査中萍+杜雪樹(shù)+萬(wàn)丙良+殷得所+李進(jìn)波+夏明元+戚華雄

摘要：以秈粳交品種甬優(yōu)4949為材料進(jìn)行花藥培養(yǎng)，建立了秈粳交DH群體，并對(duì)豐產(chǎn)性較好的DH系進(jìn)行廣親和基因S5n的PCR檢測(cè)，獲得了含有廣親和基因S5n的DH系材料。

關(guān)鍵詞：水稻（Oryza sativa L.）；花藥培養(yǎng)；秈粳交；廣親和

中圖分類(lèi)號(hào)：S511 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）17-3213-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.17.004

Rapid Breeding of Wide Compatibility Rice Materials by Anther Culture

ZHA Zhong-ping， DU Xue-shu， WAN Bing-liang， YIN De-suo， LI Jin-bo， XIA Ming-yuan， QI Hua-xiong

（Food Crops Institute， Hubei Academy of Agricultural Sciences/Hubei Key Laboratory of Food Crop Germplasm and Genetic Improvement， Wuhan 430064， China）

Abstract： DH population was got by anther culture from Yongyou 4949， which is a indica-japonica hybrid rice. The wide compatibility gene S5n were detected by PCR in the DH lines with high yield potential and the DH lines with wide compatibility gene S5n were obtained.

Key words： rice （Oryza sativa L.）； anther culture； indica-japonica hybrid； wide compatibility

水稻（Oryza sativa L.）是世界上重要的糧食作物之一，在其長(zhǎng)期的栽培馴化過(guò)程中形成了秈、粳2個(gè)亞種[1-5]，亞種間的雜種一代具有強(qiáng)大的雜種優(yōu)勢(shì)，水稻秈、粳亞種間雜種優(yōu)勢(shì)的利用是進(jìn)一步提高水稻單產(chǎn)的重要途徑之一。但秈、粳亞種間雜種一般結(jié)實(shí)率偏低、子粒充實(shí)度差，這些問(wèn)題制約了亞種間雜交稻的利用[6]。水稻廣親和基因S5n可克服秈粳生殖障礙，與秈稻或粳稻亞種雜交能產(chǎn)生正常可育的后代[7]。培育和利用廣親和水稻品種是促進(jìn)水稻秈粳雜種優(yōu)勢(shì)、進(jìn)一步提高水稻產(chǎn)量的當(dāng)務(wù)之急。但已知的廣親和品種多為農(nóng)藝性狀欠佳的農(nóng)家品種，不能直接作為親本使用；而常規(guī)育種方法選育優(yōu)良性狀的廣親和品種需要雜交、回交、轉(zhuǎn)育，耗時(shí)冗長(zhǎng)，育種周期長(zhǎng)。近年來(lái)育種家們育成了甬優(yōu)12、浙優(yōu)18、春優(yōu)84[8-11]等一批綜合性狀優(yōu)良的秈粳亞種間組合，為進(jìn)一步利用秈粳間雜種優(yōu)勢(shì)奠定了良好的基礎(chǔ)。

水稻花藥培養(yǎng)可以快速獲得純系、提高選擇效率、有效縮短育種周期。試驗(yàn)以目前生產(chǎn)上優(yōu)良的秈粳組合甬優(yōu)4949為材料，利用水稻花藥培養(yǎng)方法獲得純合DH（雙單倍體）系，并對(duì)DH系進(jìn)行廣親和基因S5n的PCR檢測(cè)，為快速選育廣親和水稻材料提供了一條有效途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

甬優(yōu)4949是由寧波市種子有限公司和武漢佳禾生物科技有限責(zé)任公司培育的三系秈粳雜交中稻品種。2015年通過(guò)湖北省農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定。本試驗(yàn)所用甬優(yōu)4949由武漢佳禾生物科技有限責(zé)任公司提供。

1.2 方法

1.2.1 水稻材料種植 2015年春季在武漢分期播種，大田移栽，以獲得足夠發(fā)育時(shí)期適宜的花藥。具體分期播種和移栽時(shí)間見(jiàn)表1。

1.2.2 花藥取材 2015年7月起，分期播種的甬優(yōu)4949依次進(jìn)入孕穗期。于晴天的下午取單核靠邊期的幼穗，為保證幼穗新鮮，取樣時(shí)幼穗留2節(jié)及2～3片葉片，放在盛有清水的桶中。取好的幼穗在室內(nèi)顯微鏡下觀察花粉母細(xì)胞發(fā)育時(shí)期。

1.2.3 預(yù)處理 田間取回的幼穗在實(shí)驗(yàn)室里重新修剪，保留幼穗2葉1節(jié)，75%乙醇表面消毒后，用保鮮膜包好幼穗，放在4 ℃冰箱中預(yù)處理7～10 d。

