王圣潔 王勝坤 林彩麗 于少帥 汪來(lái)發(fā) 樸春根 郭民偉 田國(guó)忠

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所 國(guó)家林業(yè)局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091; 2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所 廣州 510520)

以tuf基因?yàn)榘袠?biāo)的5種16SrⅠ組植原體環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)*

王圣潔1王勝坤2林彩麗1于少帥1汪來(lái)發(fā)1樸春根1郭民偉1田國(guó)忠1

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所 國(guó)家林業(yè)局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091; 2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所 廣州 510520)

【目的】 建立一種能夠特異性檢測(cè)和鑒定16SrⅠ組植原體的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，實(shí)現(xiàn)16SrⅠ組植原體的快速檢測(cè)?！痉椒ā?以植原體tuf基因作為靶標(biāo)，通過(guò)序列比對(duì)，設(shè)計(jì)多組具有特異性的LAMP引物組，篩選出一套適用于16SrⅠ組植原體的特異性檢測(cè)體系。以16SrⅡ組、16SrⅤ組、16SrⅩⅨ組植原體樣品按照此檢測(cè)體系進(jìn)行反應(yīng)，來(lái)驗(yàn)證其特異性； 同時(shí)將稀釋后的感病組織樣品同步進(jìn)行PCR和LAMP檢測(cè)，以確定其檢測(cè)靈敏度。對(duì)來(lái)自不同省市的6份田間樣品以及9份組培樣品進(jìn)行檢測(cè)，以驗(yàn)證其檢測(cè)的穩(wěn)定性?！窘Y(jié)果】 16SrⅠ-LAMP在恒溫63 ℃條件下40 min內(nèi)完成擴(kuò)增，能檢測(cè)5種分別引起泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑樹萎縮、萵苣黃化和長(zhǎng)春花綠變病的16SrⅠ組植原體，不能檢測(cè)其他組植原體包括16SrⅡ組的花生叢枝、甘薯叢枝、臭矢菜叢枝、16SrⅤ組的棗瘋病、紅花槐叢枝、櫻桃致死黃化和16SrⅩⅨ組的板栗黃化皺縮植原體。通過(guò)在反應(yīng)液中加入鈣黃綠素肉眼判斷綠色為陽(yáng)性結(jié)果，褐色為陰性結(jié)果，與用熒光定量設(shè)備進(jìn)行判讀擴(kuò)增曲線的結(jié)果一致。相比于PCR檢測(cè)，16SrⅠ-LAMP檢測(cè)的靈敏度提高了8倍； 16SrⅠ-LAMP能夠快速檢測(cè)出來(lái)自不同區(qū)域的田間泡桐發(fā)病樣品、感病泡桐組培苗和嫁接傳病脫毒苗?！窘Y(jié)論】 以tuf基因作為靶標(biāo)，建立能同時(shí)檢測(cè)5種16SrⅠ組植原體的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，具有高效、特異、操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)時(shí)間短及成本較低等優(yōu)點(diǎn)，適合于基層和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。

植原體； 環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增；tuf基因； 快速檢測(cè)

Abstract： 【Objective】 The purpose of this study is to develop an isothermalmethod known as loop-mediated isothermal amplification (LAMP) for detection of 16SrⅠ group phytoplasmas. The method would make it possible to achieve simple and rapid detection of this pathogen.【Method】 In present study, several sets of LAMP primers were designed using thetufgene as the target, and then the most appropriate set was selected to develop LAMPmethod for detection of 16SrⅠ group phytoplasmas. The specificity of LAMP was tested by using 3 other groups of phytoplasma (16SrⅡ, 16SrⅤ, 16SrⅩⅨ) which are closely related to 16SrⅠ group. The sensitivities between LAMP and PCR for detecting phytoplasma were compared by using two-fold serially diluted DNA extracted from phytoplasma-infected paulownia as templates. The LAMP method was used to detect the paulownia witches’-broom phytoplasmas from 6 provinces in China and 9 kinds of tissue culture seedlings.【Result】 The 16SrⅠ-LAMP was efficiently amplified with the targettufgene sequences in 40 min at constant temperature of 63 ℃, by which five 16SrⅠ group phytoplasmas causing paulownia witches’-broom, chinaberry witches’-broom, mulberry dwarf, lettuce yellows and periwinkle phyllody diseases were detected, but no phytoplasmas from 16SrⅡ (peanut witches’-broom, sweet potato witches’-broom, cleome witches’-broom), 16SrⅤ (jujube witches’-broom, cherry lethal yellows,Bischofiapolycarpawitches’-broom,Robiniahispidawitches’-broom), and 16SrⅩⅨ (chestnut yellows crinkle) as well as healthy plant control were detected. The result of LAMP were observed by the color changes of reaction solution added to calcein, the reaction solution was green for positive samples and orange for negative ones, which were in agreement with the result by detecting amplification curve through the fluorescent quantitation device. Compared with conventional PCR amplification, the detection sensitivity of 16SrⅠ-LAMP was 8-fold higher. The PaWB samples collected from different regions and different graft-inoculted tissue culture seedlings could be detected correctly with corresponding LAMP assay.【Conclusion】 This is the first report of application of the LAMP assay technique for the simple，efficient，and specific detection of 16SrⅠ group phytoplasmas targeting on phytoplasmatufgene. suitable for grass-roots and field testing and for the rapid diagnosis of phytoplasma associated diseases.

