尹麗琴， 李范玲， 湯長發(fā)， 陶 霞， 劉文鋒， 黃洪波， 鄧 勇， 湯 林

(1. 湖南師范大學(xué)體育學(xué)院， 長沙 410012； 2. 湖南省人民醫(yī)院， 長沙 410005； 3. 湖南工業(yè)大學(xué)體育學(xué)院， 株洲 412008； 4. 湖南商學(xué)院體育部， 長沙 410018)

不同強度運動對骨骼肌纖維MHC亞型轉(zhuǎn)化及CaN/NFATc1信號通路的影響*

尹麗琴1，3， 李范玲2+， 湯長發(fā)1△， 陶 霞4， 劉文鋒1， 黃洪波1， 鄧 勇1， 湯 林1

(1. 湖南師范大學(xué)體育學(xué)院， 長沙 410012； 2. 湖南省人民醫(yī)院， 長沙 410005； 3. 湖南工業(yè)大學(xué)體育學(xué)院， 株洲 412008； 4. 湖南商學(xué)院體育部， 長沙 410018)

目的研究不同強度運動對骨骼肌纖維MHC亞型轉(zhuǎn)化及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)/活化T細(xì)胞核因子1(NFATc1)信號通路的影響。方法雄性SD大鼠(2月齡)24只，隨機分為3組(n=8)：正常對照組(NC)、中等強度組(ME)、大強度組(HE)，進(jìn)行8周跑臺訓(xùn)練。采用ATP酶染色法測定I、II型肌纖維，凝膠電泳技術(shù)分離肌球蛋白重鏈(MHC)亞型，比色法測定骨骼肌中CaN活性，免疫印跡技術(shù)測定骨骼肌NFATc1蛋白含量。結(jié)果①肌纖維密度變化：股四頭肌ME組I、II型纖維數(shù)密度均顯著增加(P<0.05)，HE組僅II型纖維面密度顯著增加(P<0.05)；比目魚肌HE、ME組I型纖維數(shù)密度均顯著增加(P<0.05)；②肌纖維MHC亞型百分比變化：股四頭肌ME組MHCI、IIa百分比升高(P<0.05)，而MHCIIb百分比降低(P<0.05)；比目魚肌MHCI百分比升高，MHCIIa、IIb百分比降低；③ME組大鼠CaN活性、NFAT1蛋白含量均顯著升高(P<0.05)。結(jié)論大、中等強度運動可誘導(dǎo)骨骼肌MHC快型向慢型轉(zhuǎn)化，同時伴隨肌纖維亞型變化骨骼肌中CaN活性增加、NFATc1蛋白表達(dá)增加。

鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶；肌球蛋白重鏈；活化T細(xì)胞核因子；大、中強度運動; 大鼠

肌纖維類型與廢用性肌萎縮、骨骼肌老齡化等情況密切相關(guān)，同時肌纖維比例還關(guān)系到運動員的耐力和爆發(fā)力水平[1]。目前，哺乳動物骨骼肌主要分為I型、IIa型、IId/x型和IIb型[2]。MHC作為骨骼肌收縮的主要成分，其收縮速度排序：MHC-I

目前對骨骼肌MHC亞型轉(zhuǎn)化的機理存在多種解釋，如肌源性調(diào)節(jié)因子(myogenic regulatory factor, MRFs)[6]途徑、PGC-1α/β、AMPK和PPARδ[7]信號通路等。研究較多的兩條途徑為CaN/NFAT和MRFs途徑。CaN/NFAT廣泛參與T細(xì)胞分化成熟、血管平滑肌細(xì)胞增殖、肌細(xì)胞肥大、神經(jīng)元突觸傳遞和細(xì)胞因子產(chǎn)生等[8]，CaN被認(rèn)為是骨骼肌重塑的重要信號分子，且研究證實它也參與骨骼肌分化、纖維轉(zhuǎn)型。本實驗通過對大鼠進(jìn)行8周中、大強度的跑臺運動，觀察不同強度運動中骨骼肌CaN活性及NFATc1蛋白表達(dá)的變化以及對骨骼肌纖維類型的影響，以期進(jìn)一步分析探討CaN/NFAT信號通路在對有氧運動適應(yīng)過程中的可能機制提供理論解釋。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SD健康雄性大鼠(2月齡)24只，購自湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物實驗中心。動物購買適應(yīng)飼養(yǎng)3 d后，先進(jìn)行適應(yīng)性訓(xùn)練1周(跑臺坡度遞增到10°，持續(xù)時間遞增到40 min，速度遞增到26.8 m/min)。實驗期間按國家動物飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行喂養(yǎng)。

