曾慶華+孫小凡+樊琛+齊鑫+李燕+葉勇+劉軍海+曾慶梅

摘要：為了優(yōu)化金櫻子（Rosa laevigata Michx.）多糖的提取工藝，采用微波輔助提取方法，以去離子水為溶劑提取金櫻子中多糖成分，并以多糖成分提取率為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)來(lái)探討和優(yōu)化金櫻子多糖的提取工藝，得到金櫻子多糖的最佳提取工藝條件為微波時(shí)間3.5 min，微波功率438 W，料液比為1∶27（g∶mL），浸提1次。在此提取工藝條件下，金櫻子多糖實(shí)際提取率可達(dá)52.0%。

關(guān)鍵詞：金櫻子（Rosa laevigata Michx.）；多糖；微波輔助法；單因素試驗(yàn)；響應(yīng)面試驗(yàn)

中圖分類號(hào)：TS207.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）17-3314-06

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.032

Optimization of Polysaccharide from Rosa laevigata Michx. Extraction Using Microwave Extraction by Response Surface Methodology

ZENG Qing-hua1，2，SUN Xiao-fan1，F(xiàn)AN Chen1，QI Xin1，LI Yan1，YE Yong2，LIU Jun-hai1，ZENG Qing-mei2

（1.Department of Food Science and Engineering，Liaocheng University，Liaocheng 252059，Shandong，China；

2.School of Food Science and Engineering，Hefei University of Technology，Hefei 230009，China）

Abstract： In order to optimize the extraction process of polysaccharide from Rosa laevigata Michx.，the method of microwave-assisted extraction technology was adopted by using distilled water as the solvent and the extraction rate of polysaccharide as the index. Microwave time，microwave power， ratio of material to liquid and microwave extraction times were studied. Based on the single factor experiment，the extraction process of polysaccharide from Rosa laevigata Michx. polysaccharide was optimized by using the central combination experiment design. The influence factor of the process was determined by regression analysis，and the extraction rate of polysaccharide was determined by the factor of 3. The results showed that the optimum extraction conditions were as follows：the ratio of material to liquid of 1∶27（g∶mL），microwave time of 3.5 min，microwave power of 438 W，extraction of 1 time，the actual extraction rate of polysaccharide was 52.0%.

Key words： Rosa laevigata Michx.；polysaccharide；microwave-assisted extraction；single factor experiments；response surface methodology

金櫻子（Rosa laevigata Michx.），又名糖罐子、白玉帶、黃茶瓶、刺頭、倒掛金鉤等，是薔薇科薔薇屬的一種野生常綠蔓性灌木。其適宜生長(zhǎng)環(huán)境對(duì)土壤要求不嚴(yán)，陽(yáng)坡為宜，喜歡溫暖濕潤(rùn)和陽(yáng)光充足的環(huán)境，主要分布在中國(guó)華東、華中、華南及西南等地[1]，貴州最為豐富。其果實(shí)可以入藥，具有補(bǔ)腎、利尿的作用，2015年版第一部《中國(guó)藥典》[2]將金櫻子果實(shí)收錄其中；其葉有消腫、解毒的作用；根藥用可以活血散瘀、拔毒驅(qū)濕?！侗静菥V目》記載金櫻子“性酸、澀、平，無(wú)毒；主治脾瀉下痢、止小便利、澀精氣；久服，令人耐寒輕身，補(bǔ)血益精有奇效”[3]。在醫(yī)學(xué)上，金櫻子可以用于治療神經(jīng)衰弱、抑菌消毒、腹瀉、高血壓病、慢性腎炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、皮膚癌、早期宮頸癌等病癥[4-7]。研究表明，金櫻子的活性成分可以促進(jìn)心肌細(xì)胞生成，對(duì)治療心肌梗死有良好效果[8]，其提取物對(duì)痤瘡丙酸桿菌和脂多糖誘導(dǎo)的急性肝損傷也有顯著作用[9]。2002年，中國(guó)衛(wèi)生部又公布金櫻子為可用于保健食品的原料[10]。另外還有研究證明，金櫻子的果實(shí)中含有豐富的黃酮、金櫻子多糖等物質(zhì)，這些物質(zhì)不但可以起到明顯的清除自由基、抗炎的作用，而且可以提高機(jī)體免疫力。所以金櫻子被廣泛應(yīng)用于保健食品和醫(yī)藥領(lǐng)域，具有廣闊的市場(chǎng)前景。