Keywords： phytoplasma； loop mediated isothermal amplification(LAMP)；tufgene； rapid detection

植原體(phytoplasma，原稱mycoplasma-like organism)，是一類無(wú)細(xì)胞壁的原核生物，此類病害具有分布范圍廣、傳播速度快、致病力強(qiáng)、染病植物難以治愈等特點(diǎn)(McCoyetal., 1979)。該病原在全世界范圍內(nèi)引起了許多重要的糧食作物、蔬菜、觀賞植物和果樹等經(jīng)濟(jì)林木的嚴(yán)重病害(Firraoetal., 2004)，如由16SrⅣ組植原體引起的椰子(Cocosnucifera)致死黃化病，因其很難治愈和快速致死椰樹而影響到全球的椰子生產(chǎn)(Bertaccinietal., 2014)；由16SrⅤ組植原體引起的葡萄(Vitisvinifera)黃化病，在法國(guó)西南部發(fā)生，造成該地區(qū)80%葡萄感病，產(chǎn)量減少20%～30%(Magarey， 1986)；由16SrⅩ組植原體引起的蘋果叢簇病，在歐洲的蘋果(Malussieversii)林中暴發(fā)，造成果實(shí)減小、質(zhì)量減輕，影響蘋果的質(zhì)量和商品價(jià)值，給德國(guó)和意大利等國(guó)的蘋果生產(chǎn)造成嚴(yán)重?fù)p失(Strauss， 2009)。植原體種類多樣，根據(jù)國(guó)際比較菌原體研究組(international research programme on comparative mycoplasmology,IRPCM)基于16SrRNA基因序列RFLP的分類規(guī)則，目前已報(bào)道植原體有30余組(Zhaoetal., 2016)，而且每個(gè)組內(nèi)又劃分為許多亞組，其中翠菊(Callistephuschinensis)黃化組植原體(16SrⅠ組)，無(wú)論從種類、多樣性還是傳播范圍上來(lái)看都是分布最廣和危害最嚴(yán)重的。Lee等(2004)將翠菊黃化組植原體分成了16SrⅠ-A亞組的翠菊黃化、番茄(Lycopersiconesculentum)巨芽、洋蔥(Alliumcepa)黃化，16SrⅠ-B亞組的萵苣(Lactucasativa)黃化、桑(Morusalba)萎縮、繡球花(Hydrangeamacrophylla)變?nèi)~，16SrⅠ-C亞組的橄欖(Canariumalbum)叢枝、三葉草(Trifoliumrepens)變?nèi)~、草莓(Fragaria×ananassa)綠瓣，16SrⅠ-D亞組的泡桐(Paulowniaspp.)叢枝，16SrⅠ-E亞組的藍(lán)莓(Vacciniumangustifolium)萎縮等15個(gè)亞組，其中在我國(guó)發(fā)生和危害比較嚴(yán)重的該組植原體包括泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑樹萎縮、萵苣黃化以及長(zhǎng)春花(Catharanthus)綠變等。此外，16SrⅡ組植原體引起的花生(Arachis)叢枝、甘薯(Dioscoreaesculenta)叢枝和臭矢菜(Cleomeviscosa)叢枝， 16SrV組植原體引起的棗瘋病、槐樹(Sophora)叢枝病、櫻桃(Cerasuspseudocerasus)致死黃化以及重陽(yáng)木(Bischofiapolycarpa)叢枝等也發(fā)生比較嚴(yán)重， 這些植原體病害給我國(guó)林業(yè)及農(nóng)業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(賴帆等, 2008)。2013年國(guó)家林業(yè)局把泡桐叢枝病和棗瘋病列入了全國(guó)林業(yè)危險(xiǎn)性有害生物名單。由于植原體尚不能實(shí)現(xiàn)體外培養(yǎng)，針對(duì)該類病害的高度抗性品種又很難獲得，實(shí)際生產(chǎn)中該類病害的防治措施主要依靠清除染病的植株、杜絕侵染來(lái)源、綜合治理媒介昆蟲以切斷傳播途徑等措施。因此，建立快速、高效、簡(jiǎn)便的植原體檢測(cè)技術(shù)，有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)病原和感病植物，提前采取控制措施，對(duì)該類病害防治具有重要意義(耿顯勝等, 2015)。

植原體的檢測(cè)，早期主要依靠生物學(xué)、電鏡觀察、抗生素試驗(yàn)相結(jié)合的傳統(tǒng)方法進(jìn)行，這些方法耗時(shí)長(zhǎng)，檢測(cè)靈敏度也不高，而且檢測(cè)結(jié)果還容易被其他因素干擾(朱澂等, 1991)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，基于酶聯(lián)免疫反應(yīng)、核酸雜交以及PCR技術(shù)的檢測(cè)方法相繼建立，檢測(cè)的靈敏度和準(zhǔn)確性不斷提高(蘭平等, 2001; 廖曉蘭等, 2002)，但是這些方法往往需要精密的變溫設(shè)備以及復(fù)雜的分析儀器，且操作程序復(fù)雜，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)，對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)水平及熟練程度要求較高，大大限制了此類診斷方法的使用和推廣。環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)是Notomi等(2000)開(kāi)發(fā)的一種恒溫核酸擴(kuò)增方法，是一種新型的分子診斷方法。該方法具有特異性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單、不需要復(fù)雜的儀器、檢測(cè)周期短和結(jié)果可視化的特點(diǎn)，非常適合作為基層和現(xiàn)場(chǎng)的病害診斷方法進(jìn)行推廣使用。自該技術(shù)建立以來(lái)，已經(jīng)廣泛地應(yīng)用到真菌、細(xì)菌、病毒等病原菌的檢測(cè)中(戴婷婷等, 2016; 張永江等, 2016; 賈雅菁等, 2016)，其中也包括一些針對(duì)植原體的LAMP檢測(cè)技術(shù)，如Tomlison等(2010)以16S—23S間隔區(qū)作為靶標(biāo)建立了翠菊黃化、草莓綠瓣、三葉草變?nèi)~、杏(Armeniaca)褪綠卷葉和圣保羅島椰子枯萎病植原體的LAMP檢測(cè)方法;Bekele等(2011)以IGS和23S作為靶標(biāo)序列建立了番木瓜(Carica)黃化和銀膠菊(Parthenium)叢枝植原體的LAPMP檢測(cè)方法;Nair等(2016)以16SrRNA基因作為靶標(biāo)建立了引起椰子根枯萎和檳榔(Areca)葉黃化植原體的LAMP檢測(cè)體系。