1.2 實驗分組與運動方案

動物隨機分為3組(n=8)：正常對照組(NC)、中強度運動組(ME)、大強度運動組(HE)。采用杭州立泰科技有限公司PT動物實驗跑臺，參照Bedford[9]、丁樹哲[10]的運動負(fù)荷強度標(biāo)準(zhǔn)。中強度運動組：坡度5°，速度18 m/min，運動持續(xù)時間60 min。大強度運動組：跑臺速度3 min左右升到26.8 m/min，坡度10°，運動時間為40 min[11]。訓(xùn)練時間每天15: 00～17: 00，每周訓(xùn)練5 d，休息2 d，共8周。

1.3 樣品采集與處理

8周訓(xùn)練結(jié)束后，以10%的水合氯醛腹腔麻醉，斷頭處死。迅速取大鼠右后肢股四頭肌和比目魚肌，冰生理鹽水洗去殘留血跡，去掉脂肪和結(jié)締組織，放入-80℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

肌組織冰凍切片：從超低溫冰箱(-80℃)中取出大鼠肌組織，先置于常溫冰箱-20℃復(fù)溫15～20 min，再放入4℃環(huán)境復(fù)溫10～15 min, 最后常溫復(fù)溫10～15 min。復(fù)溫后進(jìn)行OCT包埋速凍，同時將冰凍切片機開機預(yù)冷到-18℃～-20℃；將速凍好的標(biāo)本制作切片(厚度8 μm)，每個組織切3張切片。切好后平整地粘附到經(jīng)過多聚賴氨酸處理的載玻片上。

1.4 指標(biāo)檢測

1.4.1 ATP酶染色 ATP酶染色是研究肌纖維的重要的組織化學(xué)方法之一，將切片置室溫干燥30～60 min后再進(jìn)行ATP酶染色。pH 10.4的堿性環(huán)境中預(yù)孵大鼠肌纖維冰凍切片，Ⅰ型肌纖維顯淺棕色或不顯色，Ⅱ型肌纖維顯深棕色或黑色。封固后，組織切片在同一天進(jìn)行拍照，拍照采用Motic Med 6.013數(shù)碼醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，每張切片至少分析4個獨立區(qū)域，計算Ⅰ、Ⅱ型肌纖維的目標(biāo)個數(shù)、目標(biāo)面積比例[12]等。

1.4.2 聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE) 采用BCA試劑盒測定勻漿上清液的蛋白濃度，濃縮膠和分離膠的濃度分別為4%和8%, 均含30 %的甘油。電極緩沖液中含0.1%的SDS(十二烷基硫酸鈉), 其它步驟按常規(guī)實驗步驟進(jìn)行[13]。取各樣蛋白20 μg，并加等體積的樣品緩沖液，在100℃沸水中水浴3～6 min, 恒壓70 V, 在4℃冰箱中電泳38 h。電泳結(jié)束后將凝膠放入考馬斯亮蘭(G-250)染色液中37℃染色1 h。染色完畢后，置于脫色液中多次脫色，直至凝膠的藍(lán)色背景褪清、蛋白質(zhì)條帶清晰為止。待凝膠脫色后，用Tanon凝膠圖像拍攝系統(tǒng)掃描并計算MHC亞型的灰度值和百分比[14]。由于分子量的差異不同可將肌凝蛋白重鏈被分離成四條清晰的條帶(條帶分布呈以下勢：MHCⅠ>MHCⅡb>MHCⅡx>MHCⅡa)[15]。

1.4.3 鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性檢測 采用比色法(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司CaN活性試劑盒)測定骨骼肌組織中CaN的活性。按照說明書操作測定比目魚肌與股四頭肌中CaN活性，實驗重復(fù)3次(n=5)。