多糖是金櫻子的重要營(yíng)養(yǎng)成分之一，對(duì)于金櫻子多糖的研究越來(lái)越多，也證明了其活性和作用。張庭廷等[11]研究證明了金櫻子多糖對(duì)于常見細(xì)菌如大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等具有很強(qiáng)的抗菌活性，且對(duì)二甲苯引起小鼠的毛細(xì)血管通透性增強(qiáng)等炎癥有顯著的抑制作用。研究還發(fā)現(xiàn)金櫻子多糖具有調(diào)節(jié)血脂、降血膽固醇、抗氧化、抗病毒等作用，臨床上對(duì)普通感冒、燙傷燒傷、直腸壁下移及各種婦科疾病等取得較好的治療效果[12，13]。目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)金櫻子多糖的藥理作用、化學(xué)成分研究的比較深入，而對(duì)于其提取純化工藝的研究還處于初級(jí)階段，提取工藝仍有很多不足，如提取效率較低、操作成本較高、控制條件嚴(yán)苛等。因此，優(yōu)化金櫻子多糖提取工藝，降低成本、簡(jiǎn)化操作，同時(shí)保證金櫻子多糖的質(zhì)量，是目前研究金櫻子多糖提取工藝的目標(biāo)。endprint

金櫻子多糖為大分子化合物，易溶于水，通常采用水提醇沉法[14]、堿提取法[15]、酸提取法[16]，但前者所用時(shí)間較長(zhǎng)，提取率也不高；而后兩者由于多糖不耐酸堿，會(huì)使部分多糖分解，所以也存在一定的不足?，F(xiàn)發(fā)展出用超聲波和微波輔助多糖提取法，微波輔助提取法節(jié)省溶劑、用時(shí)短、提取率高[17，18]。文全泰等[19]利用纖維素酶提取金櫻子多糖，正交設(shè)計(jì)優(yōu)化的酶解法在一定程度上提高了多糖的提取率，但成本太高，對(duì)于溫度的控制要求也嚴(yán)格。潘廷啟等[20]利用超聲波輔助提取金櫻子多糖，不僅增加了提取率、縮短了提取時(shí)間，還避免了高溫對(duì)提取成分的影響。試驗(yàn)證明，超聲波輔助法用于提取多糖能夠明顯提高多糖的提取率，提取時(shí)間短，可以簡(jiǎn)化提取流程、減少雜質(zhì)、節(jié)約成本，在實(shí)際操作中具有很大的優(yōu)點(diǎn)。本研究采用響應(yīng)面試驗(yàn)確定微波輔助法浸漬提取工藝中各因素的最佳參數(shù)，旨在為大規(guī)模工業(yè)化提取金櫻子多糖提供方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金櫻子：產(chǎn)地山東，購(gòu)于山東聊城市利民大藥店；苯酚、硫酸、甲醇等試劑均為分析純；葡萄糖；去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

微波合成/萃取工作站（上海新儀微波化學(xué)科技有限公司）、TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限公司）、電子天平（奧豪斯國(guó)際貿(mào)易上海有限公司）、超聲波清洗器、循環(huán)水式多用真空泵、100 mL微波儀專用三頸燒瓶、10 mL容量瓶、100 mL容量瓶。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 金櫻子多糖成分的提取方法

1）金櫻子多糖提取工藝流程：干燥的金櫻子→粉碎后過20目篩→用去離子水浸泡提取→微波提取→抽濾→濾液進(jìn)行定容→測(cè)定吸光度[21]。

2）金櫻子多糖提取操作要點(diǎn)：將干燥的金櫻子樣品用中藥粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，然后過20目篩。稱取粉碎過篩后的樣品2.000 0 g，加入100 mL微波儀專用燒瓶中，最后加入一定料液比的去離子水，浸泡12 h后，在設(shè)定參數(shù)下進(jìn)行微波提取，提取后進(jìn)行抽濾，得到的濾液用去離子水定容到100 mL容量瓶中，搖勻。取上述溶液0.1 mL加入10 mL刻度試管中，調(diào)節(jié)水浴鍋溫度到99 ℃，將試管放入水浴鍋中將水分蒸干，加甲醇1 mL溶解備用。

1.3.2 定量分析

1）標(biāo)準(zhǔn)曲線制備：葡萄糖于105 ℃下干燥至恒重，并準(zhǔn)確稱取36.6 mg，于100 mL容量瓶中，去離子水溶解并定容、搖勻，得到葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液。精密吸取葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，分別置于10 mL容量瓶中，然后分別加入去離子水補(bǔ)至2 mL，然后再分別加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻，在40 ℃水浴鍋中水浴15 min，然后用冷水冷卻10 min，同時(shí)以2.0 mL去離子水為空白，用分光光度計(jì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長(zhǎng)480 nm下的吸光度并記錄，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程C=19.800A-0.857 3，相關(guān)系數(shù)r=0.992[22]。