目前,針對(duì)我國(guó)發(fā)生普遍的植原體所建立的LAMP檢測(cè)技術(shù)報(bào)道較少，僅見(jiàn)韓劍等(2015)用16SrRNA基因作為靶標(biāo)設(shè)計(jì)引物開(kāi)展的LAMP可視化檢測(cè)棗瘋病植原體的研究；而針對(duì)我國(guó)發(fā)生普遍而嚴(yán)重的16SrⅠ組植原體引起的泡桐叢枝、苦楝叢枝等病害的快速檢測(cè)技術(shù)尚未見(jiàn)報(bào)道。因此本研究以蛋白延伸因子EF-Tu編碼基因(tuf)作為靶標(biāo)基因設(shè)計(jì)LAMP引物，針對(duì)泡桐叢枝、苦楝叢枝等16SrⅠ組植原體，建立了16SrⅠ-LAMP檢測(cè)技術(shù)，以期為16SrⅠ組植原體的田間快速精準(zhǔn)診斷、植物繁殖材料的帶菌檢測(cè)以及病害的精準(zhǔn)高效檢疫和防控提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1材料與試劑

試驗(yàn)所使用的植原體感染材料及其健康對(duì)照，采集自我國(guó)不同地區(qū)，其編號(hào)及分類信息詳見(jiàn)表1。CTAB法植物基因組DNA快速提取試劑盒(DN14)購(gòu)自北京艾德萊生物科技有限公司；恒溫核酸擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自廣州迪澳生物科技有限公司； 2 × PCR預(yù)混液購(gòu)自博邁德生物科技有限公司。

NanoDrop2000超微量分光光度計(jì)為賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；Rotor-Gene3000熒光定量PCR儀為澳大利亞Corbett公司產(chǎn)品；朗基A300 PCR儀為杭州朗基科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋為上海亞榮生化儀器產(chǎn)品。

表1 植原體病害及健康對(duì)照樣品信息①Tab.1 Information of phytoplasma disease and healthy plant samples

① PaWB： 泡桐叢枝Paulownia witches’-broom； PH： 健康泡桐Healthy Paulownia； CWB： 苦楝叢枝Chinaberry witches’-broom； CH： 健康苦楝Healthy chinaberry； MD： 桑樹萎縮Mulberry dwarf； MH： 健康桑樹Healthy mulberry； LY： 萵苣黃化 Lettuce yellows； LH： 健康萵苣Healthy lettuce； PePWB： 長(zhǎng)春花綠變Periwinkle phyllody； PeH： 健康長(zhǎng)春花Healthy periwinkle； PnWB： 花生叢枝Peanut witches’-broom； PnH： 健康花生Healthy peanu； SpWB： 甘薯叢枝Sweet potato witches’-broom； SpH： 健康甘薯Healthy sweet potato； ClWB： 臭矢菜叢枝Cleome witches’-broom； ClH： 健康臭矢菜Healthy cleome； JWB： 棗瘋病Jujube witches’-broom； JH： 健康棗樹Healthy jujube； BiWB： 重陽(yáng)木叢枝Bischofiapolycarpawitches’-broom； BiH健康重陽(yáng)木HealthyBischofiapolycarpa； CeLY： 櫻桃致死黃化Cherry lethal yellows； CeH： 健康櫻桃Healthy cherry； RoWB： 紅花槐叢枝Robiniahispidawitches’-broom； RoH： 健康槐樹HealthyRobiniahispida； CnYC： 板栗黃化皺縮Chestnut yellows crinkle； CnH健康板栗Healthy chestnut.下同The same below.

1.2植物總DNA提取與PCR擴(kuò)增檢測(cè)

稱取1～2 g新鮮植物材料，液氮冷凍并充分研磨，取0.10 g研磨后的粉末，參照CTAB法植物基因組DNA快速提取試劑盒(DN14)說(shuō)明書提取總DNA，提取的總DNA -20 ℃保存?zhèn)溆谩＠弥苍w通用引物R16mF2/R16mR1(Gundersenetal.,1996)對(duì)提取的植物總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件參考李永等(2005)的方法進(jìn)行。25 μL擴(kuò)增反應(yīng)體系中含有制備的DNA模板1 μL，正反向引物各0.5 μL(10 μmol·L-1)，2 × PCR預(yù)混液(0.05 U·μL-1TaqDNA 聚合酶, 4 mmol·L-1MgCl2和 0.4 mmol·L-1dNTPs)12.5 μL，ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件： 94 ℃ 5 min； 94 ℃ 45 s, 52 ℃ 45 s, 72 ℃ 1 min, 共35個(gè)循環(huán)； 72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.316SrⅠ-LAMP檢測(cè)體系的建立