1.4.4 骨骼肌組織NFATc1的表達(dá)檢測 采用免疫印跡方法檢測骨骼肌組織中NFATc1的表達(dá)，首先加400 μl單去污劑裂解液裂(含PMSF)入骨骼肌組織中勻漿裂解，后采用BCA法測定各樣品蛋白濃度；隨后進(jìn)行SDS-聚丙烯酸胺凝膠電泳4～5 h，轉(zhuǎn)膜用 1×麗春紅染液染色5 min。一抗孵育：Actin抗體(1∶500稀釋)/NPR-C抗體(1∶100稀釋)；酶標(biāo)：二抗孵育加入5%脫脂奶粉稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的第二抗體(1∶4 000)孵育1.5 h；最后將膜置于ECL 顯色工作液中進(jìn)行顯色。將膠片進(jìn)行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)分析目標(biāo)帶的分子量和凈光密度值[16，17]。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1訓(xùn)練強度對骨骼肌I型和II型肌纖維密度變化的影響

2.1.1 股四頭肌I型和II型肌纖維密度變化 訓(xùn)練后股四頭肌肌纖維密度變化與對照組相比，大強度組II型肌纖維數(shù)密度顯著增加(P<0.05)，I型肌纖維數(shù)密度及II型肌纖維面密度均有所增加，但差異不顯著；中等強度組I、II型肌纖維數(shù)密度顯著增加(P<0.05)，且與大強度運動組相比I、II型肌纖維數(shù)密度顯著增加(P<0.05，表1，圖1)。

GroupArealdensityIIINumberdensityIIINC0．257±0．110．650±0．140．051±0．0060．266±0．046ME0．187±0．020．785±0．090．067±0．002?0．494±0．069?HE0．191±0．110．802±0．05?0．051±0．003#0．341±0．035#

NC: Normal control group; ME: Moderate intensity exercise group; HE: Heavy intensity exercise group

*P<0.05vsNC;#P<0.05vsME

Fig.1Quadricep's ATPase staining figure(×100) A: Normal control group; B: Moderate intensity exercise group; C: Heavy intensity exercise group

2.1.2 比目魚肌I型和II型肌纖維密度變化 訓(xùn)練后比目魚肌肌纖維密度變化與對照組相比，中等強度組和大強度運動組比目魚肌I型肌纖維面密度均增加, 差異無顯著性。中等強度運動組和大強度運動組比目魚肌I型纖維數(shù)密度均增加(P<0.05)，II型纖維數(shù)密度均減少，差異不顯著(表2，圖2)。

2.2 訓(xùn)練強度對骨骼肌MHC亞型百分比的影響

2.2.1 股四頭肌MHC亞型百分比變化情況 與對照組相比，大強度組MHC亞型IIa百分比、IIb百分比顯著降低(P<0.05)，IIx百分比顯著升高(P<0.05)；中等強度組MHC亞型IIb百分比顯著降低(P<0.05)，I百分比、IIa百分比顯著升高(P<0.05)。大強度組與中等強度組相比，MHC亞型I、IIa纖維百分比顯著降低(P<0.05)，MHCIIx百分比顯著升高(P<0.05, 表3)。

GroupArealdensityIIINumberdensityIIINC0．709±0．0140．241±0．0120．168±0．0420．149±0．057ME0．814±0．0480．198±0．110．322±0．025?0．126±0．076HE0．767±0．0470．211±0．130．289±0．011?0．132±0．041

NC: Normal control group; ME: Moderate intensity exercise group; HE: Heavy intensity exercise group

*P<0.05vsNC；#P<0.05vsHE

Fig.2Soleu's ATPase staining figure(×100) A: NC group； B: ME group； C: HE group

Tab. 3 Quadricep's MHC subtype percentage change(%, ±s, n=8)

NC: Normal control group; ME: Moderate intensity exercise group; HE: Heavy intensity exercise group

*P<0.05vsNC；#P<0.05vsME

2.2.2 比目魚肌MHC亞型百分比變化情況 與對照組相比，中等強度組MHC亞型I百分比顯著升高(P<0.01)，IIa、IIb肌百分比顯著降低(P<0.05)；大強度組MHC亞型I型肌纖維百分比顯著升高(P<0.01)，IIx百分比顯著降低(P<0.01)；大強度組與中等強度組相比，MHC亞型IIa百分比升高、MHCIIx百分比顯著降低(P<0.01)，IIb百分比顯著升高(P<0.05，表4)。

GroupMHCIMHCIIaMHCIIxMHCIIbNC62．29±0．4714．2±0．1113．5±0．1710．01±0．48ME69．23±0．55??8．43±0．55?14．46±0．347．88±0．27?HE68．54±1．214．45±1．1##6．33±0．4??##10．68±1．0#

