程英+胡穎+覃永華+程鋼+王春臺(tái)

摘要：通過生物信息學(xué)分析確定OsV3IP2和OsV3IP3的可溶性肽段，獲得可溶性的OsV3IP2和OsV3IP3外源表達(dá)蛋白質(zhì)，將相應(yīng)的編碼區(qū)克隆于原核表達(dá)載體pET32a中，進(jìn)行IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，利用SDS-PAGE和Western blot檢測(cè)目的蛋白質(zhì)。結(jié)果表明，利用生物信息學(xué)軟件對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，將OsV3IP2、OsV3IP3分別分為2個(gè)和4個(gè)部分。將其分別克隆到pET32a后，采用0.2 mol/L IPTG在10、20、30 ℃誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot分析，證明OsV3IP2-1、OsV3IP 2-2、OsV3IP 3-1表達(dá)的融合蛋白存在于上清液中，而OsV3IP 3-2、OsV3IP 3-3表達(dá)的融合蛋白存在于沉淀中，獲得了OsV3IP2-1、OsV3IP 2-2、OsV3IP 3-1可溶性目的蛋白，為進(jìn)一步體外驗(yàn)證OsVDAC3與OsV3IP2、OsV3IP3的互作奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻；OsV3IP2-3；誘導(dǎo)表達(dá)；SDS PAGE；Western Blot

中圖分類號(hào)：S511；Q812 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）17-3349-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.041

Expressing and Identifying of OsV3IP2 and OsV3IP3 from

Rice in Bacterial Expression Vector

CHENG Ying， HU Ying， QIN Yong-hua， CHENG Gang， WANG Chun-tai

（South-Central University for Nationalities/Hubei provincial Key Laboratory for Protection and Application of Special Plants in Wuling Area of China， Wuhan 430074，China）

Abstract： The bioinformatic analysis was used to identify soluble fragments of OsV3IP2 and OsV3IP3，and soluble OsV3IP2 and OsV3IP3 proteins in bacterial expression systemo were btained. The corresponding coding sequences of different fragments were cloned into bacterial expression vector pET32a. The target peptides were expressed via IPTG induction，and detected by SDS-PAGE and Western blot. Result showed that from the predicted secondary structures，we identified 2 soluble fragments from OsV3IP2 and 4 soluble fragments from OsV3IP3. The expression of recombinant peptides in bacteria was induced in the presence of 0.2 mol/L IPTG at 10，20，or 30 ℃.As shown by SDS-PAGE and Western Blot analysis，OsV3IP2-1，OsV3IP2-2，and OsV3IP3-1 are in the soluble fraction of bacterial lysate，while OsV3IP3-2 and OsV3IP3-3 stay in the precipitation. We have obtained soluble peptides OsV3IP2-1，OsV3IP2-2，and OsV3IP3-1，which laid the foundation for future in vitro studies on protein-protein interactions between OsVDAC3 and OsV3IP2 or OsV3IP3.

Key words： rice；OsV3IP2-3；induced expression；SDS PAGE；western Blot

VDAC是存在于線粒體外膜上的孔道蛋白，能在膜上形成親水性電壓門控通道，是線粒體外膜主要的運(yùn)輸?shù)鞍譡1]。VDAC蛋白廣泛存在于真菌到動(dòng)植物的生物體中，依賴電壓調(diào)節(jié)其對(duì)陰陽離子的選擇性[2，3]。相對(duì)于動(dòng)物和真菌，植物中具有較多的VDAC異構(gòu)體，說明VDAC可能在植物中具有更多的特殊功能[4]。從生物中分離得到VDAC基因時(shí)發(fā)現(xiàn)含有多種異構(gòu)體[4]，酵母只有1種VDAC，人類、鼠、兔等均有3種VDAC，模式植物擬南芥有4種，然而水稻中有8種VDAC[5]。VDAC不同亞型影響著不同的生理功能。胡穎等[6]發(fā)現(xiàn)YTB超表達(dá)OsVDAC3對(duì)水稻的耐鹽性和耐旱性有一定的敏感性。通過基因槍法進(jìn)行亞細(xì)胞定位發(fā)現(xiàn)，OsVDAC3蛋白在細(xì)胞核、細(xì)胞質(zhì)膜和分泌小泡上均有定位，且信號(hào)肽定位在N端[7]。另外，熊杰[8]和劉洋[9]對(duì)OsVDAC3也進(jìn)行了原核和真核表達(dá)分析。武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建了水稻膜系統(tǒng)酵母雙雜交cDNA文庫，并從該文庫中篩選得到了3個(gè)與OsVDAC3互作的蛋白質(zhì)[6]，將其命名為OsV3IP1-3。對(duì)這3個(gè)互作蛋白質(zhì)功能和亞細(xì)胞定位進(jìn)行了預(yù)測(cè)。但它們是否真的同OsVDAC3發(fā)生了相互作用還需要進(jìn)一步驗(yàn)證。由于預(yù)測(cè)的OsV3IP1-3均為膜蛋白質(zhì)，本研究通過生物信息學(xué)分析，將OsV3IP2、OsV3IP3分為不同結(jié)構(gòu)域分別進(jìn)行外源誘導(dǎo)表達(dá)，獲得可溶性肽段，為進(jìn)一步驗(yàn)證它們與OsVDAC3的互作提供基礎(chǔ)。endprint