1.3.1 LAMP引物的設(shè)計(jì)與合成 在GeneBank中下載不同組植原體tuf基因的核酸序列，利用DNAMAN軟件對(duì)上述序列進(jìn)行比較及相似性比對(duì)，找出不同組植原體的基因差異位點(diǎn)和高度保守區(qū)域，使用榮研公司的LAMP引物在線設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer V4，按照LAMP引物篩選原則，針對(duì)16SrⅠ組植原體tuf基因的保守序列，設(shè)計(jì)多套LAMP引物，從中篩選出一套特異性好的引物(表2)。LAMP擴(kuò)增的引物包括正向外引物F3、反向外引物B3、正向內(nèi)引物FIP(FIC+F2)、反向內(nèi)引物BIP(BIC+B2)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司按照HPLC純度級(jí)別合成。

表2 LAMP引物序列及PCR擴(kuò)增引物序列Tab.2 The primers used for loop-mediated isothermal amplification and PCR

1.3.2 LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的體系與條件 參考廣州迪澳生物科技有限公司所提供的恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒，建立植原體16SrⅠ-LAMP擴(kuò)增體系，并以試劑盒所提供的陽(yáng)性和陰性標(biāo)樣做對(duì)照。

16SrⅠ-LAMP擴(kuò)增體系為： 總體積45 μL，包含有10 μmol·L-1PaWB-F3 0.5 μL、10 μmol·L-1PaWB-B3 0.5 μL，40 μmol·L-1PaWB-FIP 1 μL、40 μmol·L-1PaWB-BIP 1 μL，LAMP反應(yīng)液RM(2×)12.5 μL，8 U·μL-1BstDNA聚合酶1 μL，熒光染料10×SYBR Green Ⅰ 0.5 μL，待測(cè)樣品DNA 0.5 μL，用超純水補(bǔ)齊到25 μL，同時(shí)加入20 μL密封液。反應(yīng)條件為： 將配制好的反應(yīng)管混勻后離心，置于63 ℃恒溫反應(yīng)60 min，80 ℃滅活5 min。

1.3.3 LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的判斷方法LAMP 反應(yīng)結(jié)束后，采用2種方法鑒別陽(yáng)性LAMP擴(kuò)增結(jié)果： 1) 將擴(kuò)增反應(yīng)管置于恒溫?zé)晒鈾z測(cè)儀或熒光PCR儀中，實(shí)時(shí)讀取熒光信號(hào)，如果出現(xiàn)“S”形擴(kuò)增曲線則判定為陽(yáng)性，即待測(cè)樣品中含有植原體； 如果無(wú)“S”形擴(kuò)增曲線則判定為陰性，即待測(cè)樣品中無(wú)植原體； 2) 在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入1 μL顯色液(鈣黃綠素-氯化錳溶液)，在日光下肉眼觀察顏色變化， 如果擴(kuò)增產(chǎn)物變?yōu)榇渚G色則判定為陽(yáng)性，即待測(cè)樣品中含有植原體； 如果擴(kuò)增產(chǎn)物仍為橘黃色則判定為陰性，即待測(cè)樣品中無(wú)植原體。

1.416SrⅠ-LAMP檢測(cè)體系的特異性驗(yàn)證

應(yīng)用建立的16SrⅠ-LAMP檢測(cè)體系對(duì)收集的我國(guó)不同地區(qū)發(fā)生的不同16Sr組植原體病害進(jìn)行特異性驗(yàn)證。供試的樣品包括16SrⅠ組： 泡桐叢枝、苦楝叢枝、桑樹萎縮病、長(zhǎng)春花綠變和萵苣黃化的發(fā)病與健康組織樣品(于少帥， 2016)； 16Sr Ⅱ組： 花生叢枝、甘薯叢枝和臭矢菜叢枝的發(fā)病與健康組織樣品； 16SrⅤ組： 棗瘋病、重陽(yáng)木叢枝、紫花槐(Sophorajaponicavar.violacea)叢枝和櫻桃致死黃化的發(fā)病與健康組織樣品和白杜的發(fā)病組織樣品。提取各樣品基因組DNA進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后觀察LAMP反應(yīng)結(jié)果。試驗(yàn)至少重復(fù)3次。

1.516SⅠ-LAMP檢測(cè)體系的靈敏度試驗(yàn)

利用本實(shí)驗(yàn)室組培保存的泡桐叢枝組培苗作為標(biāo)準(zhǔn)樣品提取基因組DNA，測(cè)定基因組DNA濃度后，用滅菌的ddH2O按2倍梯度進(jìn)行稀釋。隨后以稀釋后的稀釋液作為模板，同時(shí)進(jìn)行LAMP擴(kuò)增反應(yīng)和以R16mF2和R16mR1為引物的常規(guī)PCR和LAMP檢測(cè)，每個(gè)梯度設(shè)置3次重復(fù)，反應(yīng)結(jié)束后觀察結(jié)果，比較2種方法的靈敏度。

