閆文凱 林文武 楊文婷 杜雅馨 吳祖建 楊 靚

(福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所 福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州 350002)

竹花葉病毒福州分離物基因組序列分析及其侵染性克隆的構(gòu)建*

閆文凱 林文武 楊文婷 杜雅馨 吳祖建 楊 靚

(福建農(nóng)林大學(xué)植物病毒研究所 福建省植物病毒學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 福州 350002)

【目的】 研究BaMV福州分離物BaMV-TMS1及其攜帶的衛(wèi)星RNA(satBaMV)分離物satBaMV-TMS1的全基因組特征，明確其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系； 對BaMV進(jìn)行cDNA侵染性克隆構(gòu)建方法的改進(jìn)，為其反向遺傳學(xué)體系的快速建立提供簡便的方法?！痉椒ā?根據(jù)已報(bào)道的BaMV和satBaMV全長序列保守區(qū)分別設(shè)計(jì)2對和1對擴(kuò)增引物，從感染BaMV的竹葉中擴(kuò)增、克隆獲得BaMV-TMS1和satBaMV-TMS1的全長序列，并進(jìn)行序列特征分析和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。采用多片段無縫克隆方法將擴(kuò)增得到的2個(gè)病毒DNA片段和載體進(jìn)行連接并轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌，接種本氏煙后檢驗(yàn)其侵染性?！窘Y(jié)果】 測序獲得的BaMV-TMS1和satBaMV-TMS1分離物核苷酸序列全長分別為6 366和834 nt(不含3′端的多聚腺苷酸尾)，具有典型的BaMV和satBaMV基因組結(jié)構(gòu)特征。BaMV-TMS1分離物與已報(bào)道的其他分離物序列同源性為82%～83%，而satBaMV-TMS1分離物與其他分離物的序列同源性為92%～93%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，BaMV-TMS1分離物可單獨(dú)形成一簇，satBaMV-TMS1分離物也單獨(dú)形成一個(gè)新的分支。侵染性克隆通過農(nóng)桿菌注射接種本氏煙10天以后，RT-PCR檢測以及透射電鏡負(fù)染觀察結(jié)果都驗(yàn)證病毒成功侵染。【結(jié)論】 BaMV-TMS1和satBaMV-TMS1分離物與已知序列有著較高的變異度且生成新的系統(tǒng)發(fā)育樹分支，體現(xiàn)了該病毒與衛(wèi)星RNA較高的遺傳多樣性。本研究成功構(gòu)建具有生物活性的BaMV侵染性克隆且構(gòu)建方法相對簡單快速。

竹花葉病毒； 衛(wèi)星RNA； 全基因組； 系統(tǒng)發(fā)育； 侵染性克隆

Abstract： 【Objective】 Bamboo mosaic virus(BaMV), a typical member of the genusPotexvirus, is widespread in bamboo cultivation region and can severely affect regular growth of bamboos. Theobjective of this study is to determine the genomic structure of a new isolate of BaMV (BaMV-TMS1) and its associated satellite RNA(satBaMV-TMS1) from Fuzhou of China and their phylogenetic relationship with reported BaMV and satBaMV strains. Moreover, it is necessary to optimize an efficientmethod of constructing BaMV cDNA infectious clone for rapid establishment of reverse genetic system.【Method】 The complete genomes of BaMV-TMS1 and satBaMV-TMS1 were amplified and sequenced from bamboo leaves with mosaic symptom by respectively using 2 and 1 primer pairs designed according to the conserved regions of known sequences. Genomic structure was analyzed and phylogenetic tree was reconstructed by maximum likelihood (ML)method. Meanwhile, seamless cloningmethod of multiple segments was applied to ligate two segments of BaMV-TMS1 and an amplified vector segment. An agrobacteria-mediatedmethod was used to verify the infectivity of BaMV cDNA infectious clone.【Result】 The complete sequences of BaMV-TMS1 and satBaMV-TMS1 have 6365 and 836 nucleotides, respectively, excluding the 3′-terminal poly(A) tail and contain the typical characteristic of genomic structure of BaMV and satBaMV. The isolate BaMV-TMS1 shared the highest nucleotide sequence identity of 82%-83% and 92%-93%, respectively, with all the BaMV and satBaMV isolates available in GenBank. Phylogenetic analysis indicated that BaMV-TMS1 was clustered into a new phylogenetic sub-lineage. Similarresult can be seen that satBaMV-TMS1 was grouped into a new sub-cluster. Theresult of RT-PCR detection and negative staining of plant crude extraction showed the successful and highly-efficient infection of BaMV after 10 days post-inoculation.【Conclusion】 The isolates BaMV-TMS1 and satBaMV-TMS1 have a higher degree of variation and were clustered into a new phylogenetic sub-lineage considering all isolates analyzed in this study, suggesting a relatively higher genetic diversity of the virus and its associated satellite RNA. On the other hand, the study provides a rapid and efficientmethod of constructing BaMV cDNA infectious clone with biological activity.

