蔡月琴， 褚燕青， 朱科燕， 陳 誠(chéng)， 王德軍

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所， 杭州 315700)

miR-21對(duì)TGF-β1誘導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)分化的影響*

蔡月琴， 褚燕青， 朱科燕， 陳 誠(chéng)， 王德軍1△

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中心/比較醫(yī)學(xué)研究所， 杭州 315700)

目的觀察miR-21在轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化(EMT)中的作用，并探討miR-21參與調(diào)控HK-2細(xì)胞EMT的可能靶點(diǎn)。方法體外培養(yǎng)的HK-2細(xì)胞分為6組：正常對(duì)照組、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)模型組、miR-21 mimic陰性組、miR-21 mimic組、miR-21 inhibitor陰性組和miR-21 inhibitor組。細(xì)胞經(jīng)4 ng/ml TGF-β1處理建立EMT模型，檢測(cè)miR-21和EMT相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)變化，利用基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，將miR-21 mimic質(zhì)?；騧iR-21 inhibitor質(zhì)粒轉(zhuǎn)染經(jīng)TGF-β1處理的HK-2細(xì)胞，使細(xì)胞過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá)miR-21，在此基礎(chǔ)上觀察細(xì)胞EMT相關(guān)指標(biāo)的變化以及磷酸酯酶(PTEN)基因的影響。結(jié)果①與正常組相比，模型組的miR-21含量顯著升高(P<0.05)，上皮表型標(biāo)志物E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01)，間質(zhì)表型標(biāo)志物α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA) mRNA和蛋白水平也顯著升高(P<0.05，P<0.01)；②轉(zhuǎn)染miR-21 mimic后，與miR-21 mimic陰性對(duì)照組相比，miR-21含量顯著升高(P<0.01)，PTEN、E-cadherin的mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)，α-SMA mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)；轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor后，與miR-21 inhibitor陰性對(duì)照組相比，miR-21含量顯著降低(P<0.01)，PTEN、E-cadherin的mRNA和蛋白含量顯著升高(P<0.05，P<0.01)，α-SMA mRNA、蛋白水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)。結(jié)論miR-21在TGF-β1誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞EMT發(fā)生中具有重要作用，并且可能通過(guò)靶基因PTEN參與EMT相關(guān)分子的表達(dá)調(diào)控。

微小RNA-21；HK-2細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1；上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化

腎間質(zhì)纖維化(renal interstitial fibrosis，RIF)是各種不同病因的慢性腎臟病進(jìn)展到終末期腎衰竭的最終共同病變過(guò)程，RIF輕重程度決定各種腎臟疾病進(jìn)行性腎功能的惡化程度，已經(jīng)成為威脅世界公共健康的主要疾病之一[1-4]。RIF的關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制是腎小管上皮細(xì)胞向間充質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)，EMT 是RIF發(fā)生的中心環(huán)節(jié)，表現(xiàn)為上皮細(xì)胞失去粘附能力、α-SMA 表達(dá)和肌動(dòng)蛋白的重組、基底膜破壞和細(xì)胞遷移和侵襲能力增強(qiáng)[5]。EMT受許多生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、激素和細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)[6]。在眾多的調(diào)節(jié)因子中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transformation growth factor-β1，TGF-β1)被公認(rèn)為是最主要的致纖維化因子，始動(dòng)并調(diào)節(jié)腎小管上皮細(xì)胞EMT的全過(guò)程[7]。但目前腎小管細(xì)胞EMT的具體分子機(jī)制仍不明確，這也是目前研究的熱點(diǎn)之一。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，microRNA(miRNA)對(duì)EMT和腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移具有調(diào)控作用。miR-10 b可以通過(guò)上調(diào)HOXD10 基因的翻譯、下調(diào)RhoC的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，其表達(dá)水平與乳腺癌的進(jìn)展密切相關(guān)[8]。miR-200 不僅可以通過(guò)抑制TGF-β對(duì)EMT的誘導(dǎo)作用，而且可以直接作用于ZEB1 及SIP1 的mRNA，上調(diào)腫瘤細(xì)胞中E-cadherin的表達(dá)，抑制EMT的發(fā)生，降低腫瘤細(xì)胞的侵襲性[9, 10]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21在腎纖維化小鼠模型和腎移植病人中都顯著上調(diào)，并且miR-21敲除小鼠在腎臟損傷后很少會(huì)發(fā)生纖維化[11, 12]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)TGF-β1能夠上調(diào)miR-21表達(dá)[13]。這些結(jié)果提示，miR-21可能參與TGF-β1誘導(dǎo)的EMT，但至今miR-21在EMT中發(fā)揮的功能仍不十分清楚。因此，本研究通過(guò)在人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)中過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá)miR-21，觀察miR-21在TGF-β1誘導(dǎo)的HK2細(xì)胞EMT轉(zhuǎn)分化中的作用，探討miR-21參與調(diào)控HK2細(xì)胞EMT的可能的靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株