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料 原核表達(dá)載體pET28a、pET-32a、pGEX-6P-1，大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）與DH5α均由武陵山區(qū)特色資源植物種質(zhì)保護(hù)與利用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.2 試驗(yàn)試劑 限制性內(nèi)切酶QuickCutTM BamH I、QuickCutTM Xho I，T4-DNA連接酶，Ex Taq酶，DL15000和DL2000 DNA Marker均購自Takara公司。DNA凝膠回收和清潔試劑盒均購自Axygen公司。Page RulerTM Prestained Protein Ladder購自Thermo公司。His Tag Mouse Monoclonal Antibody及二抗羊抗鼠購自Abbkine公司。超敏ECL化學(xué)發(fā)光即用型底物購自武漢博士德生物工程有限公司。引物合成及測(cè)序均由昆泰銳生物科技有限公司完成。

1.1.3 試驗(yàn)儀器 C1000 Touch Thermal Cycler型PCR儀和凝膠成像分析儀，購自美國Bio-RAD公司；752N型紫外可見分光光度計(jì)，購自上海精科公司；Centrifuge 5415D、5417R和5810R離心機(jī)，購自德國Eppendoff公司；CR22G高速離心機(jī)，購自日本Hitachi公司；Soniprep 150型超聲破碎儀，購自日本SANYO公司；半干式碳板轉(zhuǎn)移電泳槽、DYY-5型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀和膠片觀察燈，購自北京六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 OsVDAC3及OsV3IP1-3結(jié)構(gòu)分析 利用生物信息學(xué)軟件InterProScan軟件（http：//www.ebi.ac.uk/interpro/search/sequence-search）對(duì)OsVDAC3及OsV3IP1-3蛋白質(zhì)的序列和結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，根據(jù)不同的結(jié)構(gòu)域?qū)⒌鞍踪|(zhì)進(jìn)行拆分，分結(jié)構(gòu)域進(jìn)行蛋白質(zhì)誘導(dǎo)及互作驗(yàn)證。

1.2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建 根據(jù)OsVDAC3和OsV3IP1-3基因序列，設(shè)計(jì)正向和反向引物，并添加對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)。所有引物及序列如表1所示。

采用20 μL體系進(jìn)行PCR反應(yīng)：15.3 μL dd H2O， 2 μL 10 ×Ex Taq Buffer，1 μL dNTP（2.5 mmol/L），0.3 μL 引物F（10 mmol/L），0.3 μL 引物R（10 mmol/L），1 μL pET-32a-OsV3IPs質(zhì)粒DNA，0.1 μL Ex Taq 酶。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性 30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，重復(fù) 34 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增反應(yīng)完成后使用Axy Prep DNA清潔試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行清潔回收，詳細(xì)操作參考試劑盒說明書，并進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。用限制性內(nèi)切酶BamH I和 XhoⅠ雙酶切目的片段和pET-32a空載體，37 ℃酶切3～4 h，使用Axy Prep DNA凝膠回收試劑盒對(duì)酶切產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收。用T4連接酶連接雙酶切后的目的基因和pET-32a載體，16 ℃連接過夜并轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂LB（含Amp+）平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。挑取單克隆，采用堿裂解法提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增和酶切鑒定，將對(duì)應(yīng)陽性克隆菌液送昆泰銳生物科技有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.2.3 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒和pET-32a空載體轉(zhuǎn)化BL21（DE3）表達(dá)菌株，涂LB（含Amp+）平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜。分別挑取單克隆于3 mL含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)過夜，第二天按1∶100的比例（V/V）接種于5 mL含Amp+的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min 振蕩培養(yǎng)至 OD600 nm為0.6左右，將1 mol/L IPTG稀釋到合適的終濃度。以不加IPTG的重組載體和加IPTG的pGEX-6p-1、pET-32a、pET-28a空載體的BL21菌株作為陰性對(duì)照。設(shè)置IPTG濃度梯度、誘導(dǎo)時(shí)間梯度、誘導(dǎo)溫度梯度來分析最適表達(dá)條件。