Keywords： bamboo mosaic virus； satellite RNA； complete genome； phylogeny； cDNA infectious clone

竹亞科(Bambusoideae)屬單子葉禾本科(Gramineae)植物，全世界有70多屬1 200多種，主要分布于低緯度的熱帶或亞熱帶季風(fēng)氣候區(qū)。我國是其世界分布中心之一，是世界上竹類資源最豐富、竹林面積最大、產(chǎn)量最高的國家，全國竹類植物有500多種。然而在竹類栽培過程中，竹子花葉病毒(bamboo mosaic virus, BaMV)的發(fā)生和流行威脅著竹類的生存且可能帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(Linetal.,2016)。BaMV可使葉片花葉、竹筍和竹桿內(nèi)部呈褐色條紋病變，造成竹筍木質(zhì)化、發(fā)筍率降低、竹桿節(jié)間變短，進(jìn)而影響竹材的經(jīng)濟(jì)價(jià)值(Linetal.,1979； Yehetal.,1992)。BaMV最早在巴西泰山竹(Bambusavulgaris)和孝順竹(Bambusamultiples)上被發(fā)現(xiàn)，后來相繼在中國臺灣、美國加利福尼亞和佛羅里達(dá)以及中國福建等地的不同竹種中被發(fā)現(xiàn)，分布范圍以及寄主相當(dāng)廣泛(Elliottetal.,1996; Linetal., 2016)。

在電子顯微鏡下BaMV為長490～510 nm的彎曲線形(Linetal., 1977)，其基因組為正單鏈RNA分子(Linetal., 1992)，全長6 366 bp左右，不計(jì)poly(A)，5′端帶有帽子結(jié)構(gòu)，3′端帶有poly(A)尾巴，基因組結(jié)構(gòu)包含5個(gè)開放閱讀框(open reading frame, ORF)。ORF1可編碼1個(gè)分子質(zhì)量約為155 KDa的復(fù)制酶(replicase)。ORF2、3和4組成重疊三基因功能區(qū)(triple gene block, TGB)，其基因產(chǎn)物分別為TGBp1(28 KDa)、TGBp2(13 KDa)、TGBp3(6 KDa)，與病毒在寄主細(xì)胞間的運(yùn)動有關(guān)，故又稱運(yùn)動蛋白(Linetal., 2006; Wungetal., 1999； Juetal.,2007)。ORF5主要編碼25 KDa的外殼蛋白(coat protein，CP)，起包被核酸的作用(Linetal., 1992； 1994)。BaMV作為Potexvirus模式研究對象之一，其基因組結(jié)構(gòu)和功能、與寄主植物互作途徑和機(jī)制以及作為表達(dá)載體的應(yīng)用上都有了較為深入研究；然而，由于目前報(bào)道的BaMV全長序列較少，該病毒的遺傳多樣性研究至今還沒有較大進(jìn)展。

