王順陽(yáng)+郝燕+王洪斌+王海+張勝楠

摘要：對(duì)市售的乳酸飲品的乳酸菌進(jìn)行了分離純化，得到菌株HYWZ-6，結(jié)合16S rRNA基因序列分析，確定為瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus），并以溫度、NaCl、膽鹽、pH及檸檬酸三鈉作為影響因素，對(duì)其產(chǎn)VB12進(jìn)行研究，并利用酶聯(lián)免疫分析法對(duì)該菌在不同因素條件下培養(yǎng)100 h后產(chǎn)VB12的含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，HYWZ-6菌株在不同條件下產(chǎn)VB12的差異性較大，35 ℃ VB12的含量最高，25 ℃最低，35 ℃時(shí)含量比25 ℃時(shí)高出175.2%；NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)與VB12的含量呈反比，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)VB12含量最高，7%時(shí)最低，相差224.4%；膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%時(shí)VB12含量達(dá)到最高；pH為4時(shí)VB12含量最高，在pH為7時(shí)VB12含量最低，前者是后者的5.8倍；檸檬酸三鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)VB12的產(chǎn)量最高，比最低產(chǎn)量高出143.2%。

關(guān)鍵詞：瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）；分離鑒定；VB12；影響因素

中圖分類(lèi)號(hào)：Q939.9 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）17-3238-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.012

Isolation and Identification of a Lactobacillus helveticus and Research on the Effect Elements of VB12 Produced by It

WANG Shun-yang1， HAO Yan2， WANG Hong-bin2， WANG Hai2， ZHANG Sheng-nan2

（1.Marine College， Shandong University （Weihai）， Weihai 264209， Shandong， China；

2.Marine Resources Development Institute of Jiangsu， Lianyungang 222005， Jiangsu， China）

Abstract： A bacterial strain called HYWZ-6 was isolated and purified from lactic acid drink，being available in the market， combined with 16S rRNA sequence analysis，it was identified as Lactobacillus helveticus. The influencing factors of VB12 produced by HYWZ-6，such as temperature，NaCl，cholate，pH and trisodium citrate were studied，and the content of VB12 was measured by VB12 enzyme immunoassay after the bacterial strains had been cultivated under different circumstances for 100 hours. The results showed that the bacterial strain HYWZ-6s situation on producing VB12 under different circumstances had relatively huge differences，the content of VB12 would reach maximum at the temperature of 35 ℃，and it would reach the minimum at the temperature of 25 ℃，the discrepancy was 175.2%. The concentration of NaCl was inverse proportion to the content of VB12. When NaCl was 1%，the content of VB12 would reach maximum； when the NaCl was 7%，it would reach the minimum，the discrepancy was 224.4%. The content of VB12 would reach the maximum when cholate was 0.1%. The content of VB12 would reach the maximum when pH was 4，and it would reach the minimum when pH was 7，the former was 5.8 times as much as the latter. The output of VB12 was most when the trisodium citrate was 2.5%，the discrepancy between the highest yield and the lowest yield was 143.2%.

Key words： Lactobacillus helveticus； isolation and identificationm； VB12； influencing factor

存在于有機(jī)體內(nèi)的乳酸菌具有強(qiáng)大的生態(tài)功效，它不僅能夠加快有機(jī)體的生長(zhǎng)速度、調(diào)節(jié)胃腸道中的正常菌群數(shù)、維持有機(jī)體內(nèi)的微生態(tài)系統(tǒng)平衡，還能極大地改善和提高胃腸道功能；另外，還能大幅提升食物消化率和生物效價(jià)；有效降低血清膽固醇的含量，很好地控制內(nèi)毒素的水平；有效抑制胃腸道內(nèi)腐敗細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，增強(qiáng)機(jī)體免疫系統(tǒng)功能等[1，2]。與此同時(shí)，乳酸菌在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、食品和醫(yī)藥等與日常生活緊密相關(guān)的重要領(lǐng)域也有著廣泛的應(yīng)用前景。多數(shù)乳酸菌早已因?yàn)槠涮厥獾囊嫔饔迷絹?lái)越頻繁地出現(xiàn)于醫(yī)療和養(yǎng)生領(lǐng)域，譬如發(fā)酵酸奶、作為微生態(tài)制劑用于胃腸道和用于制作乳酸飲品等[3-5]。endprint