1.616SrⅠ-LAMP檢測(cè)體系檢測(cè)的穩(wěn)定性及應(yīng)用

供試樣品包括6份來(lái)自貴州貴陽(yáng)、遼寧大連、河北保定、河南開(kāi)封、福建福州和北京海淀的田間采集泡桐叢枝樣品，1份泡桐叢枝的組培苗(BJ+)，1份健康泡桐的組培苗(BJ-)，1份實(shí)驗(yàn)室組培保存的南陽(yáng)泡桐叢枝組培苗(NY)，3份不同品系脫毒組培苗(MB33、ZH3、ZP16)以及相對(duì)應(yīng)的這3個(gè)品系進(jìn)行病組織微芽嫁接傳病的組培苗(鄧寶紅，2016)，同時(shí)提取植物總DNA。并以此為模板，同步進(jìn)行常規(guī)PCR、巢式PCR和LAMP檢測(cè)，比較不同檢測(cè)方法的檢測(cè)效果，并驗(yàn)證LAMP檢測(cè)體系的穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與分析

2.116SrⅠ-LAMP檢測(cè)方法的建立

試驗(yàn)以泡桐叢枝為檢測(cè)對(duì)象，健康泡桐為對(duì)照，同時(shí)用恒溫核酸擴(kuò)增試劑盒自帶陽(yáng)性樣品(positive)與陰性樣品(negative)作為對(duì)照(確定酶是否失活和反應(yīng)體系穩(wěn)定性)，篩選以tuf基因作為靶標(biāo)設(shè)計(jì)的多套LAMP引物組，并參考恒溫?cái)U(kuò)增試劑盒所提供的反應(yīng)程序，建立植原體16SrⅠ-LAMP檢測(cè)體系。從圖1可以看出，試劑盒自帶陽(yáng)性樣品(positive)和泡桐叢枝樣品(PaWB)均出現(xiàn)了“S”形擴(kuò)增曲線，加入顯色液后變成翠綠色，而試劑盒自帶陰性樣品(negative)和健康泡桐樣品(PH)均未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線和變色反應(yīng)。16SrⅠ-LAMP檢測(cè)體系從基因組DNA加入至陽(yáng)性結(jié)果出現(xiàn)，可以在40 min內(nèi)完成，實(shí)現(xiàn)對(duì)16SrⅠ組植原體染病組織的快速檢測(cè)。

2.216SrⅠ-LAMP檢測(cè)方法的特異性

以不同來(lái)源、不同16Sr組別的植原體感染的組織材料及其對(duì)應(yīng)的健康組織材料的基因組DNA作為模板，按照所建立的LAMP檢測(cè)體系進(jìn)行反應(yīng)，驗(yàn)證LAMP體系的檢測(cè)特異性。結(jié)果表明， 泡桐叢枝(PaWB)、苦楝叢枝(CWB)、桑樹萎縮病(MD)、長(zhǎng)春花綠變(PePWB)和萵苣黃化(LY)5種感病的組織材料均可以產(chǎn)生良好的擴(kuò)增曲線，并且均能在40 min以內(nèi)出現(xiàn)信號(hào)，16SrⅡ組、16SrⅤ組、16SrⅩⅨ組植原體感染的組織材料以及所有的健康組織材料都沒(méi)出現(xiàn)擴(kuò)增曲線(圖2)。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)溶解性曲線分析，基本處于相同的溫度(圖3)，顯色反應(yīng)結(jié)果也與擴(kuò)增曲線檢測(cè)結(jié)果吻合(圖4)。由此表明所建立的16SrⅠ-LAMP擴(kuò)增體系可以完成5種16SrⅠ組植原體的檢測(cè)，而且特異性良好，對(duì)其他組的植原體及健康對(duì)照不產(chǎn)生陽(yáng)性結(jié)果。

圖1 16SrⅠ-LAMP檢測(cè)結(jié)果的熒光檢測(cè)及顯色反應(yīng)Fig.1 Amplification plot and colorimetric analysis of 16SrⅠ-LAMP products

圖2 16SrⅠ-LAMP檢測(cè)體系特異性驗(yàn)證熒光檢測(cè)Fig.2 Specificity test of 16SrⅠ-LAMP using amplification plot

圖3 16SrⅠ-LAMP檢測(cè)體系特異性溶解性曲線Fig.3 Solubility curve of 16SrⅠ-LAMP using amplification plot

圖4 16SrⅠ-LAMP檢測(cè)體系特異性驗(yàn)證顯色Fig.4 Specificity test of 16SrⅠ-LAMP using colorimetric analysis1.PaWB; 2.CWB; 3.MD; 4.PePWB; 5,6.PnWB; 7.SpWB; 8.ClWB; 9.JWB; 10.BiWB; 11.CeLY; 12.RoWB; 13.CnYC; 14.PH; 15.CH; 16.MH; 17.PeH; 18.LH; 19.PnH; 20.SpH; 21.ClH; 22.JH; 23.BiH; 24.CeH; 25.RoH; 26.CnH.

2.316SrⅠ-LAMP檢測(cè)方法的靈敏度

以泡桐叢枝病組培苗的植物總DNA作為原液，按2倍梯度進(jìn)行稀釋，以稀釋后的稀釋液作為模板，同步進(jìn)行PCR和LAMP檢測(cè)，PCR結(jié)果以1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行判讀，LAMP結(jié)果以顯色法進(jìn)行判讀。結(jié)果顯示，PCR在2-11倍的稀釋模板下時(shí)無(wú)明顯擴(kuò)增反應(yīng)，達(dá)到檢測(cè)下限(圖5)，LAMP在2-13倍的稀釋模板時(shí)仍有確定的陽(yáng)性結(jié)果，但在2-14倍的稀釋模板時(shí)顏色變化不明顯，達(dá)到檢測(cè)下限(圖6)。LAMP的檢測(cè)靈敏度較普通PCR提高了8倍。