以病毒侵染性克隆為基礎(chǔ)的反向遺傳學(xué)技術(shù)體系是現(xiàn)代分子病毒學(xué)研究中最基本、最重要的技術(shù)手段。對于BaMV侵染性克隆研究方面，Lin等(2004)構(gòu)建了BaMV侵染性克??； Yang等(2007)將BaMV發(fā)展成為表達(dá)豬口蹄疫病毒抗原表位的疫苗載體； Liou等(2014)成功將BaMV以及satBaMV構(gòu)建成為病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)載體用于本氏煙(Nicotianabenthamiana)的基因功能驗(yàn)證。然而，這些侵染性克隆的構(gòu)建方法過于繁瑣，且易受到酶切位點(diǎn)的限制。無縫克隆(scarless assembly)也稱為吉布森重組(Gibson assembly)的構(gòu)建方法可以克服這些缺點(diǎn)，快速高效地將片段連接在載體上，目前還未見運(yùn)用該方法構(gòu)建BaMV侵染性克隆的研究報(bào)道。

本研究對麻竹(Dendrocalamuslatiflorus)中的BaMV-TMS1以及satBaMV-TMS1分離物進(jìn)行全基因組序列測定，并將BaMV-TMS1構(gòu)建成侵染性克隆，為進(jìn)一步研究BaMV和satBaMV的遺傳多樣性、基因功能、致病機(jī)制以及和寄主植物互作的途徑和機(jī)制提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

福州分離物BaMV-TMS1和satBaMV-TMS1于2013年11月采自福州永泰天門山景區(qū)，呈典型花葉癥狀的麻竹上，前期經(jīng)電鏡觀察及RT-PCR檢測等確定分別為BaMV和satBaMV分離物，新鮮樣品置于密封袋中，保存于-80 ℃超低溫冰箱。侵染性克隆載體pCAMBIATuMV:6K2-GFP、對照載體pCAMGFP、農(nóng)桿菌(Agrobacterium)菌株GV3101由本實(shí)驗(yàn)室保存。侵染性克隆載體pKB(Liouetal.， 2014)由臺灣中興大學(xué)生物科技學(xué)研究所徐堯輝老師惠贈。

1.2主要試劑

RNeasy Plant Mini Kit購自Qiagen公司； GoScriptTMReverse Transcription System購自Promega公司； TransStart KD Plus DNA Polymerase、EasyPure Quick Gel Extraction Kit、EasyPure Plasmid MiniPrep Kit、pEASY-Blunt Zero Cloning Kit、DNA Marker、Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞均購自北京全式金公司(TransGen)； ClonExpressTMMultiS One Step Cloning Kit 購自南京諾唯贊生物科技有限公司(Vazyme)。

1.3試驗(yàn)方法

1.3.1 RNA提取及基因克隆 根據(jù)RNeasy Plant Mini Kit提供的使用說明從感病的麻竹心葉中提取總RNA。由于BaMV和satBaMV在3’UTR末尾都帶有polyA，因此反轉(zhuǎn)錄過程中直接選用Oligo(dT)作為cDNA第一鏈合成的引物。本反應(yīng)體系參照Promega公司GoScriptTMReverse Transcription System說明進(jìn)行，獲得BaMV和satBaMV全長的cDNA。根據(jù)GenBank已報(bào)道的BaMV和satBaMV的全長序列分別設(shè)計(jì)2對和1對擴(kuò)增引物(表1)，由北京六合華大基因科技有限公司合成。

PCR擴(kuò)增采用25 μL反應(yīng)體系： 5×KD Plus buffer 5 μL，dNTPs(2.5mM)2 μL，正向引物和反向引物(10 μmol·L-1)各0.5 μL，ddH2O 15.5 μL，KD Plus DNA Polymerase 0.5 μL，cDNA 1 μL。PCR反應(yīng)條件為： 94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃變性 30 s，復(fù)性30 s(退火溫度視基因片段而定)，68 ℃延伸若干分鐘(延伸時(shí)間按 1 min·kb-1計(jì))，共34個(gè)循環(huán)； 最后一輪循環(huán)后68 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)結(jié)束后，取產(chǎn)物5 μL用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收試劑盒純化后與pEASY-Blunt Zero克隆載體連接，并轉(zhuǎn)化到 Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞中。經(jīng)菌落PCR鑒定篩選得到的陽性克隆子，每個(gè)片段各挑取5個(gè)委托南京金斯瑞生物技術(shù)有限公司測序，并通過測序峰圖及序列比對分析。