2）金櫻子多糖提取液的測(cè)定：采用苯酚-硫酸法，精密吸取樣品溶液1.0 mL置于100 mL容量瓶中，并加水稀釋定容，再吸取1 mL到另一100 mL容量瓶中。然后精密量取1 mL置于10 mL容量瓶中，加去離子水補(bǔ)至2 mL，再加入5%苯酚溶液1.0 mL，搖勻，迅速加入5.0 mL濃硫酸，搖勻，在40 ℃水浴鍋中水浴15 min，然后用冷水冷卻10 min，同時(shí)以2.0 mL去離子水為空白，用分光光度計(jì)測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液在波長(zhǎng)480 nm下的吸光度并記錄，多糖提取率用以下公式計(jì)算：

1.3.3 單因素試驗(yàn)

1）微波時(shí)間對(duì)金櫻子多糖提取率的影響。準(zhǔn)確稱取2.00 g金櫻子粉末置于100 mL微波儀專用三頸燒瓶中，固定微波功率為400 W，料液比為1∶20（g∶mL，下同），提取次數(shù)為1次。在微波中加熱回流，微波時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6 min。按照上述條件和步驟分別提取。

2）微波功率對(duì)金櫻子多糖提取率的影響。準(zhǔn)確稱取2.00 g金櫻子粉末置于100 mL微波儀專用三頸燒瓶中，固定微波時(shí)間為3 min，料液比為1∶20，提取次數(shù)為1次。在微波中加熱回流，微波功率分別為100、200、300、400、500、600、700 W。按照上述條件和步驟分別提取。

3）料液比對(duì)金櫻子多糖提取率的影響。準(zhǔn)確稱取2.00 g金櫻子粉末置于100 mL微波儀專用三頸燒瓶中，固定微波時(shí)間為3 min，微波功率為400 W，提取次數(shù)為1次。在微波中加熱回流，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35。按照上述條件和步驟分別提取。

4）提取次數(shù)對(duì)金櫻子多糖提取率的影響。準(zhǔn)確稱取2.00 g金櫻子粉末置于100 mL微波儀專用三頸燒瓶中，固定微波時(shí)間為3 min，微波功率為400 W，料液比為1∶20。在微波中加熱回流，提取次數(shù)分別為1、2、3、4次。按照上述條件和步驟分別提取。

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn) 根據(jù)單因素試驗(yàn)和金櫻子多糖常規(guī)提取方法選定微波時(shí)間、料液比、微波功率作為考察的因素，固定提取次數(shù)為1次，以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，采用三因素三水平響應(yīng)面法（表1），對(duì)金櫻子多糖的微波提取進(jìn)行分析優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 微波輔助法提取金櫻子多糖的單因素試驗(yàn)

2.1.1 微波時(shí)間對(duì)金櫻子多糖提取率的影響 由圖1可以看出，起初延長(zhǎng)加熱時(shí)間可以促進(jìn)多糖的溶解，4 min左右多糖提取率達(dá)到最高值，繼續(xù)加熱，由于易發(fā)生多糖水解，導(dǎo)致提取率下降，從節(jié)約能源、保證金櫻子多糖質(zhì)量方面考慮，微波時(shí)間在4 min左右為宜。

2.1.2 微波功率對(duì)金櫻子多糖提取率的影響 由圖2可以看出，在微波功率為400 W時(shí)多糖的提取率最大。由于多糖在提取過程中可以發(fā)生水解反應(yīng)，且微波容易破壞生物質(zhì)，從而改變多糖的性質(zhì)，因此試驗(yàn)功率在400 W左右，可得到提取率較高的多糖。endprint

2.1.3 料液比對(duì)金櫻子多糖提取率的影響 由圖3可以看出，料液比對(duì)金櫻子多糖提取率具有明顯影響，隨著料液比增加，多糖擴(kuò)散溶解速度加快，但料液比過大會(huì)導(dǎo)致后續(xù)蒸發(fā)時(shí)間過長(zhǎng)。由圖3可知，隨著料液比的增大，提取率緩慢增加，但到達(dá)1∶25時(shí)基本達(dá)到最大，繼續(xù)增加則提取率變化不穩(wěn)定，所以料液比以1∶25左右為宜。