NC: Normal control group; ME: Moderate intensity exercise group; HE: Heavy intensity exercise group

**P<0.01vsNC；#P<0.05,##P<0.01vsME

2.3訓(xùn)練強度對骨骼肌鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶活性的影響

8周訓(xùn)練后，大、中等強度組與對照組相比大鼠股四頭肌鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)活性升高。與對照組相比，大、中等強度組大鼠比目魚肌CaN活性顯著升高(P<0.05，表5)。

GroupQuadricepSoleuNC0．43±0．200．72±0．20ME0．53±0．260．98±0．22?HE0．51±0．210．95±0．18?

*P<0.05vsNC

2.4 訓(xùn)練強度對骨骼肌NFATc1蛋白表達(dá)的影響

中等強度組股四頭肌與比目魚肌NFATc1蛋白含量均顯著升高(P<0.05)，大強度組NFATc1蛋白含量升高。中等強度組與大強度組相比，NFATc1蛋白含量略有升高，但無統(tǒng)計學(xué)意義(表6)。

GroupQuadricepSoleuNC0．877±0．0981．003±0．142ME1．325±0．146?1．457±0．076?HE0．762±0．09781．107±0．166

*P<0.05vsNC

3 討論

本研究結(jié)果顯示：運動可使骨骼肌I、II型肌纖維密度增加，即可使骨骼肌肥大。這與眾多研究結(jié)果一致，Terje等[18]研究發(fā)現(xiàn)自愿者進(jìn)行訓(xùn)練后肌纖維Ⅰ型、Ⅱ型橫截面積均顯著增加；Pilar等[19]研究顯示，12周高強度間歇速度訓(xùn)練后大鼠股直肌Ⅰ、ⅡA、ⅡX纖維的相對橫截面積顯著增大。同時這種變化與運動訓(xùn)練強度、肌纖維類型有關(guān)。本研究中大鼠肌四頭肌II型肌纖維、比目魚肌I型肌纖維選擇性肥大；Hostler等[20]研究顯示，18周大強度遞增負(fù)荷訓(xùn)練可使肌纖維適應(yīng)性肥大，同時在肌纖維類型比例上可使快肌纖維向慢肌纖維轉(zhuǎn)化。

肌纖維轉(zhuǎn)化不是從一個極端快速(快肌纖維)跨越到另一個極端(慢肌纖維)，而是在分子水平中逐級過渡轉(zhuǎn)化的，即肌原纖維蛋白亞型的轉(zhuǎn)變。根據(jù)本研究中MHC亞型百分比的變化，可推測中等強度運動可誘導(dǎo)股四頭肌MHC亞型IIb向I、IIa轉(zhuǎn)化，比目魚肌MHC亞型IIa、IIb向I轉(zhuǎn)化；而大強度運動可誘導(dǎo)股四頭肌MHC亞型IIa、IIb向IIx轉(zhuǎn)化，比目魚肌MHC亞型IIx向I轉(zhuǎn)化。與大部分學(xué)者研究結(jié)果相似，Bruton[21]研究發(fā)現(xiàn)耐力訓(xùn)練可以引起骨骼肌纖維MHC亞型Ⅱx向Ⅱa轉(zhuǎn)變，MHCⅠ表達(dá)增加。逄金柱等[22]研究發(fā)現(xiàn)耐力訓(xùn)練后，股四頭肌MHC亞型IIx、IIa基因表達(dá)顯著增加，但快型MHCIIb和慢型MHCI基因表達(dá)沒有發(fā)生顯著變化。與前人研究也存在一定的差異，張宇[23]等研究發(fā)現(xiàn)小強度運動可引起，即由快型向慢型變化；而中、大強度運動可引起MHC亞型肌纖維向I、IIa、向IIx、Ⅱb方向變化，即由慢型向快型變化。究其原因可能與實驗采取的運動方案有關(guān)，本文中等強度運動為坡度5°，速度18 m/min，而張宇研究中小強度為19 m/min；本研究大強度運動為坡度10°，速度26.8 m/min，而張宇研究中等強度為26 m/min。由此可推斷依據(jù)丁樹哲[10]運動負(fù)荷標(biāo)準(zhǔn)，大、中等強度運動有誘導(dǎo)骨骼肌MHC亞型發(fā)生快型向慢型轉(zhuǎn)化的趨勢。