1.3.2 序列比對及組裝 測序獲得的多個(gè)克隆子序列使用DNAMAN 7.0軟件進(jìn)行處理和拼接。序列一致性使用BLAST數(shù)據(jù)庫(http:∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/)在線比對。

1.3.3 系統(tǒng)發(fā)育分析 為分析BaMV以及satBaMV的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，從GenBank中下載BaMV和satBaMV其他分離物的核苷酸序列作為參考，使用最大似然法(maximum likelihood，ML)基于BaMV和satBaMV全基因組的核苷酸序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。建樹前，使用MEGA5(Tamuraetal., 2011)的Muscle比對方法對建樹序列進(jìn)行多重序列比對，利用Mrmodeltest選擇最優(yōu)化的核苷酸替換模型，并按照AIC(akaike information criterion)標(biāo)準(zhǔn)設(shè)置相應(yīng)參數(shù)，最后應(yīng)用自舉法(bootstrap)評估各分支節(jié)點(diǎn)的自舉置信度(bootstrap confidence level)。

1.3.4 侵染性克隆載體構(gòu)建 根據(jù)侵染性克隆載體pCAMBIATuMV:6K2-GFP的序列設(shè)計(jì)特異性反向擴(kuò)增引物(表1)，對載體基體進(jìn)行擴(kuò)增(去除TuMV的序列)，可制備7 469 bp的線性化載體。由于載體片段較大，因此為減少由于PCR帶來的隨機(jī)突變，將PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)降低到30左右。另外，為減少轉(zhuǎn)化過程中由于模板質(zhì)粒而引進(jìn)的假陽性率，使用高質(zhì)量的試劑盒對線性化克隆載體進(jìn)行膠回收純化，以提高DNA純度并去除一部分未線性化的環(huán)狀質(zhì)粒。

為實(shí)現(xiàn)下一步重組反應(yīng)，分別設(shè)計(jì)2對特異性引物pCAM1F/1R和pCAM2F/2R對陽性克隆菌液進(jìn)行擴(kuò)增(表1)。PCR反應(yīng)體系應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整： 94 ℃預(yù)變性3 min； 94 ℃變性30 s，55 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸若干分鐘，共10個(gè)循環(huán)； 94 ℃變性30 s，65 ℃復(fù)性30 s，68 ℃延伸若干分鐘，共24個(gè)循環(huán)； 最后一輪循環(huán)后68 ℃延伸10 min。PCR反應(yīng)預(yù)計(jì)分別擴(kuò)增約3 527 bp和2 838 bp的目的片段。最后，根據(jù)ClonExpressTMMultiS One Step Cloning Kit的使用說明將載體和片段進(jìn)行重組連接。

1.3.5 農(nóng)桿菌侵染 pCAMBaMV-TMS1載體通過電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)GV3101，含有載體的農(nóng)桿菌培養(yǎng)后，經(jīng)注射懸浮液(10 mmol·L-1MgCl2, 10 mmol·L-1MES, 200 μmol·L-1acetosyringone)室溫放置3 h后，用1 mL注射器將農(nóng)桿菌注射到4周齡的本氏煙葉片，共注射3次，每次3株。注射后在溫室中培養(yǎng)(晝27 ℃/16 h； 夜22 ℃/8 h)，14天后觀察煙草發(fā)病情況。

1.3.6 RT-PCR檢測BaMV的侵染 對病毒侵染的本氏煙葉片提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA第一鏈，然過用特異性引物CpC-F/R進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.3.7 電鏡負(fù)染觀察BaMV病毒粒子 參照韋石泉等(1985)和Hitchborn等(1965)的方法對感病煙草中的病毒粒子進(jìn)行電鏡觀察。

