劉瑞祥，邊高鵬，蘭婷婷，孫學(xué)茹，常惠麗，任嘉紅

1. 長治學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，長治 0460112. 太行山生態(tài)與環(huán)境研究所，長治 0460113. 長治市環(huán)境監(jiān)測站，長治 046000

彗星試驗檢測地下水有機污染物的遺傳毒性效應(yīng)

劉瑞祥1, 2, *，邊高鵬1, 2，蘭婷婷1，孫學(xué)茹1，?；蓰?，任嘉紅1, 2

1. 長治學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)系，長治 0460112. 太行山生態(tài)與環(huán)境研究所，長治 0460113. 長治市環(huán)境監(jiān)測站，長治 046000

應(yīng)用人外周血淋巴細(xì)胞和小鼠淋巴細(xì)胞彗星試驗，對長治市5個樣點的地下水有機濃集物進(jìn)行了遺傳毒性研究。結(jié)果表明，各水樣中有機濃集物在3個染毒劑量50，200，800 mL·管-1條件下均可對人外周血淋巴細(xì)胞和小鼠淋巴細(xì)胞DNA產(chǎn)生不同程度的遺傳損傷，并且隨著濃度的升高，DNA損傷程度明顯增加，各實驗組與溶劑對照組相比有P < 0.05或P < 0.01顯著差異。研究表明，上述2種淋巴細(xì)胞彗星試驗可有效地檢測地下水體有機污染物的遺傳毒性。

地下水；有機污染物；彗星試驗；人外周血淋巴細(xì)胞；小鼠淋巴細(xì)胞

Received17 November 2016accepted17 December 2016

Abstract: The genotoxicity of organic pollutants to human peripheral lymphocytes and mouse lymphocytes in Changzhi groundwater was investigated. The comet assay was conducted to detect DNA damage induced by the organic extracts of five typical sample sites. The results showed that the DNA damage in human peripheral lymphocytes and mouse lymphocytes was induced by the organic substances tested in 50，200 and 800 mL·tube-1. DNA damage increased obviously with the dose of the organic extracts. Significant differences (P<0.05, P<0.01) were observed compared with the negative control group. This study also demonstrated that comet assay could be successfully applied to the genotoxicity monitoring of water organic extracts in human peripheral lymphocytes and mouse lymphocytes.

Keywords: ground water; organic pollutants; comet assay; human peripheral lymphocytes; mouse lymphocytes

地下水是人類重要的飲用水源，然而地下水污染尤其是有機污染日益突出的問題，已引起國際社會的廣泛關(guān)注[1]。1987年美國國家環(huán)保局(U.S. Environmental Protection Agency，USEPA)已在地下水中發(fā)現(xiàn)了175種有機化合物[2]，我國國土資源部于2005年始開展全國地下水污染調(diào)查與評價，結(jié)果表明珠江三角洲、長江三角洲、淮海流域平原區(qū)、華北平原等區(qū)域地下水有機污染明顯[3]。由于此類有機物大都呈現(xiàn)低劑量長期暴露的特點，傳統(tǒng)的理化分析方法不足以對水質(zhì)狀況做出全面的綜合評價，因此，有必要建立一種有效的測試方法來評價水體中有機物對生物、特別是對人體的遺傳毒性，以準(zhǔn)確直觀地反映水體的綜合毒性以及對人體健康的潛在危害。

彗星實驗，又稱單細(xì)胞凝膠電泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)，自20世紀(jì)90年代以來已廣泛應(yīng)用于水污染遺傳毒性監(jiān)測。張金榮等[4]應(yīng)用彗星試驗技術(shù)探討了自來水中有機污染物對細(xì)胞DNA的損傷作用，表明自來水中非揮發(fā)性有機污染物對細(xì)胞DNA有斷裂損傷作用。厲以強等[5]采用人血淋巴細(xì)胞彗星試驗檢測南京市水源水的遺傳毒性，證實了其用于檢測飲用水源有機濃集物遺傳毒性的可行性。李兆利等[6]運用人外周血淋巴細(xì)胞彗星試驗對長江南京段水體中有機污染物的遺傳毒性進(jìn)行了研究，指出有機污染物是導(dǎo)致長江南京段水體遺傳毒性的主要因素。本文采用人外周血淋巴細(xì)胞和小鼠淋巴細(xì)胞彗星試驗，對長治市地下水體中有機濃集物的遺傳毒性進(jìn)行了研究，探討地下水有機污染對人體健康危害的生物預(yù)警檢測評價方法。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實驗材料