由于大多數(shù)益生菌是經(jīng)口服而在消化道中發(fā)揮作用，所以益生菌不僅要對(duì)動(dòng)物消化道環(huán)境具有強(qiáng)大的耐受性，保持一定數(shù)量的活菌數(shù)，而且，它的代謝產(chǎn)物要參與消化功能的調(diào)節(jié)，影響固有免疫和適應(yīng)性免疫[6]。近年來(lái)，人們對(duì)乳酸菌代謝產(chǎn)物提取的研究予以前所未有的重視。研究表明一些乳酸菌具有產(chǎn)VB12的特性，乳酸菌產(chǎn)VB12可避免有些菌株在生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的毒素和不良物質(zhì)等[7]。本研究對(duì)市售的乳酸飲品的乳酸菌進(jìn)行了分離純化，結(jié)合16S rRNA基因序列分析，最終確定為瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus），并對(duì)其產(chǎn)VB12的影響因素進(jìn)行了探討，旨在為深入研究該菌株對(duì)人類(lèi)機(jī)體免疫功能潛力提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗(yàn)菌株 HYWZ-6從乳酸飲品（連云港東農(nóng)乳業(yè)）中分離得到。

1.1.2 緩沖液與常用試劑 基因組DNA提取試劑盒、蛋白酶K、Taq酶、PCR試劑、DNA Marker、溶菌酶等購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；VB12 ELISA KIT購(gòu)自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基 ①牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。牛肉膏3.0 g，蛋白胨 10.0 g，NaCl 10.0 g，瓊脂20.0 g，去離子水1 000 mL，pH 7.2，121 ℃滅菌20 min；②MRS培養(yǎng)基[8]。大豆蛋白胨 10.0 g，C6H12O6 20.0 g，牛肉膏10.0 g，吐溫-80 1.0 g，酵母粉5.0 g，K2HPO4 2.0 g，乙酸鈉5.0 g，檸檬酸三鈉 2.0 g，MgSO4 0.2 g，MnSO4 0.054 g，去離子水1 000 mL，瓊脂粉20.0 g，pH 6.5， 121 ℃滅菌15 min。

1.2.2 乳酸菌的分離純化 取適量乳酸樣品接種到牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，37 ℃恒溫振蕩培養(yǎng) 48 h，適量菌液用滅菌生理鹽水依次稀釋為10-1、 10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，充分混勻，選取10-4、10-5和10-6 3個(gè)稀釋梯度的菌液涂布于牛肉膏蛋白胨平板上，倒置，37 ℃培養(yǎng)48 h。純化得到1株優(yōu)勢(shì)菌，命名為HYWZ-6，接種到MRS液體培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的菌株標(biāo)記，4 ℃保存[9]。

1.2.3 HYWZ-6基因組DNA提取及16S rRNA擴(kuò)增 HYWZ-6基因組DNA提取采用試劑盒提取；以HYWZ-6基因組DNA為模板，以27F：5′-AGAG TTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACC TTGTTACGACGACTT-3′[10]為引物進(jìn)行16S rRNA PCR擴(kuò)增。PCR體系為去離子水39 μL，Buffer 5 μL，dNTPs 2 μL，模板樣液1 μL，引物27F 1 μL，引物1492R 1 μL，Taq酶 1 μL。PCR程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，53℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，35個(gè)循環(huán)。瓊脂糖電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，PCR產(chǎn)物送至上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序，序列登錄GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行Blast序列比對(duì)，用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)并分析確定其種屬[11]。