1.2.4 誘導(dǎo)培養(yǎng) 預(yù)處理結(jié)束后，剝?nèi)ザ嘤嗳~片和葉鞘，留取發(fā)育適宜的帶枝小穗，裝入無(wú)菌燒杯中，先用75%乙醇表面消毒30 s，再用0.1% HgCl2溶液浸泡10 min左右，無(wú)菌水沖洗3～4次，每次1 min，最后用無(wú)菌濾紙吸干小穗水分。在超凈工作臺(tái)上用剪穎抖藥法將花藥接種至誘導(dǎo)愈傷培養(yǎng)基上，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為設(shè)置不同基本培養(yǎng)基和不同碳源4種培養(yǎng)基，分別為①N6+2，4-D 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 3 mg/L+蔗糖50 g/L；②N6+2，4-D 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 3 mg/L+麥芽糖50 g/L；③SK3+2，4-D 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 3 mg/L+蔗糖50 g/L；④SK3+2，4-D 2 mg/L+KT 1 mg/L+NAA 3 mg/L+麥芽糖50 g/L。每個(gè)三角瓶約接種80～100個(gè)花藥，25 ℃左右暗培養(yǎng)至愈傷組織直徑達(dá)2 mm左右。

1.2.5 分化培養(yǎng)及生根 將直徑2 mm以上的愈傷組織在超凈工作臺(tái)上轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基，分化培養(yǎng)基為實(shí)驗(yàn)室水稻通用分化培養(yǎng)基（MS+KT 2 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖30 g/L）。25 ℃、1 000～1 500 lx、10～12 h/d光照培養(yǎng)直至綠苗分化。當(dāng)綠苗長(zhǎng)到5 cm以上時(shí)，在超凈工作臺(tái)上將綠苗轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進(jìn)行生根。生根培養(yǎng)基為 1/2MS+NAA 0.5 mg/L+活性炭0.8 g/L+蔗糖20 g/L。endprint

1.2.6 純合DH系的獲得 將根系發(fā)育良好的再生植株經(jīng)過(guò)煉苗后移植到大田，每個(gè)愈傷組織來(lái)源的植株單株收種，每個(gè)單株獲得的種子次年種成株系，通過(guò)田間農(nóng)藝性狀調(diào)查，選取田間農(nóng)藝性狀純合株系10～30個(gè)。結(jié)合室內(nèi)考種，選取農(nóng)藝性狀優(yōu)良、結(jié)實(shí)率高、豐產(chǎn)性好的DH系5～15個(gè)。

1.2.7 廣親和水稻材料的獲得 對(duì)農(nóng)藝性狀優(yōu)良、豐產(chǎn)性好的優(yōu)良純合DH系進(jìn)行廣親和基因S5n的PCR檢測(cè)。廣親和基因S5n檢測(cè)的正向引物（F1）序列為5′-ATCAACCCATTTCCTTTCCT-3′，反向引物（R1）序列為5′-ATACGCTCGATCGGATTAAC-3′，含有廣親和基因S5n的DH系能擴(kuò)增出441 bp的片段，而不含有廣親和基因S5n的品種擴(kuò)增出的片段為577 bp。PCR擴(kuò)增體系為10×含Mg2+的PCR緩沖液1.5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 1.2 μL，Taq DNA聚合酶 1 U，DH系基因組DNA模板1 μL，10 μmol/L的正向引物F1 0.2 μL，10 μmol/L的反向引物R1 0.2 μL，ddH2O補(bǔ)充體積至15 μL。PCR反應(yīng)條件為94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性 40 s，50 ℃復(fù)性30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)；然后72 ℃延伸5 min。1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物帶型，紫外凝膠成像系統(tǒng)照像。

2 結(jié)果與分析

2.1 甬優(yōu)4949花藥取材的適宜時(shí)期

通過(guò)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，甬優(yōu)4949品種花粉母細(xì)胞發(fā)育處于單核靠邊期的幼穗葉枕距一般在6～10 cm，此時(shí)幼穗的穎殼寬度已接近成熟的大小，穎殼呈現(xiàn)淡綠色，雄蕊伸長(zhǎng)達(dá)穎殼的1/3～1/2。取材時(shí)葉枕距隨溫度的變化略有不同，溫度越高，葉枕距越短；溫度越低，葉枕距越長(zhǎng)。

2.2 甬優(yōu)4949花藥培養(yǎng)再生體系的建立

4種誘導(dǎo)培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率分別為15.04%、7.30%、10.77%和4.71%。表明對(duì)于甬優(yōu)4949，N6比SK3基本培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率高，蔗糖比麥芽糖的誘導(dǎo)率高。利用實(shí)驗(yàn)室水稻通用分化培養(yǎng)基，甬優(yōu)4949共獲得綠苗2 424株，平均綠苗分化率為13.95%。