人腎小管上皮細(xì)胞(HK-2細(xì)胞)購(gòu)自武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基，于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)。

1.2 藥物與試劑

TGF-β1購(gòu)自R&D公司，DMEM/F12培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清均購(gòu)自Gibco公司，Lipofectamine 3000購(gòu)自invitrogen公司， RNA提取試劑盒、RT-PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green熒光定量試劑均購(gòu)自TaKaRa，PTEN、α-SMA、E-cadherin抗體購(gòu)自Abcam公司，內(nèi)參β-actin抗體購(gòu)自CST公司，Odyssey熒光羊抗鼠二抗購(gòu)自LI-COR公司，蛋白提取試劑盒、蛋白定量試劑盒購(gòu)自凱基公司。

1.3 EMT細(xì)胞模型制備

參照Wang等操作方法，將HK-2細(xì)胞用含10%胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)液，置37℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)并傳代。按5×105cells/well密度分別將上述細(xì)胞均勻種于6孔培養(yǎng)板中，80%融合后，換無(wú)血清DMEM/F12培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)16 h同步化細(xì)胞，培養(yǎng)液中加入終濃度為4 ng/ml的TGF-β1，用于轉(zhuǎn)染miR-21類似物、抑制劑。

1.4 轉(zhuǎn)染miR-21類似物mimic、抑制劑inhibitor

將不同濃度的miR-21 mimic或inhibitor溶于250 μl無(wú)血清的Opti-MEMⅠ Reduced Serum Medium中，混合均勻。將適量 Lipofectamine 3000 溶于 250 μl 無(wú)血清的Opti-MEMⅠ中，混合均勻，在室溫下孵育5 min。孵育5 min后，將上述兩種混合物混合(總體積500 μl)。輕輕混合均勻在室溫下孵育20 min(可能出現(xiàn)霧狀沉淀)。在6孔板中每孔加入500 μl 的復(fù)合物，十字法混合均勻。細(xì)胞在37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～48 h后備用。

細(xì)胞分組：(1)正常對(duì)照組：加入新鮮無(wú)血清的DMEM/F12培養(yǎng)液；(2)TGF-β1誘導(dǎo)組：培養(yǎng)液中加入終濃度為4 ng/ml的TGF-β1；(3)miR-21 mimic陰性組：培養(yǎng)液中加入TGF-β1后，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記的miR-21 mimic陰性對(duì)照；(4)miR-21 mimic組：培養(yǎng)液中加入TGF-β1后，轉(zhuǎn)染miR-21 mimic；(5)miR-21 inhibitor陰性組：培養(yǎng)液中加入TGF-β1后，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染FAM標(biāo)記miR-21 inhibitor陰性對(duì)照；(6)miR-21 inhibitor組：培養(yǎng)液中加入TGF-β1后，轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor。每組3個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞。

1.5 HK-2細(xì)胞miR-21含量檢測(cè)

總RNA提?。焊鹘M6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的HK-2細(xì)胞，用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)洗滌兩次，用RNA提取試劑盒(TaKaRa)提取總RNA，操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。提取的總RNA濃度和純度用Nanodrop 2000微量核酸測(cè)定儀測(cè)定后，備用。

miR-21逆轉(zhuǎn)錄RT：將上述已提取的總RNA分別用has-miR-21 RT Primer、has-U6 snRNA RT Primer引物逆轉(zhuǎn)錄為miR-21和U6 cDNA。加入總RNA 250 ng，RT primer (2 μmol/L) 0.5 μl，并補(bǔ)足ddH2O至總體積3.0 μl，RT反應(yīng)條件：65℃ 10 min，冰上放置3 min。在上述反應(yīng)液中依次加入Denatured total RNA and RT primer、dNTP、5x RT緩沖液、Rnase inhibitor、M-MLV，在42℃下孵育60 min，然后再70℃孵育15 min，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