2 結(jié)果與分析

2.1BaMV-TMS1和satBaMV-TMS1分離物全基因組的擴(kuò)增與序列分析

利用特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得覆蓋BaMV和satBaMV基因組全長的3條特異性片段，電泳結(jié)果如圖1、2所示。克隆、測序、拼接后獲得BaMV-TMS1與satBaMV-MAZBZ基因組序列。BaMV-TMS1分離物全長6 366 nt(NCBI登錄號為KU936346)，satBaMV-TMS1分離物全長834 nt(NCBI登錄號為KU936347)，都分別具有典型的BaMV和satBaMV基因組結(jié)構(gòu)特征，其基因的核苷酸和氨基酸序列與其他分離物的序列一致性比較如表2、3所示。

表1 引物Tab.1 Primers

圖1 BaMV-TMS1基因組全長的擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 The amplified products of full length gene of BaMV-TMS11、2和3、4分別為BaMV-TMS1基因組全長的2個(gè)片段； M.Trans15K DNA Marker; CK：陰性對照。1， 2 and 3,4 were the two separate amplified proolucts of full length gene of BaMV-TMS1;M:Trans15K DNA Marker;CK:negative control.

圖2 satBaMV-TMS1全長的擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 The amplified products of satBaMV-TMS15和6為satBaMV-TMS1全長的擴(kuò)增產(chǎn)物； M：D2000 plus DNA ladder; CK：陰性對照。 5 and 6 were amplified products of full length； M:D2000 plus DNA ladder; CK:negative control.

2.2系統(tǒng)發(fā)育分析

根據(jù)Mrmodeltest軟件的AIC標(biāo)準(zhǔn)，建樹序列最適合的核苷酸替換模型為GTR+I+G。ML法重建的系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3、4所示，BaMV-TMS1分離物可形成一個(gè)新的分支； 同樣，satBaMV-TMS1分離物也單獨(dú)形成一個(gè)新的分支，且與臺灣分離物具有明顯的地域性。

2.3BaMV-TMS1侵染性克隆的構(gòu)建

利用設(shè)計(jì)的特異性引物，分別對載體和病毒片段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所獲得的片段均符合預(yù)期大小(圖5、6)。將上述PCR產(chǎn)物回收后，分別加入150 ng載體片段、70 ng病毒片段1和 57 ng病毒片段2于重組反應(yīng)體系中進(jìn)行反應(yīng)。經(jīng)挑取單菌落檢測全長片段(6 366 nt)，陽性率高達(dá)70%(圖7)。

表2 satBaMV的核苷酸和氨基酸序列與其他分離物一致性比較①Tab.2 Comparison of the nucleotide and amino sequences consistency between satBaMV and other isolates

①表中數(shù)字表示BaMV及satBaMV福州分離物與其他分離物氨基酸序列一致性的百分比(括號內(nèi)為氨基酸一致性百分比),(-)表示非編碼區(qū)，不編碼氨基酸。下同。The numbers in table illustrates the percentage of sequences consistency of the genomic regions of the BaMV and satBaMV Fuzhou isolate (amino acids in parentheses) to other isolates for which complete genome sequences are avaliable. (-) meansnon-coding sequence without amino acid.The same below.

表3 BaMV的氨基序列和氨基酸與其他分離物一致性比較Tab.3 The comparison of the nucleotide and amino sequences consistency between BaMV and other isolates

圖3 BaMV-TMS1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The phylogenetic tree of BaMV-TMS1

圖4 satBaMV-TMS1的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 The phylogenetic tree of satBaMV-TMS1

圖5 載體pCAMBIA的擴(kuò)增Fig.5 The amplification of vector pCAMBIA1:陰性對照; 2～11: 載體擴(kuò)增; M：Trans15K DNA Marker。 1: Negative control; 2-11: The amplification of vector; M:Trans15K DNA Marker.

圖6 BaMV基因的擴(kuò)增Fig.6 The amplification of BaMV gene1和2、3和4分別為2個(gè)基因片段;M:Trans15K DNA Marker。 1 and 2、3 and 4: The two separate amplified target fragments； M:Trans15K DNA Marker.