2.416SrⅠ-LAMP檢測(cè)泡桐叢枝方法的穩(wěn)定性及應(yīng)用

利用建立的16SrⅠ-LAMP檢測(cè)方法，對(duì)來(lái)自貴陽(yáng)、保定、北京、福州、大連和開(kāi)封6個(gè)地區(qū)的田間泡桐叢枝病樣品以及實(shí)驗(yàn)室組培保存的不同品系泡桐叢枝病苗、脫毒苗和病組織微芽嫁接接種脫毒苗共15份樣品進(jìn)行檢測(cè)，并與普通PCR、巢式PCR的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較。結(jié)果(表3)表明， 6份來(lái)自不同省市的田間采集的泡桐叢枝病樣品、1份泡桐叢枝新組培苗(BJ+)、1份實(shí)驗(yàn)室保存的南陽(yáng)泡桐叢枝病組培苗(NY)的檢測(cè)結(jié)果皆為陽(yáng)性，1份健康泡桐新組培苗(BJ-)、3份不同品系脫毒組培苗(MB33、ZH3、ZP16)的檢測(cè)結(jié)果均為陰性，病組織微芽嫁接接種脫毒苗(病接穗-脫毒砧木)18天后，NY-MB33、NY-ZH3的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。NY-ZP16的PCR、LAMP檢測(cè)結(jié)果為陰性，而巢式PCR檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性。綜合以上結(jié)果分析，不論針對(duì)田間樣品還是組培樣品，16SrⅠ-LAMP檢測(cè)方法均可以穩(wěn)定地實(shí)現(xiàn)對(duì)病組織中泡桐叢枝植原體的準(zhǔn)確檢測(cè)。但是從檢出率上來(lái)看，LAMP與PCR相當(dāng)(66.66%)，但比巢式PCR略低(73.33%)。不同品系脫毒苗微芽嫁接傳病試驗(yàn)顯示，與MB33、ZH3品系相比，植原體在ZP16品系的嫁接傳毒效果較差，可能與該品系抗病性更強(qiáng)有關(guān)，為植原體抗性品系潛在選育對(duì)象。

圖5 泡桐叢枝病樣品的普通PCR檢測(cè)Fig.5 Detection of PaWB DNA dilution with conventional PCR

圖6 泡桐叢枝病樣品的LAMP檢測(cè)Fig.6 Detection of PaWB DNA dilution with LAMP

編號(hào)No．樣品描述Sample來(lái)源Source檢測(cè)結(jié)果ResultPCRNestedPCRLAMPPaWB?GZGY泡桐叢枝病田間樣品FieldPaWB貴州貴陽(yáng)Guiyang，Guizhou+++PaWB?LNDL泡桐叢枝病田間樣品FieldPaWB遼寧大連Dalian，Liaoning+++PaWB?HBBD泡桐叢枝病田間樣品FieldPaWB河北保定Baoding，Hebei+++PaWB?HNKF泡桐叢枝病田間樣品FieldPaWB河南開(kāi)封Kaifeng，Henan+++PaWB?FUFZ泡桐叢枝病田間樣品FieldPaWB福建福州Fuzhou，F(xiàn)ujian+++PaWB?BJHD泡桐叢枝病田間樣品FieldPaWB北京海淀Haidian，Beijing+++BJ+泡桐叢枝病新組培苗PaWBtissuecultureBJ-健康泡桐新組培苗PHtissuecultureNY泡桐叢枝病保存組培苗PaWBtissuecultureMB33脫毒組培苗Phytoplasma?freetissuecultureZH3脫毒組培苗Phytoplasma?freetissuecultureZP16脫毒組培苗Phytoplasma?freetissuecultureNY?MB33病組織微芽嫁接脫毒苗Graftingtissueculturewithdis?easedscionNY?ZH3病組織微芽嫁接脫毒苗GraftingtissueculturewithdiseasedscionNY?ZP16病組織微芽嫁接脫毒苗Graftingtissueculturewithdiseasedscion組培室Tissuecultureroom+++———+++—————————++++++—+—