miR-21熒光定量PCR檢測(cè)：將反轉(zhuǎn)錄的miR-21和U6 cDNA用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系：SYBR Green Mix 10 μl，10 μmol/L Forward Primer 0.4 μl，10 μmol/L Reverse Primer 0.4 μl，加入0.5 μl miR-21或U6 cDNA，ddH2O補(bǔ)足至20 μl。PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性5 min，然后95℃變性10 s，60℃復(fù)性30 s，40個(gè)循環(huán)后進(jìn)入熔解曲線程序。每個(gè)樣品PCR反應(yīng)重復(fù)3次，根據(jù)熔解曲線判斷產(chǎn)物特異性，miR-21表達(dá)量通過(guò)公式2-△△CT計(jì)算。has-miR-21 RT Primer、has-miR-21熒光定量PCR引物和內(nèi)參照has-U6 snRNA RT Primer、has-U6 snRNA熒光定量PCR引物序列由invitrogen設(shè)計(jì)并合成，各引物序列見(jiàn)表1。

Tab.1RT and quantitative PCR primer sequence of has-miR-21, has-U6 snRNA

miRNAprimernameSequencesofprimershas?miR?21RTPrimerGTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACTCAAChas?miR?21forwardF5’?GCCGCGTAGCTTATCAGACT?3’has?miR?21reverseR5’?CAGTGCAGGGTCCGAGGTATT?3’has?U6snRNARTPrimerCGAATTTGCGTGTCATCCThas?U6snRNAfor?wardF5’?CTCGCTTCGGCAGCACATA?3’has?U6snRNAre?verseR5’?CGAATTTGCGTGTCATCCT?3’

1.6HK-2細(xì)胞PTEN、α-SMA、E-cadherinmRNA檢測(cè)

總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA：將上述已提取的總RNA用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript TM RT reagent(TaKaRa)說(shuō)明書(shū)配置RT反應(yīng)液，將反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系加到無(wú)RNase的PCR管內(nèi)，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37°C 15 min，85°C 5 s。反應(yīng)結(jié)束后，將cDNA保存于-20°C冰箱備用。Real time PCR：將cDNA用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系：SYBR Green Mix 10 μl，10 μmol/L Forward Primer 1 μl，10 μmol/L Reverse Primer 1 μl，加入2 μl cDNA，ddH2O補(bǔ)足至20 μl。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性30 s；95℃ 變性10 s，60℃ 復(fù)性30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線：從55℃開(kāi)始，每10 s升高0.5℃，直到95℃，循環(huán)1次。所有反應(yīng)信息資料由Bio-Rad iQ5 PCR儀收集，目的基因mRNA水平通過(guò)公式2-△△CT計(jì)算。PTEN、α-SMA、E-cadherin和管家基因β-actin熒光定量PCR引物序列由invitrogen設(shè)計(jì)并合成，各引物序列見(jiàn)表2。

Tab. 2 Primer sequences for quantitative PCR

1.7Westernblot檢測(cè)HK-2細(xì)胞PTEN、α-SMA、E-cadherin蛋白

各組6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中的HK-2細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染48 h后，用0.01 mol/L PBS(pH 7.4)清洗兩次，用細(xì)胞刮將細(xì)胞從6孔培養(yǎng)板中分離，用蛋白提取試劑盒提取總蛋白，提取的總蛋白經(jīng)BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測(cè)定其蛋白濃度，取部分樣品加蛋白上樣緩沖液進(jìn)行煮沸5 min變性。取50 μg總蛋白樣品經(jīng)10% SDS-PAGE電泳分離蛋白質(zhì)，凝膠蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜于硝酸纖維膜，經(jīng)5% BSA 37℃封阻2 h后，每張膜分別加一抗PTEN、α-SMA、E-cadherin或內(nèi)參β-actin抗體，一抗用5% BSA 1∶1 000稀釋，4℃搖動(dòng)孵育過(guò)夜，加odyssey熒光抗兔二抗，室溫下?lián)u動(dòng)1.5 h，含0.1% Tween 20的TBST緩沖液洗5次，每次5 min，將膜置于odyssey近紅外激光成像系統(tǒng)上掃描目的條帶和內(nèi)參條帶，經(jīng)odyssey圖像軟件系統(tǒng)分析PTEN、α-SMA、E-cadherin蛋白表達(dá)量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1TGF-β1處理后HK-2細(xì)胞miR-21水平以及EMT相關(guān)指標(biāo)α-SMA、E-cadherin的變化