健康人外周肝素抗凝全血，由長治市和濟醫(yī)院提供。SPF級昆明種雄性小鼠，6～8周齡，30～32 g，由長治市康寶工業(yè)園實驗動物培訓(xùn)基地提供。

1.2 水樣采集與處理

在長治市市區(qū)及周邊縣區(qū)選取5個樣點，分別為長治市城區(qū)、長子縣、沁源縣、武鄉(xiāng)縣和潞城辛安泉，其中辛安泉為長治市集中式地下水型水源地。于2016年3月從每個樣點采集水樣各10 L，各取水點均為本地區(qū)主要城鎮(zhèn)居民集中地水源井，井深100～350 m，在監(jiān)測井水面0.5 m以下取樣。采集水樣時利用抽水機設(shè)備，采樣前啟動設(shè)備放水?dāng)?shù)分鐘，將積留在管道內(nèi)的雜質(zhì)及陳舊水排出，然后用采樣容器在泵房出水管放水閥處接取水樣。靜置24 h后，過濾去除懸浮顆粒。采用XAD-2樹脂(Solarbio公司)吸附柱富集，控制流速在30～40 mL·min-1。N2排除水分，以甲醇、丙酮、二氯甲烷各50 mL洗脫，洗脫液用氮吹儀在50 ℃下濃縮、吹干，再用二甲基亞砜(DMSO)定容至10 mL，避光保存于-18 ℃冰箱中備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 人外周血淋巴細(xì)胞彗星試驗

(1)人外周血淋巴細(xì)胞分離和染毒

將2 mL新鮮肝素抗凝血與5 mL 3%明膠混合于離心管中，37 ℃水浴沉降30 min，吸取淡黃色淋巴細(xì)胞層0.2 mL于事先裝入0.8 mL PBS緩沖液的微量離心管中，3 000 r·min-1，離心5 min，棄去上清。加入0.9 mL PBS及0.1 mL水樣濃集物，4 ℃冰箱中暴露1 h，每個水樣設(shè)3個劑量(即相當(dāng)于原水樣50、200、800 mL·管-1)，同時作DMSO溶劑對照，每個劑量設(shè)3個平行。染毒后3 000 r·min-1離心5 min，棄去上清，沉積細(xì)胞置4 ℃冰箱中備用。鋪膠前用苔盼藍(lán)染色觀察細(xì)胞存活率(> 90%)。

(2)彗星試驗及結(jié)果評價

彗星試驗采用經(jīng)修改過的Singh等[7]的方法和OxiSelectTMComet Assay Kit(Sigma)進(jìn)行。鋪好膠的玻片在冷的細(xì)胞裂解液于4 ℃裂解1 h，然后置于堿性電泳緩沖液中，4 ℃下解旋20 min。10 V，80 mA條件下電泳40 min后4 ℃下用冷的PBS緩沖液中和3次，5 min·次-1；用Vista Green DNA Dye染色，50 μL·well-1，10 min后即可在熒光顯微鏡下觀察并進(jìn)行損傷評價和分析。

一個典型彗星包括頭部和尾部，不同程度的損傷根據(jù)可見熒光的尾部與其頭部的比例大小分為0、1、2、3、4五個等級。每張玻片觀察100個左右細(xì)胞，計算細(xì)胞損傷專用單位(arbitrary units，AU)[8]，計算方法如下：

式中，i為損傷等級；Ni為i級的細(xì)胞數(shù)。

采用SPSS 17.0軟件做統(tǒng)計分析，以單因素方差分析(ANOVA)比較各劑量組與溶劑對照組間的損傷差異，P <0.05, P <0.01表示差異顯著。

