李英杰， 尹麗娟， 高立娣， 呂仁江， 劉樹仁， 王 寧， 崔麗燕

(齊齊哈爾大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006)

毛細(xì)管電色譜(CEC)是一種高效、快速的微分離技術(shù)，該方法結(jié)合高效液相色譜(HPLC)的高選擇性和毛細(xì)管電泳(CE)的高效性，近幾年得到了廣泛的關(guān)注[1 - 2]。CEC中使用最廣泛的手性固定相為β-環(huán)糊精(β-CD)及其衍生物[3]。由于天然β-CD受到鍵合能力和水溶性等物理化學(xué)性能的限制，使其在手性分離上有一定的局限性。然而，對β-CD進(jìn)行化學(xué)修飾，通過在其原有結(jié)構(gòu)上引入新的基團(tuán)，可以改善其水溶性并增強(qiáng)對手性化合物的拆分能力[4]。因此，β-CD及其衍生物被廣泛應(yīng)用于分離領(lǐng)域[5 - 7]。近年來，改性β-CD電色譜整體柱成為研究熱點(diǎn)，其優(yōu)點(diǎn)在于制備方法簡單、柱效高、柱子牢固穩(wěn)定，結(jié)合CEC的高分離效率、分析速度快、檢測靈敏度高和應(yīng)用范圍廣泛等特點(diǎn)，特別適合于高沸點(diǎn)、大分子、強(qiáng)極性和熱穩(wěn)定性差的化合物的分離分析[8 - 9]。

納米金屬氧化物具備比表面積大、易于改性、生物相容性好等特點(diǎn)，在制備色譜分離介質(zhì)方面已經(jīng)顯出強(qiáng)大的優(yōu)勢[10 - 12]。其中，Cu2O不僅具有納米材料的優(yōu)點(diǎn)，而且其結(jié)構(gòu)內(nèi)部還有用來容納一定尺寸大小分子的空間[13]，這種特有的內(nèi)部空間會協(xié)同β-環(huán)糊精改善分離性質(zhì)。本文制備了烯丙胺-β-環(huán)糊精/Cu2O(Ally-β-CD/Cu2O)毛細(xì)管電色譜整體柱，其機(jī)械強(qiáng)度高，通透性好，骨架分布均勻,柱效高，是一種性能較好的雜化整體柱。毛細(xì)管電色譜中有機(jī)-無機(jī)雜化整體柱比無機(jī)硅膠整體柱和有機(jī)聚合物整體柱更優(yōu)越，更具發(fā)展前景。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

HP3DCE型毛細(xì)管電泳儀(美國，安捷倫公司)；P200Ⅱ型高壓恒流泵(大連依利特分析儀器公司)；D8型X-射線衍射儀(XRD)(德國，Bruker-axs公司)；250X型X-射線光電子譜儀(XPS)(美國，Thermo公司)；S-4300型掃描電子顯微鏡(SEM)(日本，日立公司)；Nicolet 380型傅立葉紅外光譜儀(美國，熱電公司)。

甲基丙烯酸-三甲基硅烷丙酯(γ-MAPS)、乙二醇二甲基丙烯酸酯(EDMA)、甲基丙烯酸縮水甘油酯(GMA)(上海阿拉丁試劑公司)；偶氮二異丁腈(AIBN)和2-丙烯酰胺基-2-甲基-1-丙磺酸(AMPS)(美國Flake公司)；二甲基亞砜(DMSO)、正十二醇(分析純，天津科密歐試劑公司)；對甲苯磺酰氯、烯丙胺(分析純，上海阿拉丁試劑公司)；3-(異丁烯酰氧)丙基三甲基硅烷(KH570)(分析純，上海阿拉丁試劑公司)；D，L-組氨酸(生化試劑，上海阿拉丁試劑公司)；鹽酸克倫特羅標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢定所)。實(shí)驗(yàn)用水均為超純水。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1環(huán)糊精衍生物的制備兩步合成烯丙胺-β-環(huán)糊精(Ally-β-CD)。首先，制備磺?；?β-環(huán)糊精(6-OTs-β-CD)[14]：β-CD 5.13 g溶于3.05 g NaOH溶液中，加入對甲苯磺酰氯1.68 g，冷水浴攪拌5 h。反應(yīng)結(jié)束后過濾，濾液調(diào)節(jié)pH至6～7，得到白色沉淀。50 ℃真空干燥8 h，得到6-OTs-β-CD。Ally-β-CD[15]合成：稱取1.97 g 6-OTs-β-CD與50 mL烯丙胺混合溶液在70 ℃水浴中反應(yīng)8 h。產(chǎn)生的黃色溶液冷卻至室溫，加入30 mL甲醇稀釋，加入沉淀劑乙腈得到白色沉淀。50 ℃真空干燥12 h，得到Ally-β-CD。