1.2.4 樣品處理及VB12檢測(cè) HYWZ-6接種于MRS液體培養(yǎng)基，混合均勻，37 ℃培養(yǎng)24 h，操作2次，活化菌株。按質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的菌種量接種于10 mL MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃下培養(yǎng)100 h，使其代謝產(chǎn)物的積累達(dá)到極值，再將磷酸氫二鈉1.3 g、亞硫酸氫鈉1.0 g、檸檬酸1.2 g用100 mL去離子水溶解，取目的培養(yǎng)液5 mL，用10 mL上述溶液混合后，再用去離子水定容至150 mL，置于121 ℃下水解10 min，冷卻后用HCl調(diào)節(jié)pH至4.5，再用去離子水按比例稀釋1 000倍，即為待測(cè)樣品[12]。VB12標(biāo)準(zhǔn)曲線制作及VB12含量的酶聯(lián)免疫檢測(cè)依據(jù)VB12 ELISA KIT（上海酶聯(lián)生物科技有限公司）說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.5 HYWZ-6產(chǎn)VB12影響因素的研究 0.5 mL的供試菌液分別接種到5 mL MRS液體培養(yǎng)基的試管中，混合均勻，分別置于25、30、35、40、45 ℃的水浴鍋中水浴0.5 h，取出后37 ℃培養(yǎng)100 h，使其代謝產(chǎn)物的積累達(dá)到極值，用酶聯(lián)免疫分析法于450 nm波長(zhǎng)下對(duì)不同溫度下的吸光度（OD）進(jìn)行測(cè)定，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線后根據(jù)樣品中VB12的OD計(jì)算樣品中VB12的濃度，以分析不同溫度對(duì)VB12產(chǎn)量的影響。

參照上述方法，分別設(shè)置1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%的NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)/（m/V）梯度；0.1%、0.2%、0.3%、0.4%和1.0%的膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)/（m/V）梯度；3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0的pH梯度；0.5%、1.0%、1.5%、2.0%和2.5%的檸檬酸三鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)/（m/V）梯度。酶聯(lián)免疫分析法檢測(cè)HYWZ-6菌株產(chǎn)VB12的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 HYWZ-6菌株基因組DNA及16S rRNA擴(kuò)增結(jié)果

對(duì)HYWZ-6菌株基因組DNA及16S rRNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，由圖1可以看出，提取的基因組DNA純度較高、完整性也較好，能夠滿足后續(xù)試驗(yàn)的要求。

由圖2可知，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，得到一條清晰的條帶，特異性較強(qiáng)，純化后進(jìn)行測(cè)序。

2.2 16S rRNA的測(cè)序結(jié)果及進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建

據(jù)上海桑尼生物科技有限公司16S rRNA的測(cè)序結(jié)果，圖4為MEGR5.0軟件用鄰接法建立起來(lái)的HYWZ-6菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，經(jīng)分析確定該菌株為瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）。endprint

2.3 HYWZ-6菌株產(chǎn)VB12的影響因素

2.3.1 VB12濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 采用酶聯(lián)免疫分析法制作的VB12濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4所示，R2為0.994 2，相關(guān)性較強(qiáng)。

2.3.2 溫度對(duì)HYWZ-6菌株產(chǎn)VB12的影響 不同溫度影響試驗(yàn)菌株產(chǎn)VB12的結(jié)果見(jiàn)圖5。在不同溫度下HYWZ-6菌株都能產(chǎn)生一定量的VB12，但在35 ℃下VB12的產(chǎn)量最高，25 ℃下VB12的產(chǎn)量最低。35 ℃時(shí)的產(chǎn)量比25 ℃時(shí)的產(chǎn)量高出175.2%。

2.3.3 NaCl對(duì)HYWZ-6菌株產(chǎn)VB12的影響 不同NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響試驗(yàn)菌株產(chǎn)VB12的結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可知，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)與VB12的產(chǎn)量呈反比，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%時(shí)VB12的產(chǎn)量最高，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為7%時(shí)VB12的產(chǎn)量最低，最高產(chǎn)量比最低產(chǎn)量高出224.4%。

2.3.4 膽鹽對(duì)HYWZ-6菌株產(chǎn)VB12的影響 不同膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)影響試驗(yàn)菌株產(chǎn)VB12的結(jié)果見(jiàn)圖7。在不同膽鹽質(zhì)量分?jǐn)?shù)下VB12的產(chǎn)量都較高，但在0.2%時(shí)VB12的產(chǎn)量略微偏低，在0.1%時(shí)VB12的產(chǎn)量達(dá)到最高，VB12的最高產(chǎn)量比最低產(chǎn)量高173.6%。

