石柳，王棟，張瑛，曹迪，孟甜甜，郭溪，周集體

大連理工大學(xué)化工與環(huán)境生命學(xué)部環(huán)境學(xué)院，工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116024

氧化石墨烯對大型溞的生物毒性效應(yīng)研究

石柳，王棟，張瑛*，曹迪，孟甜甜，郭溪，周集體

大連理工大學(xué)化工與環(huán)境生命學(xué)部環(huán)境學(xué)院，工業(yè)生態(tài)與環(huán)境工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116024

氧化石墨烯(graphene oxide, GO)因其優(yōu)良的電性能、機(jī)械性能，而成為新興的碳納米應(yīng)用材料，但是其制造或應(yīng)用后排放進(jìn)入環(huán)境水體的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)缺少足夠的研究，尤其是關(guān)于GO生態(tài)毒性的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。研究以水生甲殼類動物大型溞(Daphnia magna, D. magna)為受試生物，從急性毒性和慢性毒性兩方面考察了GO的生物毒性效應(yīng)，并結(jié)合溞類的光學(xué)顯微鏡觀察和體內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活力以及丙二醛(MDA)含量的測定對GO對大型溞的致毒機(jī)理進(jìn)行了初步探究。研究結(jié)果表明GO對大型溞急性毒性的48 h半數(shù)致死濃度(48 h-LC50)為84.2 mg·L-1；慢性毒性的21 d半數(shù)致死濃度(21 d-LC50)為3.3 mg·L-1。關(guān)于GO對大型溞的繁殖毒性，當(dāng)GO濃度達(dá)到1 mg·L-1時(shí)能夠顯著推遲母溞的頭胎出生時(shí)間，抑制母溞頭胎幼溞數(shù)、單胎最高產(chǎn)溞數(shù)和總產(chǎn)溞數(shù)。關(guān)于GO對大型溞的致毒機(jī)理，研究結(jié)果表明消化道堵塞和氧化損傷可能是GO對大型溞的主要致毒途徑。上述研究結(jié)果為GO在水環(huán)境中的毒性效應(yīng)研究奠定了基礎(chǔ)，為GO的工業(yè)化應(yīng)用前景提供了基礎(chǔ)的生態(tài)毒性數(shù)據(jù)。

氧化石墨烯；大型溞；急性毒性；慢性毒性；氧化損傷

Received14 January 2017accepted30 March 2017

Abstract: Graphene oxide (GO) has been extensively explored as a promising carbon-based nanomaterial because of its unique electrical and mechanical properties. The versatile manufacture and application of GO made it inevitably release into the aqueous environment. However, limit is known about the potential risk of GO in aquatic environment. To evaluate the bio-toxicity of GO, the acute toxicity and semi-chronic toxicity using Daphnia magna (D. magna) were conducted. The toxicity mechanism of GO to D. magna was investigated preliminarily by the light microscopy, the measurement of SOD and CAT activities and MDA content. The results showed that the 48 h-LC50of GO in acute toxicity tests was 84.2 mg·L-1. The 21 d-LC50in semi-chronic toxicity tests was 3.3 mg·L-1. As to the reproduction of D. magna, the significant delay in the production time of the first brood was found when the concentration of GO reached 1 mg·L-1, as well as the significant inhibition in the offspring number of the first brood, the offspring number of the most productive brood and the total number of offspring. With respect to the toxicity mechanism of GO, the results revealed that gut clogging and oxidative stress might be the main toxicity pathway of GO to D. magna. This study gave an example of the toxicity research for novel chemicals, and provided the basic toxicity information of GO in respect of its industrial application.