2.1.4 提取次數(shù)對(duì)金櫻子多糖提取率的影響 由圖4可以看出，隨著提取次數(shù)的增多能增加金櫻子多糖的提取總量，在提取兩次后，提取率已接近一常數(shù)，但從節(jié)省能耗、簡(jiǎn)化操作以及減少提取時(shí)間等方面考慮，提取次數(shù)取1次為宜[23，24]。

2.2 微波輔助法提取金櫻子多糖的響應(yīng)面試驗(yàn)

由以上單因素試驗(yàn)影響結(jié)果分析，固定提取次數(shù)為1次，選取微波時(shí)間、料液比和微波功率為影響金櫻子多糖提取率的3個(gè)因素，根據(jù)Box.Benhnken的中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上進(jìn)行三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)。

對(duì)微波時(shí)間、料液比、微波功率作如下變換X1=（t-4）/1，X2=（z-25）/5，X3=（w-400）/100，在試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果中，其中析因試驗(yàn)為1～12，中心試驗(yàn)為13～15，以校正試驗(yàn)結(jié)果、減少試驗(yàn)誤差。式中t、z、w分別表示微波時(shí)間、料液比、微波功率的真實(shí)值，采用SAS RSREG程序進(jìn)行響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果如表2所示。

使用The SAS System 8.0程序?qū)憫?yīng)值與各因素進(jìn)行回歸擬合，分析試驗(yàn)結(jié)果得到其響應(yīng)面與等高線，見圖5～圖7。

由圖5可知，當(dāng)微波功率一定時(shí)，提取率隨微波時(shí)間與料液比的變化趨勢(shì)明顯，先升高后降低，達(dá)到最高點(diǎn)后明顯下降。

由圖6可知，當(dāng)料液比一定時(shí)，提取率隨微波時(shí)間與微波功率的變化趨勢(shì)明顯，先升高后降低，達(dá)到最高點(diǎn)后明顯下降。

由圖7可知，當(dāng)微波時(shí)間一定時(shí)，提取率隨料液比與微波功率的變化趨勢(shì)明顯，先升高后降低，達(dá)到最高點(diǎn)后明顯下降。

由表3可知，回歸模型也是顯著的。該模型相關(guān)系數(shù)R2=98.32%，說(shuō)明該模型與實(shí)際試驗(yàn)擬合度較高。因此，回歸方程可以較好地描述料液比、微波時(shí)間和微波功率對(duì)多糖提取率的實(shí)際影響，可利用回歸方程確定最佳工藝條件。

回歸方程：Y1=0.521-0.024 375X1+0.038 5X2+0.077 875X3-0.037 5X12-0.002 25X1X2-0.023 5X1X3-0.056 25X22+0.037 25X2X3-0.141X32。對(duì)回歸方程取一階偏導(dǎo)數(shù)等于零，整理可得如下三式：

0=-0.024 375-2×0.037 5X1-0.002 25X2-0.023 5X3

（1）

0=0.038 5-0.002 25X1-2×0.056 25X2+0.037 25X3

（2）

0=0.077 875-0.023 5X1+0.037 25X2-2×0.141X3

（3）

式（1）、（2）、（3）聯(lián)立方程組，解得X1=-0.457 49，X2=0.476 263，X3=0.377 187，代入前述的變換公式得到，微波時(shí)間t=3.542 5 min，料液比z=1∶27.381 3，微波功率w=437.718 7 W，將所得值修正即得多糖提取工藝最佳條件為料液比1∶27，微波功率438 W，微波時(shí)間提取3.5 min，提取1次。在此修正條件下，實(shí)際測(cè)得提取率為52.0%。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

由響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析可以得到，微波輔助法提取金櫻子多糖成分的最佳工藝條件為料液比 1∶27，微波功率438 W，微波時(shí)間提取3.5 min，提取1次。為進(jìn)一步精確試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，獲得吸光度，按照公式計(jì)算得到，在此條件下金櫻子多糖成分的3次平均提取率為51.9%。

3 結(jié)論

采用微波輔助提取方法，用去離子水為溶劑提取金櫻子中多糖成分，并以多糖成分提取率為考察指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)來(lái)探討和優(yōu)化金櫻子多糖的提取工藝，最后得出金櫻子多糖的最佳提取工藝條件為微波時(shí)間3.5 min，微波功率438 W，料液比為1∶27，浸提1次。在此提取工藝條件下，金櫻子多糖實(shí)際一次提取率可達(dá)52.0%。但其含量測(cè)定方法是用的紫外分光光度計(jì)法，因試驗(yàn)試劑欠缺，此方法測(cè)定含量結(jié)果偏低，不過在一定程度上能反映多糖的含量[26]。

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