與正常組相比，TGF-β1誘導(dǎo)的模型組細(xì)胞的miR-21含量顯著升高(P<0.05)，間質(zhì)表型標(biāo)志物α-SMA的 mRNA含量和蛋白水平均顯著升高(P<0.05，P<0.01)，上皮表型標(biāo)志物E-cadherin的mRNA含量和蛋白表達(dá)水平均顯著降低(P<0.01，表3，圖1)，表明已成功建立EMT模型。

Fig.1Changes of protein expressions of α-SMA, E-cadherin and PTEN by Western blot analysis in all groups A: Control group; B: Model group; C: MiR-21 mimic negative control group; D: MiR-21 mimic group; E: MiR-21 inhibitor negative control group; F: MiR-21 inhibitor group

Tab. 3 Changes of miR-21 level, mRNA and protein expressions of α-SMA, E-cadherin in HK-2 cells after treating with TGF-β1(±s， n=3)

α-SMA: α-smooth muscle actin; TGF-β1: Transformation growth factor-β1

*P<0.05，**P<0.01vscontrol group

2.2HK-2細(xì)胞過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá)miR-21對(duì)PTENmRNA和蛋白水平的影響

從表4、圖1可以看出，HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21 mimic后，miR-21含量較miR-21 mimic陰性對(duì)照組顯著升高(P<0.01)，PTEN的mRNA和蛋白水平顯著下降(P<0.05，P<0.01)；HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor后，miR-21含量較miR-21 inhibitor陰性對(duì)照組顯著降低(P<0.01)，PTEN的mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)。

2.3HK-2細(xì)胞過(guò)表達(dá)或抑制表達(dá)miR-21對(duì)α-SMA、E-cadherinmRNA和蛋白水平的影響

從表5、圖1可以看出，HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21 mimic后，與miR-21 mimic陰性組相比，α-SMA mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)，E-cadherin的mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)；HK-2細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor后，與miR-21 inhibitor陰性組相比，α-SMA mRNA和蛋白水平顯著降低(P<0.05，P<0.01)，E-cadherin的mRNA和蛋白水平顯著升高(P<0.05，P<0.01)。

Tab. 4 Changes of miR-21 level on the mRNA and protein expression of PTEN in HK-2 cells after transfecting with miR-21 mimic or inhibitor plasmid(±s， n=3)

PTEN: Phosphatase and tensin homolog

*P<0.05，**P<0.01vsmiR-21 mimic negative control group;#P<0.05,##P<0.01vsmiR-21 inhibitor negative control group

Tab. 5 Changes of mRNA and protein expression of α-SMA and E-cadherin in HK-2 cells after transfecting with miR-21 mimic or inhibitor plasmid(±s， n=3)

*P<0.05，**P<0.01vsmiR-21 mimic negative control group;#P<0.05,##P<0.01vsmiR-21 inhibitor negative control group

3 討論

TGF-β1 是目前公認(rèn)的最主要致纖維化細(xì)胞因子，是誘導(dǎo)EMT過(guò)程的關(guān)鍵因素，EMT是指上皮細(xì)胞在特定的情況下向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的現(xiàn)象，其主要特征為上皮細(xì)胞粘附分子(E-cadherin)表達(dá)的喪失，并獲得間質(zhì)細(xì)胞特征性表型蛋白(α-SMA)的高表達(dá)[14]。E-cadherin的作用是維持上皮細(xì)胞間連接的穩(wěn)定性，其表達(dá)水平與EMT的發(fā)生及腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移能力呈負(fù)相關(guān)，是EMT的關(guān)鍵分子，α-SMA是間質(zhì)細(xì)胞的特征性表型蛋白，也是EMT的主要分子標(biāo)志之一。本實(shí)驗(yàn)中，HK-2細(xì)胞經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)后，模型組的上皮細(xì)胞表型標(biāo)志物E-cadherin的 mRNA含量和蛋白表達(dá)水平均顯著降低，而間質(zhì)表型標(biāo)志物α-SMA的mRNA含量和蛋白水平顯著升高，表明已成功建立EMT模型。