3 討論

植原體病害是系統(tǒng)侵染性病害，媒介昆蟲是自然傳播途徑，而種苗和各種營(yíng)養(yǎng)繁殖材料包括種根、接穗、砧木、塊根、塊莖等是病害人為傳播的主要途徑。從源頭上杜絕病原的自然和人為傳播擴(kuò)散是防止此類病害流行的最常用也是最根本的方法。因此植原體的準(zhǔn)確快速診斷、實(shí)用檢測(cè)與鑒別方法的建立在病害各方面的研究中都至關(guān)重要，特別是在病害監(jiān)測(cè)、種苗檢疫及綜合防治方面占據(jù)著無(wú)法替代的地位并發(fā)揮著關(guān)鍵作用。較之常規(guī)核酸擴(kuò)增的檢測(cè)方法，新型的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)包括LAMP、滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(RCA)、單引物擴(kuò)增技術(shù)(SPIA)、切刻內(nèi)切酶介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(NEMA)、依賴核酸序列擴(kuò)增技術(shù)(NASBA)、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(RPA)等已開(kāi)始廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、真菌病害的早期檢測(cè)中(汪琳等, 2011)。其中LAMP技術(shù)的改進(jìn)和不斷完善與發(fā)展使得檢測(cè)病原靶標(biāo)核酸的擴(kuò)增可以在恒溫條件下進(jìn)行，簡(jiǎn)化了試驗(yàn)步驟，避免了對(duì)昂貴熱循環(huán)儀器的依賴，在縮短檢測(cè)時(shí)間的同時(shí)，使得其更能滿足快速、簡(jiǎn)便、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需求； 而且該技術(shù)不僅可用于各類病原微生物的檢測(cè)和鑒定，也可用于腫瘤和轉(zhuǎn)基因生物的檢測(cè)、基因拷貝的定量、微生物單核苷酸多態(tài)性和基因分型(Fakruddin， 2011)。16SrⅠ-LAMP是針對(duì)泡桐叢枝病等16SrⅠ組植原體靶序列的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物，在擴(kuò)增過(guò)程中，在鏈置換DNA聚合酶的作用下，形成啞鈴狀結(jié)構(gòu)，并以此為復(fù)制單元實(shí)現(xiàn)核酸的恒溫?cái)U(kuò)增； 而且擴(kuò)增的副產(chǎn)物——焦磷酸鎂沉淀，可以通過(guò)指示劑鈣黃綠素、HNB等進(jìn)行可視化的結(jié)果判斷，不再需要通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳判斷擴(kuò)增結(jié)果，從而實(shí)現(xiàn)了擴(kuò)增結(jié)果更快速、更高通量的檢測(cè)和鑒定。本研究采用了熒光曲線和顯色2種方法對(duì)結(jié)果加以判定，起到了相互驗(yàn)證的效果，同時(shí)進(jìn)一步提高了檢測(cè)準(zhǔn)確性。Bekele等(2011)為了確證陰性檢測(cè)結(jié)果，設(shè)置植物COX或ACTIN基因序列引物作為內(nèi)參(Vuetal., 2016)。本研究利用試劑盒附帶的陽(yáng)性和陰性標(biāo)樣對(duì)照標(biāo)樣同樣起到了避免出現(xiàn)假陽(yáng)性或假陰性試驗(yàn)結(jié)果的目的，因而每次測(cè)定都要設(shè)置內(nèi)參或陽(yáng)性和陰性對(duì)照標(biāo)樣，是發(fā)現(xiàn)檢測(cè)體系問(wèn)題、保證檢測(cè)結(jié)果可靠性的必要條件。

LAMP檢測(cè)技術(shù)的關(guān)鍵在于靶標(biāo)基因的選擇和引物組合的篩選，靶標(biāo)基因要選擇種內(nèi)高度保守、種間變異較高的序列。由于植原體對(duì)植物的專性寄生特性，因而要求LAMP引物不能擴(kuò)增寄主植物的同源基因。目前以保守的16S、23S和IGSDNA為靶標(biāo)基因的植原體LAMP檢測(cè)技術(shù)已見(jiàn)報(bào)道，但這些技術(shù)主要針對(duì)的是國(guó)外發(fā)生比較普遍的翠菊黃化、椰子黃化萎縮等植原體病害的檢測(cè)，且不同LAMP檢測(cè)體系的特異性也有很大差異，如Obura等(2011)基于16S DNA設(shè)計(jì)的LAMP引物能夠檢測(cè)不同組的植原體，而多數(shù)引物僅能檢測(cè)同組內(nèi)的植原體。本研究首次以持家基因tuf基因作為靶標(biāo)基因建立了16SrⅠ組植原體病害的LAMP檢測(cè)技術(shù)，特異性較好，檢測(cè)靈敏度比普通PCR技術(shù)提高了8倍，填補(bǔ)了我國(guó)在16SrⅠ組植原體快速檢測(cè)領(lǐng)域的空白；而且本檢測(cè)體系不僅能檢測(cè)16SrⅠ-D亞組的泡桐叢枝植原體，也能檢測(cè)16SrⅠ-B亞組桑樹萎縮、苦楝叢枝病等植原體，所以推測(cè)其對(duì)該組內(nèi)相同亞組或者不同亞組的其他國(guó)內(nèi)外植原體也能實(shí)現(xiàn)檢測(cè)，但這需要后續(xù)試驗(yàn)驗(yàn)證。已知我國(guó)發(fā)生的主要16SrⅠ組植原體的tuf基因序列變異范圍(0.73%～0.74%)高于16Sr DNA(低于0.42%)，推測(cè)應(yīng)該更有利于設(shè)計(jì)組內(nèi)亞組或株系特異性的引物(于少帥, 2016)。Sugawara等(2012)曾用植原體的持家基因groEL設(shè)計(jì)引物用于植原體的檢測(cè)，并隨其變異性大于16S等基因但所設(shè)計(jì)的LAMP引物也能檢測(cè)16SrⅠ組的多種植原體，這與tuf基因LAMP引物檢測(cè)的結(jié)果類似。

對(duì)于LAMP檢測(cè)植原體的靈敏度，不同研究因選擇的靶標(biāo)序列、引物、測(cè)定方法、植原體種類等不同而得出了差異很大的結(jié)論。如有報(bào)道采用濁度法和溴化乙錠染色瓊脂糖電泳檢測(cè)LAMP的靈敏度比巢式PCR還高100倍(Oburaetal., 2011)； 而Sugawara等(2012)研究發(fā)現(xiàn)不同的引物其檢測(cè)靈敏度不同，分別比常規(guī)PCR高10倍和100倍。本研究體系的檢測(cè)靈敏度高于普通PCR但低于巢式PCR，可能與引物特性或者無(wú)環(huán)引物有關(guān)。