1.2.4 融合蛋白的SDS-PAGE檢測(cè) 將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液轉(zhuǎn)入10 mL離心管中，4 ℃，4 000 r/min離心20 min，向菌體沉淀中加入適量的PBS buffer重懸菌體，用移液槍反復(fù)吹打混勻。在燒杯中裝入碎冰，將重懸菌體固定其中，進(jìn)行超聲波破碎（破碎10 s，間歇10 s），觀察液體變澄清即可。4 ℃，8 000 r/min離心20 min，收集蛋白質(zhì)上清液和沉淀，分別處理。向沉淀中加入適量的蛋白質(zhì)沉淀變性液，用移液槍吹打混勻，室溫放置約1 h，每隔15 min混勻一次，4 ℃，12 000 r/min離心15 min，收集上清液，此時(shí)的上清液即為沉淀液。將變性蛋白質(zhì)樣品和適量的SDS-PAGE loading buffer混合均勻后瞬時(shí)離心，并在沸水中煮沸10 min變性，放置于冰上冷卻，再次離心，作為上樣產(chǎn)物。60 V恒壓電泳，待指示帶電泳至玻璃板最低端時(shí)停止電泳，進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)染色或Western檢測(cè)。

1.2.5 融合蛋白的Western檢測(cè) 半干式轉(zhuǎn)膜儀80 mA恒流轉(zhuǎn)膜2.5 h后，加入40 mL蛋白封閉液室溫封閉1.0 h，按1∶5 000的比例（V/V）向封閉液中加入His抗體，4 ℃振蕩過夜，第二天按1∶10 000的比例（V/V）向封閉液中加入二抗羊抗鼠，孵育箱內(nèi) 25 ℃振蕩孵育1.5 h后進(jìn)行ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 OsV3IP1-3序列分析

前期試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)pET-32a-OsV3IP2以及pET-28a-OsV3IP1、pET-28a-OsV3IP3在體外表達(dá)不明顯，所以利用生物信息學(xué)軟件對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，根據(jù)InterProScan軟件分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。OsV3IP2分為2個(gè)部分（圖1），OsV3IP2-1包含第46～76個(gè)氨基酸、OsV3IP2-2包含第46～76個(gè)氨基酸。OsV3IP3分為4個(gè)部分（圖2），OsV3IP3-1包含第315～399個(gè)氨基酸、OsV3IP3-2包含第414～623個(gè)氨基酸、OsV3IP3-3包含第30～304個(gè)氨基酸、OsV3IP3-4包含第22～624個(gè)氨基酸。endprint

2.2 原核表達(dá)載體的構(gòu)建

分別以 pET-32a-OsV3IP2-3為模板擴(kuò)增目的片段，與pET32a連接后構(gòu)建原核表達(dá)載體。從轉(zhuǎn)化的平板上隨機(jī)挑取單克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)提取質(zhì)粒，然后對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)。結(jié)果顯示，OsV3IP1-3的PCR產(chǎn)物與預(yù)期的片段大小相符（圖3）。選取大小符合的樣品進(jìn)行DNA序列測(cè)定，序列比對(duì)結(jié)果表明pET32a重組表達(dá)載體構(gòu)建成功。

2.3 融合蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)及Western blot檢測(cè)

將陽性重組質(zhì)粒熱激轉(zhuǎn)化BL21表達(dá)菌株，分別加入不同濃度的IPTG后，于不同溫度條件下振蕩培養(yǎng)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表達(dá)，在誘導(dǎo)不同時(shí)間段取樣8 mL，從而檢測(cè)誘導(dǎo)溫度、誘導(dǎo)IPTG濃度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)的影響。同時(shí)，以不加IPTG的pET-32a空載體的BL21菌株作為陰性對(duì)照。在誘導(dǎo)溫度為20、30 ℃，IPTG濃度為0.2 mmol/L條件下，pET32a-OsV3IP2-1、pET32a-OsV3IP 2-2、pET32a-OsV3IP 3-1表達(dá)的融合蛋白質(zhì)存在于上清液中，而pET32a-OsV3IP 3-2、pET32a-OsV3IP 3-3表達(dá)的融合蛋白質(zhì)存在于沉淀中（圖4），這一結(jié)果進(jìn)一步通過His抗體的Western Blot分析證明。

3 小結(jié)與討論

大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)是目前表達(dá)外源蛋白質(zhì)的首選，利用該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)重組蛋白質(zhì)有許多優(yōu)越性，但表達(dá)的外源蛋白質(zhì)容易被宿主蛋白酶攻擊或未能正確折疊形成包涵體，其表達(dá)受到了限制[10]。當(dāng)外源蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)時(shí)，有些蛋白質(zhì)會(huì)在細(xì)胞質(zhì)中形成不溶性的包涵體，顆粒直徑50～500 nm不等[11]，將靶蛋白質(zhì)融合在某些易于表達(dá)和純化的“融合標(biāo)簽”的N末端或C末端可提高蛋白質(zhì)的高效可溶性表達(dá)。本試驗(yàn)利用生物信息學(xué)軟件對(duì)蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)，根據(jù)InterProScan軟件分析蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，將OsV3IP2、OsV3IP23分別分成2個(gè)和4個(gè)部分分別進(jìn)行體外表達(dá)，在優(yōu)化條件下獲得了可溶性目的蛋白質(zhì)OsV3IP2-1、OsV3IP 2-2、OsV3IP 3-1，這些結(jié)果為體外進(jìn)一步驗(yàn)證OsVDAC3與OsV3IP2、OsV3IP3的互作奠定了基礎(chǔ)。

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