合成Ally-β-CD/Cu2O[16]過程如下：0.1 mol/L 50 mL CuSO4·5H2O與0.1 mol/L 100 mL NaOH溶液混合，機(jī)械攪拌，劇烈攪拌的情況下加入1.97 g Ally-β-CD/(100 mL)丙酮溶液以及3 mL N2H4溶液，攪拌2 h，待反應(yīng)結(jié)束后離心15 min，得到紅棕色沉淀，50 ℃真空干燥24 h，獲得Ally-β-CD/Cu2O。

1.2.2整體柱的制備將35 cm的毛細(xì)管分別用1 mol/L HCl沖洗30 min、水沖洗30 min、1 mol/L NaOH溶液沖洗1 h，兩端封口反應(yīng)6 h，水沖洗30 min，甲醇沖洗20 min，再用N2吹干。將VKH570∶V丙酮=1∶1注入毛細(xì)管中兩端封口，室溫反應(yīng)24 h。甲醇沖洗，氮?dú)獯蹈?，備用?/p>

稱取GMA 0.1500 g，EDMA 0.1000 g，環(huán)己醇0.1000 g， 正十二醇0.2200 g，AIBN 0.0018 g，AMPS 0.0016 g和Ally-β-CD/Cu2O 0.0500 g，以及2 mL DMSO，超聲混勻。將混合物填充入預(yù)處理過的毛細(xì)管中，填料部分26.0 cm。兩端封口，50 ℃水浴反應(yīng)14 h后，依次用甲醇和超純水沖洗。

1.3 色譜條件

流動相：5 mmol/L NaH2PO4(pH=8.50)，柱溫：20 ℃，工作電壓：10 kV，正極進(jìn)樣：10 kV×5 s，檢測波長：200 nm

2 結(jié)果與討論

2.1 合成衍生物紅外光譜分析

圖1 環(huán)糊精衍生的紅外光譜圖Fig.1 Infrared spectra of cyclodextrin derivatives a.β -CD;b.6-OTs-β -CD;c.Ally-β -CD;d.Ally-β -CD/Cu2O.

為了確定β-CD衍生物合成是否成功，采用紅外光譜進(jìn)行分析，其結(jié)果如圖1。圖中曲線(b)與(a)相比，保持了β-CD的特征吸收，又引入了1 365 cm-1處的S=O 雙鍵伸縮振動吸收峰，以及845 cm-1處的 C-H 伸縮振動吸收峰。存在S=O雙鍵伸縮振動吸收峰，確定衍生物為6-OTs-β-CD;曲線(b)與(c)相比，引入了1 080 cm-1C-N鍵伸縮振動吸收峰及1 571 cm-1處的N-H伸縮振動吸收峰，確定合成的衍生物為Ally-β-CD。曲線(c)與(d)相比，引入了691 cm-1的Cu-N 鍵的伸縮振動吸收峰及638 cm-1的Cu(Ⅰ)-O伸縮振動吸收峰，確定合成的衍生物為Ally-β-CD/Cu2O。