1.3.2 小鼠淋巴細(xì)胞彗星試驗

(1)小鼠淋巴細(xì)胞分離和染毒

小鼠淋巴細(xì)胞分離參照文獻(xiàn)[9]的方法。常規(guī)眼眶靜脈采集400 μL血液于預(yù)先加入50 μL的1 g·L-1肝素鈉EP管中，按1:2.5的比例加入明膠分離液，37 ℃水浴鍋中靜置約40 min。吸取上層淡黃色淋巴細(xì)胞液0.2 mL于預(yù)先裝有0.8 mL PBS緩沖液的微量離心管中混勻，3 000 r·min-1離心5 min，棄上清，每管加入0.9 mL PBS及0.1 mL水樣濃集物，4 ℃冰箱中染毒1 h，每隔10 min用移液槍吹打一次。劑量設(shè)定同人血淋巴細(xì)胞彗星試驗。染毒后3 000 r·min-1離心5 min，棄上清，置4 ℃冰箱中備用。同時作DMSO溶劑對照。

(2)彗星試驗及結(jié)果評價

同人血淋巴細(xì)胞彗星試驗。

2 結(jié)果(Results)

2.1 人外周血淋巴細(xì)胞彗星試驗

各水樣中有機濃集物對人外周血淋巴細(xì)胞的DNA損傷程度見表1。由表1可知，各水樣有機濃集物均可引起人外周血淋巴細(xì)胞不同程度的遺傳損傷，與溶劑對照組相比，均呈現(xiàn)出顯著差異(P < 0.01)，并且隨著染毒劑量的增加，DNA損傷程度亦逐漸增大。此外，由表1還可以看出，在DMSO溶劑對照組中，細(xì)胞幾乎沒有損傷，有近90%的細(xì)胞集中在0級，僅有10%的細(xì)胞受到損傷，且全部集中在1級；低劑量組(50 mL·管-1)DNA損傷集中于1、2級(61.54%～88.26%)，潞城辛安泉除外，0級損傷接近60%；高劑量組(800 mL·管-1)有2個樣點細(xì)胞損傷嚴(yán)重而難以統(tǒng)計，細(xì)胞無明確頭部或頭尾分離，其余3個樣點在該劑量組4級損傷均大于5%，顯微鏡下觀察可見很小的彗星頭和長而大的彗星尾。

2.2 小鼠淋巴細(xì)胞彗星試驗

各水樣中有機濃集物對小鼠淋巴細(xì)胞的DNA損傷程度見表2。由表2可以看出，各水樣有機濃集物對小鼠淋巴細(xì)胞均能造成不同程度的遺傳損傷，與溶劑對照組相比，具有P < 0.05或P < 0.01顯著差異。由表2還可看出，溶劑對照組對細(xì)胞的損傷極??；低劑量組(50 mL·管-1)DNA損傷多集中于1級，其中武鄉(xiāng)縣和潞城辛安泉在該劑量組0級損傷大于80%；高劑量組(800 mL·管-1)對DNA損傷多集中于3級，4級損傷均小于5%。

表1 各水樣有機濃集物對人外周血淋巴細(xì)胞的DNA損傷Table 1 DNA damages in human peripheral blood lymphocytes exposed to organic extracts from different water samples

注：與溶劑對照組相比，*P < 0.05，**P < 0.01。下同。

Note: Compared with the solvent control group，*P < 0.05，**P < 0.01. The same below.

3 討論(Discussion)

彗星試驗是常用的遺傳毒性生物學(xué)測試方法，可在單細(xì)胞水平上檢測DNA損傷，具有快速、靈敏、簡便等優(yōu)點[10～12]。用于彗星試驗研究DNA損傷的細(xì)胞有許多種，如淋巴細(xì)胞、肝臟細(xì)胞、各種腫瘤細(xì)胞、睪丸細(xì)胞等。其中，外周血淋巴細(xì)胞具有易于采集、可連續(xù)取樣、對機體損傷小、可用于活體檢測等優(yōu)點被廣泛采用。本研究結(jié)果顯示，長治市各水樣中有機濃集物可導(dǎo)致人外周血淋巴細(xì)胞、小鼠淋巴細(xì)胞DNA不同程度的遺傳損傷。