圖7 BaMV-TMS1基因全長的檢測Fig.7 The detection of full genome sequences of BaMV-TMS11～10:單菌落；M:Trans15K DNA Marker。1-10: Single colony； M:Trans15K DNA Marker.

2.4對感病本氏煙進(jìn)行RT-PCR檢測和電鏡負(fù)染觀察

將構(gòu)建的pCAMBaMV-TMS1侵染性克隆導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101后，注射4周齡的本氏煙；同時(shí)，分別以導(dǎo)入pKB和pCAMGFP載體的農(nóng)桿菌侵染煙草植株作為陽性和陰性對照。結(jié)果表明： 含有pKB載體的農(nóng)桿菌接種本氏煙10天以后，上部系統(tǒng)葉片開始出現(xiàn)花葉癥狀，隨后病狀加重； 含有載體pCAMBaMV-TMS1的農(nóng)桿菌侵染本氏煙20天后出現(xiàn)輕微的花葉癥狀； 而含有載體pCAMGFP的農(nóng)桿菌侵染本氏煙后沒有出現(xiàn)任何癥狀(圖8)。分別提取3組本氏煙的總RNA，以BaMV外殼蛋白保守區(qū)設(shè)計(jì)的特異性檢測引物CpC-F/R(Linetal., 2016)(表1)進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果表明，經(jīng)含有侵染性克隆pCAMBaMV-TMS1和pKB的農(nóng)桿菌侵染本氏煙后，PCR擴(kuò)增都得到527 bp左右的特異性條帶，而陰性對照組則沒有擴(kuò)增到相應(yīng)條帶(圖9)。采用病葉榨汁登網(wǎng)并負(fù)染的方法，以pKB為對照，對病葉中的病毒進(jìn)行電鏡負(fù)染觀察，結(jié)果顯示，在電鏡下觀察到許多桿狀、長度約為490～510 nm彎曲線形的病毒粒子(圖10)，是BaMV病毒粒子的形態(tài)特征。

圖8 BamV-TMS1侵染的本氏煙癥狀Fig.8 The Nicotiana benthamiana symptom of BaMV inoculation

圖9 RT-PCR檢測Fig.9 The detection of RT-PCR1:pCAMBaMV-TMS1; 2:陰性對照; 3:陽性對照;M:TIANGEN MarkerⅢ。1:pCAMBaMV-TMS1; 2: negative control; 3:positive control; M: MarkerⅢ of TIANGEN.

圖10 電鏡觀察病毒粒子Fig.10 The virus particle in electron microscope

3 討論

本研究從福州永泰天門山景區(qū)采得帶有重型花葉癥狀的麻竹樣品，根據(jù)GenBank中已知的BaMV和satBaMV不同分離物序列設(shè)計(jì)特異性的擴(kuò)增引物，利用RT-PCR擴(kuò)增和測序成功獲得BaMV-TMS1和satBaMV-TMS1分離物的全基因組序列。經(jīng)NCBI BLAST比對顯示，BaMV-TMS1分離物與已報(bào)道的序列一致性為82%～83%，而satBaMV-TMS1與其他分離物的序列一致性為92%～93%。系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明，BaMV-TMS1分離物并沒有與已知的福州分離物聚在一起，而是與臺灣分離物親緣關(guān)系較為接近，且同時(shí)形成一個(gè)新的分支。這可能與臺灣與大陸地區(qū)竹類品種往來運(yùn)輸有關(guān)，但該病毒具體的起源地在何處，還需要進(jìn)行更多的研究。同樣，satBaMV-TMS1分離物在系統(tǒng)發(fā)育分析中也形成一個(gè)單獨(dú)的分支，該結(jié)果表明BaMV和satBaMV在自然界中受到較大的選擇壓力影響，序列變異度較大，存在較高的遺傳多樣性，但其基因組結(jié)構(gòu)及其編碼的功能蛋白沒有受到影響。