2.2 整體柱制備條件優(yōu)化

2.2.1功能單體比例的優(yōu)化以Ally-β-CD/Cu2O和GMA作為功能單體，當(dāng)m(Ally-β-CD/Cu2O)∶m(GMA)=0.0500 g∶0.0900 g時，所得的整體柱在高壓恒流泵壓力為 20 MPa 時，用甲醇沖洗整體柱，流速為20 μL/min(未鍵合的空毛細(xì)管柱同壓下流速為35 μL/min)，柱子通透性較好，柱內(nèi)固定相的機(jī)械強(qiáng)度達(dá)到最佳。

2.2.2聚合溫度的優(yōu)化依據(jù)原位聚合反應(yīng)機(jī)理的闡述[16]，溫度影響引發(fā)劑在聚合反應(yīng)中的分解速度，從而影響固定相的孔徑大小及機(jī)械強(qiáng)度。考察了反應(yīng)溫度為20、30、40、50、60 ℃的整體柱內(nèi)鍵合的不同情況。在高壓恒流泵壓力為 20 MPa 時，20 ℃ 條件下，甲醇流速為 30 μL/min 近似空柱，表明柱內(nèi)孔徑過大，聚合物脫離柱壁；而 60 ℃時，流速僅為10 μL/min，柱內(nèi)聚合物質(zhì)地致密。聚合反應(yīng)溫度在 50 ℃時，甲醇流速為 20 μL/min，柱內(nèi)孔徑大小適中、通透性好。因此確定制備整體柱的聚合溫度為50 ℃。

2.2.3聚合時間的優(yōu)化聚合時間對整體柱內(nèi)固定相的鍵合情況有重要的影響。聚合時間少，固定相鍵合情況不佳，溶質(zhì)的保留較小；聚合時間過長時，溶質(zhì)的保留較大，柱內(nèi)固定相過于致密，柱子的通透性下降，考察了8、10、12、13、14、15、16 h不同聚合時間。實(shí)驗(yàn)表明，聚合時間在8 h，甲醇流速為30 μL/min，近似空柱，顯微鏡下觀察沒有聚合；聚合時間在 14 h時，甲醇流速為 20 μL/min左右，柱子的通透性好，固定相鍵合情況良好。因此確定制備整體柱的聚合時間為14 h。

2.3 毛細(xì)管電色譜整體柱柱內(nèi)固定相的表征

2.3.1整體柱的掃描電鏡表征運(yùn)用掃描電鏡(SEM)觀察了整體柱固定相的形貌，如圖2所示。圖2a為整體柱柱內(nèi)固定相的截面圖，從圖中可以看出整體柱內(nèi)部顆粒鍵合緊密，分布均勻，互穿成網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，有較大的孔徑，使毛細(xì)管整體柱具有良好的通透性。圖2b為整體柱柱內(nèi)固定相的局部截面圖，從圖中可以看出整體柱內(nèi)固定相與毛細(xì)管內(nèi)壁鍵合緊密，增加了整體柱的機(jī)械強(qiáng)度，使之能夠承受較大的柱壓。

圖2 整體柱固定相掃描電鏡(SEM)圖 Fig.2 SEM images of stationary phase in monolithic column a.cross-section,b.a part of cross-section.

圖3 柱內(nèi)固定相 X-射線光電子能譜(XPS)Fig.3 X-ray photoelectron spectroscopy(XPS)

2.3.2X-射線光電子能譜表征圖3為制備的整體柱固定相的X-射線光電子能譜(XPS)表征，圖3a為整體柱內(nèi)固定相的全譜表征，通過XPS全譜可以表明整體柱柱內(nèi)固定相中含有C、O、Si、Cu 4 種元素。圖3b為C1s X-射線能譜表征圖，以C1s能譜為標(biāo)準(zhǔn)，圖3c為Cu的2p X-射線能譜表征圖，圖中表明Cu信號在932.6和952.2 eV，分別為Cu的2p3和銅的2p1X-射線能譜峰，通過與XPS標(biāo)準(zhǔn)譜圖對比與Cu2O中Cu的2p軌道能譜峰相符。圖3d為O1s X-射線能譜表征圖，與Cu2O中的O的結(jié)合能相符，因此可以證明制備的整體柱內(nèi)存在Cu2O。