人外周血淋巴細(xì)胞是彗星試驗最常用的生物材料之一，廣泛應(yīng)用于人群流行病學(xué)調(diào)查、環(huán)境監(jiān)測、臨床疾病診斷等[13～14]。厲以強等[15]、?；蓰惖萚16]研究表明，人血淋巴細(xì)胞彗星試驗可有效地檢測水體中有機污染物的遺傳毒性。也有研究表明[17]，有機污染物對小鼠的遺傳毒性可以很好地反映其對哺乳動物、特別是對人的危害作用，從而及時地預(yù)測預(yù)報對人體的危害。本研究發(fā)現(xiàn)，地下水有機濃集物對人外周血淋巴細(xì)胞的損傷作用更為明顯，其中染毒劑量在800 mL·管-1條件下有2個樣點出現(xiàn)了超過20%的細(xì)胞頭部模糊、拖尾較長的現(xiàn)象，通常這類細(xì)胞的出現(xiàn)率應(yīng)低于5%，特別是對照組，若出現(xiàn)在實驗組中，則表明處理因素對細(xì)胞已經(jīng)產(chǎn)生致死性效應(yīng)，而非遺傳毒性效應(yīng)。研究顯示，該劑量組下各樣點有機濃集物對小鼠淋巴細(xì)胞損傷等級均小于5%，說明人血淋巴細(xì)胞DNA比小鼠淋巴細(xì)胞DNA對有機物更為敏感；也可能與不同動物細(xì)胞對有機毒物的毒性敏感性及DNA損傷修復(fù)機制的差異性有關(guān)，這有待于今后進(jìn)一步研究。

實驗組中高劑量染毒使DNA造成重度損傷，已引起了人血淋巴細(xì)胞凋亡，而劑量過低又難以使損傷充分體現(xiàn)。以200 mL·管-1這一劑量組進(jìn)行多重比較，對人血淋巴細(xì)胞DNA損傷程度依次為：長子縣>長治市城區(qū)>沁源縣>武鄉(xiāng)縣>潞城辛安泉；對小鼠淋巴細(xì)胞DNA損傷程度為：武鄉(xiāng)縣>沁源縣>長子縣>長治市城區(qū)>潞城辛安泉。比較結(jié)果進(jìn)一步說明不同淋巴細(xì)胞對有機毒物的反應(yīng)機制可能存在一定的差異性。本次試驗5個取水點均為本地區(qū)主要城鎮(zhèn)居民集中地水源井，其中辛安泉為山西省第二大巖溶泉，是長治市主要的集中式地下水型水源地。根據(jù)長治市2015年環(huán)境質(zhì)量公報，按照《地下水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB/T14848—93)Ⅲ類標(biāo)準(zhǔn)評價，辛安泉共監(jiān)測39個項目，水質(zhì)達(dá)標(biāo)率100%，符合國家飲用水源地水質(zhì)要求，其余4個點位也都符合飲用水水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。一般來說，深層地下水不易遭受污染，有機物含量極低，然彗星試驗中采用的受試物是水體的有機濃集物，實驗表明，各水樣即使在低劑量組也均能導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷，與對照組有顯著性差異(P < 0.05或P < 0.01)，提示有機污染物導(dǎo)致水體致突變作用普遍存在，從而為地下水安全預(yù)警提供了一種快速、有效的檢測方法。

表2 各水樣有機濃集物對小鼠淋巴細(xì)胞的DNA損傷Table 2 DNA damages in mouse lymphocytes exposed to organic extracts from different water samples

長期以來，我國地下水監(jiān)測多以無機物指標(biāo)為主，針對地下水中有機物主要采用一些間接指標(biāo)和單一理化指標(biāo)，這些指標(biāo)難以反映有機污染物對環(huán)境和人體的綜合危害[18]。鑒于地下水有機污染物含量甚微，更具復(fù)雜性和隱蔽性，建立一套完整的短期生物學(xué)測試方法，能較好地反映地下水體有機污染的綜合毒性，特別是對生物機體的遺傳毒性，具有更加現(xiàn)實的重要意義。迫切需要解決的問題是建立遺傳毒性檢測的標(biāo)準(zhǔn)化體系，以利于提供相對統(tǒng)一的檢測依據(jù)。