針對(duì)LAMP技術(shù)容易出現(xiàn)痕量樣品氣溶膠污染、特異性靶標(biāo)選擇困難等問(wèn)題，本研究注意到通過(guò)將樣品制備室與檢測(cè)室分離，選擇新的靶標(biāo)，避免進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在反應(yīng)管中添加密封液等措施可以有效地減少假陽(yáng)性的出現(xiàn)，取得了理想的檢測(cè)效果。針對(duì)反應(yīng)結(jié)果的判斷方式，預(yù)計(jì)將LAMP技術(shù)與橫向側(cè)流試紙結(jié)合(蔡怡等, 2016)，亦或是將LAMP與微流控芯片技術(shù)結(jié)合(Gansenetal., 2012)，在加快檢測(cè)速度的同時(shí)，可能會(huì)提高植原體檢測(cè)通量及自動(dòng)化檢測(cè)能力。另外在檢測(cè)樣品制備和成品制備、運(yùn)輸方面仍有很大的改進(jìn)和完善空間，比如嘗試一步法DNA提取，或者直接裂解樣品進(jìn)行擴(kuò)增(茍大平等, 2015)，篩選不同的凍干保護(hù)劑，制成干粉制劑，增長(zhǎng)產(chǎn)品的貨架期等(吳彤等, 2016)。為了直接在田間進(jìn)行大量樣品的快速檢測(cè)，已有研究采用葉片、花、果部位直接勻漿而不必經(jīng)過(guò)DNA提純步驟即能取得理想的植原體檢測(cè)效果，這可能與LAMP檢測(cè)體系對(duì)樣品中存在的抑制物質(zhì)較PCR不敏感有關(guān)，從而為該技術(shù)在病害檢疫和生產(chǎn)上的推廣應(yīng)用展示了更廣闊的前景(Jungheetal., 2016; Kogovseketal., 2015)。

泡桐在我國(guó)分布廣泛，且經(jīng)歷過(guò)種苗與種根大規(guī)模引種栽培，使得泡桐叢枝病在全國(guó)大部分泡桐種植區(qū)擴(kuò)展蔓延，在危害比較嚴(yán)重的黃淮平原等病害適生暴發(fā)流行區(qū)，病害的發(fā)生率在70%以上。通過(guò)工廠化的脫毒育苗，進(jìn)行無(wú)毒苗栽培以及加大抗性品系的栽培面積，可以有效控制此類病害的大流行(鄧寶紅， 2016)。本研究所建立的快速檢測(cè)體系，可以為快速地鑒定脫毒組培苗的帶毒情況提供更簡(jiǎn)便、快捷、實(shí)用的新技術(shù)，且檢測(cè)靈敏度比常規(guī)PCR略高。在抗病品系篩選中，通過(guò)微芽嫁接傳病，LAMP技術(shù)可以為快速鑒定出具有抗性的一些品種提供強(qiáng)有力的支持，加快優(yōu)良抗病品系的選育和推廣應(yīng)用。本試驗(yàn)所涉及的3個(gè)品系中，通過(guò)感病組織材料NY微芽嫁接傳病，脫毒組培苗MB33和ZH3均被成功傳毒，且植原體在其苗中繁殖正常，濃度較高；而脫毒組培苗ZP16經(jīng)過(guò)微芽嫁接傳病后，并未顯示明顯的叢枝現(xiàn)象；普通PCR和LAMP均未檢出植原體，只有通過(guò)巢式PCR才檢出低濃度植原體的存在，由此說(shuō)明植原體在此品系中繁殖受限，ZP16品系可以作為潛在抗病品系進(jìn)行選育。

4 結(jié)論

本研究以tuf基因作為靶標(biāo)，首次建立了針對(duì)我國(guó)泡桐叢枝病、苦楝叢枝病、桑樹萎縮病、萵苣黃化及長(zhǎng)春花綠變5種16SrⅠ組植原體的環(huán)介導(dǎo)恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)快速、簡(jiǎn)便、結(jié)果可視化，適合科研單位及基層生產(chǎn)單位使用。通過(guò)在應(yīng)用實(shí)踐中進(jìn)一步技術(shù)改進(jìn)、優(yōu)化和完善，將在植原體的早期診斷、脫毒苗檢測(cè)以及抗性品種選育等方法發(fā)揮很大的作用，為植原體病害的科學(xué)防治提供技術(shù)支撐。

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(責(zé)任編輯 朱乾坤)

Loop-MediatedIsothermalAmplificationAssayforDetectionofFivePhytoplasmasBelongingto16SrⅠGroupBasedonTargettufGene

Wang Shengjie1Wang Shengkun2Lin Caili1Yu Shaoshuai1Wang Laifa1Piao Chungen1Guo Minwei1Tian Guozhong1

(1.KeyLaboratoryofForestProtectionofStateForestryAdministrationResearchInstituteofForestEcology,EnvironmentandProtection,CAFBeijing100091; 2.ResearchInstituteofTropicalForestry,CAFGuangzhou510520)

S763； S718.87

A

1001-7488(2017)08-0054-10

10.11707/j.1001-7488.20170807

2017-01-02；

2017-03-12。

“十二五”農(nóng)村領(lǐng)域國(guó)家高技術(shù)研究發(fā)展科技計(jì)劃(863)課題(2012AA101501)；林業(yè)微生物資源子平臺(tái)運(yùn)行與服務(wù)項(xiàng)目(NIMR2016-7)。

*田國(guó)忠為通訊作者。研究期間宋傳生采集了貴陽(yáng)泡桐叢枝病樣，李永采集了紅花槐叢枝病樣，在此一并表示感謝。