CaN在骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng)中有選擇性的上調(diào)慢肌纖維啟動子表達(dá)，以及可誘導(dǎo)骨骼肌纖維由慢向快轉(zhuǎn)化[23]。本研究可推測：中等強度運動可以激活CaN活性，引起NFATc1蛋白表達(dá)增加；伴隨著運動引起的骨骼肌快型MHC向慢型MHC轉(zhuǎn)化過程中，CaN同樣發(fā)生了相應(yīng)的變化，CaN信號途徑與運動誘導(dǎo)的骨骼肌纖維類型轉(zhuǎn)化確實存在一定的關(guān)聯(lián)。Delling等[24]通過成肌細(xì)胞培養(yǎng)研究證實鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶信號途徑參與骨骼肌MHCI型的分化與表達(dá)，且對促進(jìn)骨骼肌MHCII型向MHCI型轉(zhuǎn)化具有明顯作用。CaN可以刺激MHCI基因啟動子和MHCI肌纖維分化[25]。有研究表明NFAT可做為神經(jīng)活動的感受器，可對慢型小α運動神經(jīng)元活動有選擇性的應(yīng)答[25]；NFAT在心肌、骨骼細(xì)胞分化與肥大中均有較大的作用，在骨骼肌纖維類型分化NFAT作用主要是基于NFATc1[26]。由此可提示CaN/NFATc1信號對骨骼肌細(xì)胞分化及運動誘導(dǎo)肌纖維轉(zhuǎn)化具有重要生理學(xué)作用，主要角色為促進(jìn)慢肌生長、修復(fù)，抑制快肌MHC基因表達(dá)等。

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TheeffectofdifferentintensityexerciseonskeletalmusclefiberMHCsubtypetransformationandCaN/NFATc1signalingpathways

YIN Li-qin1, 3， LI Fan-ling2+， TANG Chang-fa1△， TAO Xia4， LIU Wen-feng1， HUANG Hong-bo1， DENG Yong1， TANG Lin1

(1. Physical Education， Hunan Norma University Changsha 410012; 2. People's Hospital of Hunan Province， Changsha 410005; 3. Physical Education， Hunan University of Technology, Zhuzhou 412008; 4. Hunan University of Commerce Sports Department， Changsha 410018, China)

Objective: To study the effect of different intensity exercise on skeletal muscle fiber myosin heavy chain(MHC) subtype transformation and CaN/NFATc1 signaling pathways.MethodsTwenty-four Male SD rats (2-month old) were randomly divided into normal control group (NC), moderate intensity exercise group (ME, grade 5°, speed 18 m/min), heavy intensity exercise group (HE, grade 10°, 26.8 m/min). The rats in exercise groups were treated with treadmill training for eight weeks. The type I and type II muscle fibers were determined by ATPase staining method. MHC subtype was separated by SDS-PAGE. The activity of CaN was determined by colorimetric method. The content of NFATc1 protein in skeletal muscle was detected by immune imprinting technology.Results①Skeletal muscle fiber density changes: the type I and II fiber number density of quadriceps in ME group were increased significantly (P<0.05), but in HE group, only the type II fiber surface density was increased significantly (P<0.05). The type I fiber number density of soleus in ME and HE group was increased significantly (P<0.05). ②The changes of fibers MHC subtype percentage in skeletal muscle: the percentages of MHC I and type IIa of quadriceps in ME group were increased (P<0.05), while the percentage of MHC IIb was decrease (P<0.05). The percentage of MHC I in soleus was increased, while the percentages of MHCIIa and IIb were decreased. ③The activity of CaN and the content of NFATc1 protein in ME group were increased significantly (P<0.05).ConclusionThe heavy and moderate intensity exercise may induce skeletal muscle MHC type transforming from fast to slow. At the same time, the activity of CaN and the expression of NFATc1 protein are increased accompanying the changes of skeletal muscle fibers subtype.

calcineurin； myosin heavy chain； nfat； heavy、moderate intensity exercise； rat

G804.2

A

1000-6834(2017)04-360-05

湖南省自然科學(xué)基金資助(14JJ7035)；湖南省研究生科研創(chuàng)新項目課題資助(CX2014B229)

2016-06-03

2016-12-05

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Tel: 0731-88713700； E-mail: Tangchangfa@sina.com；+： 并列第一作者

10.12047/j.cjap.5462.2017.087