[1] 李志萍, 李慧, 張帥, 等. 地下水有機污染健康風(fēng)險評價研究綜述[J]. 華北水利水電大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版, 2014, 35(6): 21-24

Li Z P, Li H, Zhang S, et al. Research review on health risk assessment of organic pollution in groundwater [J]. Journal of North China University of Water Resources and Electric Power: Natural Science Edition, 2014, 35(6): 21-24 (in Chinese)

[2] Namocatcat J A, Barcelona M J, Quibuyen A T O, et al. Trimethylbenzoic acids as metabolite signatures in the biogeochemical evolution of an aquifer contaminated with jet fuel hydrocarbons [J]. Journal of Contaminant Hydrology, 2003, 67: 177-194

[3] 張新玨, 辛保東, 王曉紅, 等. 我國地下水污染研究進(jìn)展[J]. 地球與環(huán)境, 2011, 39(3): 415-422

Zhang X J, Xin B D, Wang X H, et al. Progress in research on groundwater pollution in our country [J]. Earth and Environment, 2011, 39(3): 415-422 (in Chinese)

[4] 張金榮, 唐非, 谷康定, 等. 自來水中有機污染物對細(xì)胞DNA的損傷作用[J]. 中國公共衛(wèi)生, 2004, 20(7): 784-785

Zhang J R, Tang F, Gu K D, et a1. Effects of nonvolatile organic compounds from tap water on DNA damage [J]. Chinese Journal of Public Health, 2004, 20(7): 784-785 (in Chinese)

[5] 厲以強, 孫立偉, 曲甍甍, 等. 人血淋巴細(xì)胞彗星試驗檢測南京市水源水的遺傳毒性[J]. 南京大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué), 2005, 41(3): 330-334

Li Y Q, Sun L W, Qu M M, et a1. Genotoxicity evaluation of drinking water sources in Nanjing using the comet assay with human peripheral blood lymphocytes [J]. Journal of Nanjing University：Natural Sciences, 2005, 41(3): 330-334 (in Chinese)

[6] 李兆利, 厲以強, 陳海剛, 等. 長江南京段水體中有機污染物的遺傳毒性研究[J]. 環(huán)境科學(xué)研究, 2006, 19(3): 105-108

Li Z L, Li Y Q, Chen H G, et a1. Evaluation of genotoxic effects induced by organic pollutants in the Yangtze River in Nanjing section [J]. Research of Environmental Sciences, 2006, 19(3): 105-108 (in Chinese)

[7] Singh N P, McCoy M T, Tice R R, et a1. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells [J]. Experimental Cell Research, 1988, 175: 184-191

[8] Collins A R, Ma A G, Duthie S J, et a1. The kinetics of repair of oxidative DNA damage (strand breaks and oxidized pyrimidines) in human cells [J]. Mutation Research, 1995, 336: 69-77

[9] 張勇, 何琦, 盧黎, 等. 敵百蟲致小鼠外周血淋巴細(xì)胞DNA-蛋白質(zhì)交聯(lián)作用研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2015, 10(2): 210-215

Zhang Y, He Q, Lu L, et a1. Study on DNA-protein crosslinks induced by trichlorfon in peripheral blood lymphocyte of mice [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(2): 210-215 (in Chinese)

[10] Frenzill G, Nigro M, Lyons B P. The comet assay for the evaluation of genotoxic impact in aquatic environments [J]. Mutation Research/Reviews in Mutation Research, 2008, 681(1): 80-92

[11] Nwani C D, Nagpure N S, Kumar R, et a1. Mutagenic and genotoxic assessment of atrazine-based herbicide to freshwater fish Channa punctatus (Bloch) using micronucleus test and single cell gel electrophoresis [J]. Environmental Toxicology and Pharmacology, 2011, 31(2): 314-322

[12] Sunjog K, Kolarevic S, Heberger K, et a1. Comparison of comet assay parameters for estimation of genotoxicity by sum of ranking differences [J]. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2013, 405: 4879-4885