2.3.3X-射線衍射表征通過對整體柱內(nèi)固定相的XPS表征圖3C中可以看出在932.6 eV處有Cu信號出現(xiàn)，表明存在Cu 或Cu2O物質(zhì)[17]。因?yàn)镃u 2p3/2 XPS不能分出Cu和Cu2O之間區(qū)別。使用X-射線衍射(XRD)來確認(rèn)Cu(Ⅰ)的存在。對整體柱內(nèi)固定相進(jìn)行XRD表征，從圖4中可以看出沒有出現(xiàn)Cu的特征衍射峰，Cu(Ⅰ)出現(xiàn)衍射峰值同國際標(biāo)準(zhǔn)卡片(05-0667)衍射特征峰值相同，證明整體柱內(nèi)固定相中含有Cu2O。

2.4 整體柱的性能研究

以5 mmol/L NaH2PO4溶液(pH=8.50)為緩沖溶液，在分離電壓為10 kV，柱溫為20 ℃，檢測波長為200 nm的毛細(xì)管電色譜條件下，以硫脲為中性標(biāo)記物連續(xù)5次重復(fù)進(jìn)樣測定，計(jì)算其保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.7%，柱效達(dá)到47 658N/m。同時應(yīng)用于分離組氨酸(D,L構(gòu)型通過單獨(dú)分析L型氨基酸進(jìn)行定性)，由圖5可以看出組氨酸的分離度Rs達(dá)到3.82，組氨酸的單一對映體保留時間(ta,tb)的RSD分別為1.31%，0.79%。說明該整體柱具有手性分離能力。該柱在連續(xù)使用 72 h 或間歇使用2個月后仍具有良好的分離能力，表明該整體柱具有較好的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性。

圖4 柱內(nèi)固定相X-射線衍射(XRD)圖Fig.4 XRD of Tungesten oxide

圖5 D,L-組氨酸電色譜分離圖Fig.5 Electrochromatographic spectrum of D,L-histidine

2.5 整體柱的應(yīng)用

圖6 鹽酸克倫特羅電色譜分離圖Fig.6 Electrochromatographic spectrum of Clenbuterol

鹽酸克倫特羅屬于β-腎上腺素類興奮劑,在臨床上用于治療慢性阻塞性肺疾和支氣管哮喘等疾病[18]。β-腎上腺素類興奮劑大多數(shù)為手性對映體，研究表明具有藥效的一般為左旋體，右旋體活性較低甚至有毒性，為了能夠安全準(zhǔn)確用藥，快速高效地拆分藥物對映體的要求日益變得迫切。利用制備的Ally-β-CD/Cu2O毛細(xì)管電色譜整體柱，對鹽酸克倫特羅對映體進(jìn)行手性分離，其電色譜圖如圖6。在最佳電色譜條件下，鹽酸克倫特羅對映體達(dá)到了基線分離。

3 結(jié)論

本文制備了以β-CDs復(fù)合材料為固定相的新型毛細(xì)管電色譜整體柱，并確定了最佳制柱條件：功能單體Ally-β-CD/Cu2O與GMA物質(zhì)的質(zhì)量之比為0.05 g∶0.09 g，水浴溫度50 ℃，聚合時間14 h。通過掃描電鏡可以看出整體柱內(nèi)固定相顆粒鍵合緊密，分布均勻，有較大孔徑，互穿成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，與柱壁鍵合緊密。測定該整體柱的理論塔板數(shù)達(dá)47 658N/m，對D,L-組氨酸對映體的分離度達(dá)RS到3.82。并對鹽酸克倫特羅對映體進(jìn)行了拆分,達(dá)到基線分離，分離度Rs為2.89。