miRNA是一類長(zhǎng)約19～23 nt的單鏈非編碼RNA，其與靶mRNA的3’-UTR(3’非編碼區(qū))特異性結(jié)合，引起靶 mRNA 的翻譯抑制或切割降解，調(diào)控基因的表達(dá)。miRNA可通過(guò)靶基因的抑制和降解在EMT調(diào)控中起重要作用。miR-21在EMT中發(fā)揮調(diào)控作用的靶mRNA可能是與張力蛋白同源的磷酸酯酶基因(phosphatase and tensin homolog，PTEN)[15, 16]。miR-21通過(guò)降解PTEN的表達(dá)和結(jié)合于靶mRNA 的3’UTR端抑制其翻譯兩種作用方式調(diào)控基因的表達(dá)，使腎小管上皮細(xì)胞發(fā)生EMT。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，TGF-β1誘導(dǎo)的EMT模型細(xì)胞中miR-21表達(dá)顯著升高，提示miR-21可能在腎纖維化過(guò)程中具有重要調(diào)控作用。這和前期Wang等報(bào)道的在腎纖維化小鼠模型中miR-21顯著上調(diào)的結(jié)論相一致[11]。為驗(yàn)證這一結(jié)論，我們通過(guò)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)，將EMT模型組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染miR-21 mimic或miR-21 inhibitor，轉(zhuǎn)染后miR-21含量進(jìn)一步升高或者顯著降低，表明質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染miR-21 mimic后，miR-21過(guò)表達(dá)下調(diào)了PTEN的mRNA和蛋白水平，上調(diào)了間質(zhì)表型標(biāo)志物α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)、下調(diào)了上皮表型標(biāo)志物E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)，即miR-21過(guò)表達(dá)加劇了HK-2細(xì)胞的EMT；正好相反，轉(zhuǎn)染miR-21 inhibitor后，miR-21抑制表達(dá)，上調(diào)了PTEN的mRNA和蛋白水平，下調(diào)了間質(zhì)表型標(biāo)志物α-SMA的mRNA和蛋白表達(dá)，上調(diào)了上皮表型標(biāo)志物E-cadherin的mRNA和蛋白表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了HK-2細(xì)胞的EMT。這些結(jié)果表明miR-21作為體內(nèi)調(diào)控基因表達(dá)的重要分子，參與了EMT相關(guān)分子的表達(dá)調(diào)控。

以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，miR-21能夠加劇HK2細(xì)胞TGF-β1誘導(dǎo)的EMT，并且可能通過(guò)靶基因PTEN參與了EMT相關(guān)分子的表達(dá)調(diào)控。

[1] Woo KT, Choong HL, Wong KS,etal. The contribution of chronic kidney disease to the global burden of major noncommunicable diseases [J].KidneyInt, 2012, 81(10): 1044-1045.

[2] Nugent RA, Fathima SF, Feigl AB,etal. The burden of chronic kidney disease on developing nations: a 21st century challenge in global health [J].NephronClinPract, 2011, 118(3): c269-277.

[3] Farris AB, Colvin RB. Renal interstitial fibrosis: mechanisms and evaluation [J].CurrOpinNephrolHypertens, 2012, 21(3): 289-300.

[4] Mahdavi-Mazdeh M, Hatmi ZN, Shahpari-Niri S. Does a medical management program for CKD patients postpone renal replacement therapy and mortality? A 5-year-cohort study [J].BMCNephrol, 2012, 13: 138.

[5] 林成成, 陸 紅, 梁 勇, 等. 腎小管上皮細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化在大鼠輸尿管梗阻及再通中的意義[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志, 2013, 29(5): 454-456.

[6] Wang QL, Tao YY, Yuan JL,etal. Salvianolic acid B prevents epithelial-to-mesenchymal transition through the TGF-beta1 signal transduction pathway in vivo and in vitro [J].BMCCellBiol, 2010, 11(31): 1668-1681.

[7] Fan DM, Qi PW, Gao SG,etal. TGF-β1 mediates estrogen receptor-induced epithelial-to-mesenchymal transition in some tumor lines [J].TumourBiol, 2014, 35(11): 11277-11282.

[8] Ma L, Teruya-Feldstein J, Weinberg RA. Tumour invasion and metastasis initiated by microRNA-10b in breast cancer [J].Nature, 2007, 449(7163): 682-688.

[9] Korpal M, Lee ES, Hu G,etal. The miR-200 family inhibits epithelial-mesenchymal transition and cancer cell migration by direct targeting of E-cadherin transcriptional repressors ZEB1 and ZEB2[J].JBiolChem, 2008, 283(22): 14910-14914.