[13] Yilmaz S, Calbayram N C. Exposure to anesthetic gases among operating room personnel and risk of genotoxicity: A systematic review of the human biomonitoring studies [J]. Journal of Clinical Anesthesia, 2016, 35: 326-331

[14] 孫立偉, 曲甍甍, 李兆利, 等. 人外周血淋巴細(xì)胞彗星試驗檢測飲用水水質(zhì)毒性研究[J]. 環(huán)境科學(xué)學(xué)報, 2005, 25(3): 324-328

Sun L W, Qu M M, Li Z L, et al. Toxicity evaluation of drinking water in human peripheral blood lymphocytes using the comet assay [J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2005, 25(3): 324-328 (in Chinese)

[15] 厲以強, 胡冠九, 李兆利, 等. 彗星試驗檢測區(qū)域水源有機污染致突變量[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2010, 5(6): 563-568

Li Y Q, Hu G J, Li Z L, et a1. Study on mutagentic threshold of organic pollutants in typical water area by comet assay [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2010, 5(6): 563-568 (in Chinese)

[16] ?；蓰? 任嘉紅, 霍轉(zhuǎn)轉(zhuǎn), 等. 人血淋巴細(xì)胞檢測濁漳河地表水的遺傳毒性[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報, 2012, 7(6): 615-619

Chang H L, Ren J H, Huo Z Z, et a1. Genotoxicity of surface water in Zhuozhang River using human peripheral blood lymphocytes [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2012, 7(6): 615-619 (in Chinese)

[17] 邊高鵬, 劉瑞祥, 史寶忠, 等. 苯胺致小鼠肝細(xì)胞和淋巴細(xì)胞DNA損傷及其修復(fù)效應(yīng)[J]. 中國實驗動物學(xué)報, 2016, 24(2): 139-144

Bian G P, Liu R X, Shi B Z, et a1.DNA damages in mouse hepatocytes and lymphocytes induced by aniline and their repair dynamics [J]. Acta Laboratorium Animalis Scientia Sinica, 2016, 24(2): 139-144 (in Chinese)

[18] 張崇華, 閆海, 王春蓮. 飲用水有機物污染及安全評價技術(shù)研究進(jìn)展[J]. 環(huán)境與健康雜志, 2013, 30(3): 278-281

Zhang C H, Yan H, Wang C L. Safety assessment methods for organic pollution in drinking water: A review of recent studies [J]. Journal of Environment and Health, 2013, 30(3): 278-281 (in Chinese)

◆

GenotoxicityEvaluationofOrganicPollutantsinGroundWaterwithCometAssay

Liu Ruixiang1,2,*, Bian Gaopeng1,2, Lan Tingting1, Sun Xueru1, Chang Huili3, Ren Jiahong1,2

1. The Department of Biology Science and Technology, Changzhi College, Changzhi 046011, China2. Taihang Mountain Institute of Ecology and Environment, Changzhi 046011, China3. Environmental Monitoring Station of Changzhi, Changzhi 046000, China

10.7524/AJE.1673-5897.20161117001

2016-11-17錄用日期2016-12-17

1673-5897(2017)3-726-06

X171.5

A

劉瑞祥(1964-)，男，教授，主要從事遺傳毒理學(xué)等方面研究，以第一作者或通訊作者在國內(nèi)外發(fā)表學(xué)術(shù)論文50余篇。

山西省高等學(xué)校大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練重點項目(No.2015426)；地方高校國家級大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃項目(No.201510122001)

劉瑞祥(1964—)，男，漢族，碩士，教授，研究方向為遺傳毒理學(xué)，E-mail：liuruixiang1964@163.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: liuruixiang1964@163.com

劉瑞祥, 邊高鵬, 蘭婷婷, 等. 彗星試驗檢測地下水有機污染物的遺傳毒性效應(yīng)[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2017, 12(3): 726-731

Liu R X, Bian G P, Lan T T, et al. Genotoxicity evaluation of organic pollutants in ground water with comet assay [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 726-731 (in Chinese)