2.3 純合DH系的獲得

2015年冬季將根系發(fā)育良好的再生植株經(jīng)過(guò)煉苗后帶到海南大田移植，每個(gè)愈傷組織來(lái)源的植株單株收種。每個(gè)單株獲得的種子2016年種成株系，通過(guò)田間農(nóng)藝性狀調(diào)查，選取田間農(nóng)藝性狀純合株系22個(gè)。結(jié)合室內(nèi)考種，選取農(nóng)藝性狀優(yōu)良、結(jié)實(shí)率高、豐產(chǎn)性好的DH系12個(gè)，DH系編號(hào)及室內(nèi)考種結(jié)果見(jiàn)表2。

2.4 廣親和水稻材料的獲得

對(duì)上述12個(gè)農(nóng)藝性狀優(yōu)良、豐產(chǎn)性好的優(yōu)良純合DH系進(jìn)行廣親和基因S5n的PCR檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，2016DH283、2016DH420、2016DH504、2016DH760、2016DH913共5個(gè)DH系能擴(kuò)增出441 bp的目標(biāo)片段，說(shuō)明這5個(gè)株系均含有廣親和基因S5n。

3 討論

廣親和基因S5n是能夠恢復(fù)秈粳雜交雜種育性的基因，利用常規(guī)育種獲得親和基因耗時(shí)冗長(zhǎng)。在水稻細(xì)胞工程育種中，水稻花藥培養(yǎng)作為一項(xiàng)高效、實(shí)用、成熟的育種新技術(shù)具有能有效縮短育種周期、擴(kuò)大變異范圍、提高選擇效率、加速有效性狀轉(zhuǎn)移等優(yōu)勢(shì)，在水稻新品種選育、三系提純改良、種質(zhì)資源創(chuàng)新、秈粳遠(yuǎn)緣雜種優(yōu)勢(shì)利用、三系與兩系雜交稻選育及水稻基因工程育種等方面應(yīng)用越來(lái)越廣泛。同時(shí)，通過(guò)花藥培養(yǎng)建立的DH群體屬于永久的遺傳資源，有著廣泛的用途，水稻中己有不少DH群體，但很少有秈粳交DH群體的建立。而秈粳間雜種優(yōu)勢(shì)強(qiáng)，有效利用其雜種優(yōu)勢(shì)已成為培育超級(jí)稻的主要方向[12]。本研究中，利用目前生產(chǎn)上推廣應(yīng)用的秈粳交品種甬優(yōu)4949為材料，不僅建立了對(duì)秈粳雜交育種和研究具有較大應(yīng)用潛力的DH群體，而且通過(guò)分子標(biāo)記技術(shù)選育了含有廣親和基因的純合DH系。本研究不僅大大縮短了選育廣親和水稻材料的育種年限，更為促進(jìn)秈粳交雜種優(yōu)勢(shì)利用提供了豐富的育種資源。

參考文獻(xiàn)：

[1] NORMILE D. Yangtze seen as earliest rice site[J].Science，1997，275（5298）：309.

[2] MO RISHIMA H，OKA H I. Phylogenetic differentiation of cultivated rice，XXII. Numerable evaluation of the Indica-Japonica differentiation[J].Japanese Journal of Breeding，1981，31（4）：402-413.

[3] GLASZMANN J C. Isozymes and classification of Asian rice varieties[J].Theoretical and Applied Genetics，1987，74（1）：21-30.

[4] WANG Z Y，TANKSLEY S D. Restriction fragment length polymorphism in Oryza sativa L.[J].Genome，1989，32（6）：1113-1118.

[5] BLAIR M W，PANAUD O，MCCOUCH S R. Inter-simple sequence repeat（ISSR） amplification for analysis of microsatellite motif frequency and fingerprinting in rice（Oryza sativa L.）[J].Theoretical and Applied Genetics，1999，98（5）：780-792.

[6] 蔡星星，劉 晶，仇吟秋，等.秈稻93-11和粳稻日本晴DNA插入缺失差異片段揭示的水稻秈-粳分化[J].復(fù)旦學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2006，45（3）：309-315.

[7] IKEHASHI H，ARAKI H. Varietal screening of compatibility types revealed in F1 fertility of distant cross in rice[J].Japanese Journal of Breeding，1984，34（3）：304-313.

[8] 熊 渠，王文豐，李?lèi)?ài)武，等.秈粳雜交稻新組合甬優(yōu)4949 在湖北孝感種植表現(xiàn)及栽培技術(shù)[J].雜交水稻，2016，31（5）：41-43.

[9] 王林友，王建軍，張禮霞，等.雜交稻浙優(yōu)18特征特性及栽培技術(shù)[J].浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013（4）：364-366.

[10] SONG X W，LIN J R，WU M G，et al. The Breeding of new indica-japonica intersubspecific hybrid rice combination Chunyou 84[J].Agricultural Science & Technology，2015，16（6）：1103-1105，1114.

[11] 戚華雄，査中萍.水稻品種秈粳屬性的鑒定方法研究[J].湖北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015，24（12）：6130-6133.

[12] 吳建梅，杜荔輝，吳為人，等.水稻秈粳交秈型不育系的雜種優(yōu)勢(shì)利用[J].福建農(nóng)林大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，41（1）：1-6.endprint