[10]Li Y, Vanden Boom TG 2nd, Kong D,etal. Up-regulation of miR-200 and let-7 by natural agents leads to the reversal of epithelial-to-mesenchymal transition in gemcitabine-resistant pancreatic cancer cells[J].CancerRes, 2009, 69(16): 6704-6712.

[11]Wang JY, Gao YB, Zhang N,etal. miR-21 overexpression enhances TGF-β1-induced epithelial-to- mesenchymal transition by target smad7 and aggravates renal damage in diabetic nephropathy [J].MolCellEndocrinol, 2014, 392(1-2): 163-172.

[12]Wilflingseder J, Sunzenauer J, Toronyi E,etal. Molecular pathogenesis of post-transplant acute kidney injury: assessment of whole-genome mRNA and miRNA profiles [J].PLoSOne, 2014, 9(8): e104164.

[13]Liu Z, Wang J, Guo C,etal. microRNA-21 mediates epithelial-mesenchymal transition of human hepatocytes via PTEN/Akt pathway [J].BiomedPharmacother, 2015, 69: 24-28.

[14]涂容芳, 張秀峰, 何振華. 5-HTR2B、E-cad、α-SMA在博萊霉素致大鼠肺纖維化中的表達(dá)變化[J]. 中國(guó)應(yīng)用生理學(xué)雜志， 2016, 32(4): 365-369.

[15] Haghikia A, Hilfiker-Kleiner D. MiRNA-21: a key to controlling the cardiac fibroblast compartment [J].CardiovascRes, 2009, 82(1): 1-3.

[16]Zhang Z, Peng H, Chen J,etal. MicroRNA-21 protects from mesangial cell proliferation induced by diabetic nephropathy in db/db mice [J].FEBSLett, 2009, 583(12): 2009-2014.

TheinfluenceofmiR-21onHK-2EMTcellsinducedbyTGF-beta1

CAI Yue-qin, CHU Yan-qing, ZHU Ke-yan, CHEN Cheng, WANG De-jun△

(Zhejiang Chinese Medical University, Laboratory Animal Research Center/Comparative Medicine Institude, Hangzhou 310053, China)

Objective: To investigate the effect of the miR-21 and its target mRNA in renal tubular epithelial mesenchymal transformation (EMT) model induced by transformation growth factor-β1(TGF-β1) in human renal tubular epithelial (HK-2) cells.MethodsHK-2 cells were divided into 6 groups: normal control group, TGF-β1 group, miR-21 mimic negative group, miR-21 mimic group, miR-21 inhibitor negative group and miR-21 inhibitor group. EMT model was established in HK-2 cells induced by 4 ng/ml TGF-β1. The level of miR-21, the mRNA and protein expression of EMT related factors were detected. MiR-21 mimic plasmid and miR-21 inhibitor plasmid were transfected into HK-2 cells that treated with TGF-β1 respectively using liposome transfection technique. Observe the impact of overexpression or inhibition expression of miR-21 on the mRNA and protein expression of EMT related factors and PTEN.Results①Compared with the normal group, the level of miR-21 was significantly increased in model group (P<0.05), the mRNA and protein expression levels of epithelial cells marker E-cadherin was significantly decreased (P<0.01), while the mRNA and protein levels of mesenchymal cells marker α-SMA was significantly increased (P<0.05，P<0.01). ②Compared with the miR-21 mimic negative group, the level of miR-21 in miR-21 mimic group increased significantly (P<0.01), the mRNA and protein expression levels of PTEN and E-cadherin decreased significantly (P<0.05，P<0.01), the mRNA and protein levels of α-SMA increased significantly (P<0.05，P<0.01). Compared with the miR-21 inhibitor negative control group, the level of miR-21 in miR-21 inhibitor group decreased significantly (P<0.01), the mRNA and protein expression levels of PTEN and E-cadherin increased significantly (P<0.05，P<0.01), the mRNA and protein levels of α-SMA decreased significantly (P<0.05，P<0.01).ConclusionMiR-21 may play an important role in EMT induced by TGF-β1 in HK-2 cells and regulate the expression of EMT related factors its target gene PTEN.

microRNA-21; HK-2 cells; transformation growth factor-β1; epithelial mesenchymal transformation

R392.11

A

1000-6834(2017)04-346-05

浙江省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(LQ14H290004)；浙江中醫(yī)藥大學(xué)比較醫(yī)學(xué)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目(XTD201301)

2016-07-21

2017-01-30

△

Tel: 0571-86613662； E-mail: wdj0369@126.com

10.12047.j.cjap.5477.2017.084