隨著RNA病毒的cDNA侵染性克隆技術(shù)的發(fā)展，可在DNA水平上對RNA病毒進(jìn)行有目的性的改造，這為研究RNA病毒與寄主的相互作用機(jī)制提供了很好的手段。植物病毒侵染性克隆首先在雀麥花葉病毒中獲得成功(Ahlquistetal.,1984), 至今已有多種植物病毒成功地構(gòu)建了全長cDNA侵染性克隆。然而，傳統(tǒng)的cDNA侵染性克隆的構(gòu)建方法步驟相對繁瑣、操作不易且成功率低，為避免由于長片段擴(kuò)增而帶來的隨機(jī)突變，常通過短片段的擴(kuò)增，經(jīng)過限制性酶切位點(diǎn)的切割和連接將片段和載體重新連接而成。但是，這種方法往往會受到酶切位點(diǎn)的限制，且會引入一些非病毒序列的片段影響病毒的轉(zhuǎn)錄起始和終止，從而導(dǎo)致喪失病毒侵染性(Chiangetal., 1997)。無縫克隆技術(shù)是由Gibson等(2009)首次提出的，可實(shí)現(xiàn)多個(gè)DNA片段同時(shí)無縫接合到1個(gè)載體上。目前，該技術(shù)已成功運(yùn)用于多種RNA病毒的基因組重構(gòu)和侵染性克隆構(gòu)建，如流感病毒A(influenza A virus)(Zhouetal., 2009)、登革熱病毒(dengue virus)(Siridechadiloketal., 2013)、西尼羅病毒(West Nile virus)(Vandergaastetal., 2014)、豬繁殖和呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus)(Suhardimanetal., 2015)、萵苣花葉病毒(Lettuce mosaic virus)(Bordatetal., 2015)等。目前還沒有報(bào)道使用該方法對BaMV進(jìn)行侵染性克隆的構(gòu)建。本研究中，根據(jù)已知的病毒和載體序列，分別設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增； 回收產(chǎn)物經(jīng)純化后按照一定比例加入連接體系，PCR檢測陽性率高達(dá)70%。該方法采用農(nóng)桿菌瞬時(shí)表達(dá)法轉(zhuǎn)錄病毒基因組侵染植物，無需體外轉(zhuǎn)錄，操作方便快速，不需要昂貴的試劑，并且接種效率高達(dá)100%，適合大規(guī)模的遺傳操作。因此，BaMV侵染性克隆快速構(gòu)建方法的成功建立，將為下一步研究不同BaMV分離物的侵染性、發(fā)展運(yùn)用于驗(yàn)證竹類植物內(nèi)源基因功能的VIGS載體以及研究抗病毒策略等科學(xué)問題提供有力的技術(shù)手段。

4 結(jié)論

通過分析大陸和臺灣BaMV及satBaMV分離物的全基因組序列，發(fā)現(xiàn)BaMV及satBaMV具有較高的遺傳多樣性，系統(tǒng)進(jìn)化樹分析也得到相似的結(jié)果。另外，本試驗(yàn)成功快速構(gòu)建了大陸B(tài)aMV-TMS1分離物的侵染性克隆，接種本氏煙后有明顯的花葉癥狀，并通過RT-PCR檢測和電鏡負(fù)染的方法驗(yàn)證了其侵染性。

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(責(zé)任編輯 王艷娜)

CompleteGenomeSequenceAnalysisandInfectiousCloneConstructionofBambooMosaicVirusIsolatedfromFuzhou

Yan Wenkai Lin Wenwu Yang Wenting Du Yaxin Wu Zujian Yang Liang

(KeyLaboratoryofPlantVirologyofFujianProvinceInstituteofPlantVirology,FujianAgricultureandForestryUniversityFuzhou350002)

S763.11

A

1001-7488(2017)08-0035-08

10.11707/j.1001-7488.20170805

2016-06-12；

2016-07-30。

教育部博士點(diǎn)基金項(xiàng)目(20113515110001)； 福建省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(2014J06011)； 福建省高校杰出青年科研人才培育計(jì)劃(JA13092)； “福建農(nóng)林大學(xué)杰出青年科研人才”培養(yǎng)專項(xiàng)基金項(xiàng)目(xjq201402)。

*楊靚為通訊作者。