差異，因此應(yīng)用這3個(gè)序列可以很好地將RT9與其它的猴頭菇品種區(qū)分開(kāi)，所以這3個(gè)序列可以作為鑒定猴頭菇RT9的專(zhuān)屬條形碼。

3 討論

3.1 構(gòu)建條形碼目標(biāo)基因的選擇

動(dòng)物中通常作為條形碼片段的基因?yàn)镃OI基因[5-6]，也是目前研究最為完善的。最初作為植物條形碼片段的基因?yàn)槿~綠體基因片段的rbcL和matK[25]，后來(lái)研究人員對(duì)高等植物、真菌、藻類(lèi)的大量ITS2序列進(jìn)行研究分析，結(jié)果顯示，ITS2在種級(jí)分辨上表現(xiàn)出很高的鑒定成功率。所以，建議以ITS2可以作為新的DNA條形碼，在鑒定綠色植物及部分真菌時(shí)使用[32-33]。

相比于動(dòng)物、植物，菌物DNA條形碼的研究及應(yīng)用起步較晚，目前為止也沒(méi)有明確作為菌物條形碼片段的基因，前人研究發(fā)現(xiàn)，β-tubulin基因在叢赤殼類(lèi)真菌的研究中表現(xiàn)出高的 PCR 和測(cè)序成功率，且沒(méi)有種間及種內(nèi)的交疊，在一些菌種鑒定過(guò)程中，β-tubulin基因表現(xiàn)出了ITS2還要高的鑒定成功率[30-31]，因此，本實(shí)驗(yàn)選擇了β-tubulin基因作為條形碼片段的目標(biāo)基因，并依據(jù)NCBI中猴頭菇β-tubulin基因的全長(zhǎng)設(shè)計(jì)了一對(duì)引物用于擴(kuò)增目的基因。

3.2 假陽(yáng)性分析

依據(jù)多態(tài)性位點(diǎn)合成的幾十對(duì)用于擴(kuò)增特異性條形碼的引物，在條形碼驗(yàn)證時(shí)僅有RT9的3個(gè)條形碼成功獲得，可能導(dǎo)致此結(jié)果的原因如下：①在測(cè)序時(shí)相關(guān)的堿基錯(cuò)讀或缺失，②菌液PCR過(guò)程中可能發(fā)生堿基錯(cuò)配等原因。

3.3 實(shí)驗(yàn)體系優(yōu)化

重組子鑒定過(guò)程中，開(kāi)始陽(yáng)性檢出率非常低，存在非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象，經(jīng)分析可能是如下原因：①可能實(shí)驗(yàn)體系存在問(wèn)題，如，Taq酶、T載體等的使用是否合適，②可能由于PCR的退火溫度過(guò)低，這樣雖然可以增加擴(kuò)增的產(chǎn)量，但引物和模板之間的錯(cuò)配現(xiàn)象也會(huì)相應(yīng)增加，就會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。改進(jìn)措施如下：①將實(shí)驗(yàn)原來(lái)用的生工的T載體更換為大連寶生物的pGEM-T載體。②將最初使用的Taq酶(上海生工)更換為r-Taq酶(大連寶生物)。③通過(guò)提高PCR的退火溫度，由原來(lái)的55℃增至60℃。實(shí)驗(yàn)體系經(jīng)上述優(yōu)化后，陽(yáng)性檢出率低、非特異性擴(kuò)增的現(xiàn)象均有所改進(jìn)。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用分子生物學(xué)的研究手段，成功構(gòu)建出猴頭菇RT9品種的3個(gè)條形碼。經(jīng)驗(yàn)證表明，這3個(gè)特異性條形碼在所有猴頭菇品種中均適用。因此，DNA條形碼技術(shù)在菌物的鑒定中應(yīng)用切實(shí)可行。

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ConstructionandVerificationofDNABarcodeforHericiumerinaceus

Huangfu Yongguan1, Yan Baosong2, Zhang Yuexin2, Zong Xianchun3

(1.Northeast Forestry University/Saline and alkaline land resources and Environment Research Center,Harbin 150040;2.Heilongjiang Forest Products Research Institute,Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Non-wood Forest Product Development，Mudanjiang， Heilongjiang 157011;3.Mudanjiang Normal University/College of life science and technology,Mudanjiang 157000)

2017-05-06

林業(yè)公益性行業(yè)科研專(zhuān)項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(201404703-3)

皇甫永冠(1990-)，女，博士，從事植物抗逆基因與逆境脅迫應(yīng)答的分子機(jī)理研究，E-mail:595287087@qq.com.

S759.81

A

DOI.:10.13268/j.cnki.fbsic.2017.05.003