2.3.5 pH對(duì)HYWZ-6菌株產(chǎn)VB12的影響 不同pH影響試驗(yàn)菌株產(chǎn)VB12的結(jié)果見(jiàn)圖8。由圖8可見(jiàn)，不同pH對(duì)試驗(yàn)菌株產(chǎn)VB12的影響較為明顯，在pH為4時(shí)VB12的產(chǎn)量達(dá)到最高，在pH為3和5時(shí)VB12的產(chǎn)量較高，在pH為6、7、8時(shí)VB12的產(chǎn)量均較低?？傮w上，VB12的最高產(chǎn)量是最低產(chǎn)量的5.8倍。

2.3.6 檸檬酸三鈉對(duì)HYWZ-6菌株產(chǎn)VB12的影響

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)的檸檬酸三鈉影響試驗(yàn)菌株產(chǎn)VB12的結(jié)果見(jiàn)圖14。試驗(yàn)菌株在不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)檸檬酸三鈉下的VB12產(chǎn)量均較高，但當(dāng)檸檬酸三鈉加到一定量時(shí)，VB12的產(chǎn)量可達(dá)到最大。檸檬酸三鈉質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2.5%時(shí)的產(chǎn)量最高，比最低產(chǎn)量高出143.2%。

3 討論

乳酸菌是目前食品工業(yè)領(lǐng)域前途廣闊的微生物之一，一旦人們對(duì)于這類(lèi)菌種的作用機(jī)理和生長(zhǎng)規(guī)律有了較為深切的了解，將有助于拓展乳酸菌的應(yīng)用范圍，這一點(diǎn)會(huì)為人類(lèi)食品的多樣化做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)[13]。

本研究對(duì)市售的小樣乳酸飲品的乳酸菌進(jìn)行了分離純化，純化后的瑞士乳桿菌的菌落形狀近似圓形，直徑約為2～3 mm，不透明，呈白色或淺灰色。瑞士乳桿菌具有較好的耐熱性，能夠生存的溫度范圍較廣，一般為15～45 ℃，最佳的生活溫度在42 ℃[11]。本研究分離得到的HYWZ-6菌株能耐受60 ℃的高溫，耐熱性比預(yù)期更強(qiáng)（結(jié)果未顯示）。

研究表明，人體胃液中的酸堿度會(huì)隨著飲食結(jié)構(gòu)的調(diào)整而上下浮動(dòng)，正常情形下的pH大概在3.0左右，人不吃東西或者是吃了較酸的食物之后，胃液的酸性會(huì)變得更強(qiáng)，pH可下降到1.5，吃了堿性較高的食物之后，胃液的pH也能夠上升到4.0～5.0，而食物在胃中通過(guò)的時(shí)間只有1～2 h[14]。由此可見(jiàn)，益生乳酸菌的耐酸堿性強(qiáng)度是決定其發(fā)揮生理功能的關(guān)鍵因素。該試驗(yàn)菌株在不同pH下均有一定的生長(zhǎng)量，但在pH為7～8時(shí)菌株的生長(zhǎng)量有極大提高，此外，在pH為4時(shí)VB12的產(chǎn)量可達(dá)到最高。綜上所述，瑞士乳桿菌有一定的耐酸性，在偏中性的環(huán)境中生長(zhǎng)較好，可用于制作乳制飲料，發(fā)揮其特有的生理功能。

瑞士乳桿菌是一種常見(jiàn)的乳酸菌，主要用于干酪、酸乳等發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)。有研究表明，瑞士乳桿菌與其他微生物聯(lián)用，用于水產(chǎn)動(dòng)物的免疫調(diào)節(jié)及水質(zhì)改善[15]。近年來(lái)，關(guān)于瑞士乳桿菌在發(fā)酵乳制品方面的研究越來(lái)越廣泛，因?yàn)槿鹗咳闂U菌的細(xì)胞壁蛋白酶可以水解乳蛋白產(chǎn)生血管緊張素轉(zhuǎn)移酶抑制肽（ACE抑制肽），能有效降低血壓[13]。然而，關(guān)于瑞士乳桿菌產(chǎn)VB12的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究對(duì)分離到的瑞士乳桿菌（HYWZ-6菌株）產(chǎn)VB12的益生性能作了初步研究，重點(diǎn)探討了該菌產(chǎn)VB12的影響因素，結(jié)果顯示瑞士乳桿菌可以作為益生菌株以開(kāi)發(fā)新的益生菌制品。

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