Keywords: graphene oxide; Daphnia magna; acute toxicity; chronic toxicity; oxidative stress

氧化石墨烯(GO)是石墨烯經(jīng)氧化處理后的衍生物，除了具備石墨烯的片層結(jié)構(gòu)的特殊性質(zhì)外，表面含有大量的羧基、羥基、烷氧基等親水基團(tuán)[1]。GO具有優(yōu)異的物理化學(xué)性質(zhì)，例如較高的比表面能、良好的親水性、吸附性和機(jī)械性能等，被廣泛應(yīng)用于能源、材料學(xué)和生物醫(yī)學(xué)等方面[2]。因此，隨著GO的大規(guī)模應(yīng)用，其進(jìn)入水體后造成的生態(tài)效應(yīng)與安全問題不容忽視。

目前關(guān)于GO生物毒性的報(bào)道中，主要考察了GO對哺乳動物[3]、人體或動物細(xì)胞[4-5]的毒性效應(yīng)，而對水生生物的毒性效應(yīng)還缺少足夠的研究。

關(guān)于GO對水生生物的毒性效應(yīng)研究報(bào)道中，所用的受試生物主要有菌類(如大腸桿菌[6]、惡臭假單胞菌[7])、藻類(如月牙藻[1]、銅綠微囊藻[8]及普通小球藻[9-10])、原生動物類(如小眼蟲[11])、浮游動物類(如紋藤壺[12]及豐年蝦[13])以及魚類(斑馬魚胚胎[14]及成魚[15])。然而，GO對通用水生模式生物大型溞的毒理學(xué)數(shù)據(jù)還未見報(bào)道。

另外，已有研究中，對于GO的毒性效應(yīng)，主要關(guān)注的是GO短期暴露后的生物毒性效應(yīng)。如，GO對菌類的毒性作用表現(xiàn)在GO具有一定的抗菌性，造成膜損傷和氧化損傷[6-7]。GO對藻類的毒性作用主要表現(xiàn)在GO能抑制藻類的生長、葉綠素a合成以及使藻細(xì)胞內(nèi)活性氧物種(ROS)含量增加[1,8-10]。GO對原生動物小眼蟲的毒性作用主要體現(xiàn)在其會抑制小眼蟲生長及使SOD、CAT活力升高[11]。GO對浮游動物(如紋藤壺[12]和豐年蝦[13])的毒性研究表明GO達(dá)到一定濃度時(shí)會使幼蟲游動速度降低，死亡率升高。GO對斑馬魚胚胎的毒性作用主要表現(xiàn)在胚胎孵化延遲、心臟水腫等方面[14]。GO對斑馬魚成魚表現(xiàn)出氧化損傷和免疫毒性[15]。然而，關(guān)于長期暴露后GO對水生生物的毒性效應(yīng)，特別是對水生生物繁殖的毒性效應(yīng)研究還較少。

為了考察GO在制造或應(yīng)用后排放進(jìn)入環(huán)境水體所造成的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，本研究以水生甲殼類動物大型溞為受試生物，考察了GO對大型溞的48 h急性毒性和21 d慢性毒性，并通過暴露后溞類的光學(xué)顯微鏡觀察及其體內(nèi)抗氧化酶(SOD和CAT)活力以及丙二醛(MDA)含量的測定來探究GO對大型溞的致毒機(jī)理。本研究旨在為在水環(huán)境中GO的毒性效應(yīng)提供研究基礎(chǔ)，為GO的工業(yè)化應(yīng)用前景提供生態(tài)毒性數(shù)據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

本研究采用的是單層GO粉末，購于南京先豐納米材料科技有限公司，純度>99 wt%，直徑500 nm～5 μm，厚度0.8～1.2 nm。GO儲備液(2 g·L-1)用超純水配制，超聲分散30 min后常溫儲存?zhèn)溆茫瑑湟壕鶆蚍稚?。其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純試劑，購于中國國藥有限公司。

大型溞(Daphnia magna, D. magna )由大連海洋大學(xué)水生生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，為本實(shí)驗(yàn)室連續(xù)培養(yǎng)3代以上的單克隆品系。大型溞在曝氣(>24 h)自來水中養(yǎng)殖，飼以斜生柵藻。培養(yǎng)條件：溫度為(20±1) ℃，明暗時(shí)間比為16 h∶8 h，溶解氧DO>3 mg·L-1，pH為6～9。定期用重鉻酸鉀作為參考物檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用溞的敏感性，當(dāng)大型溞的24 h-EC50(24 h內(nèi)50%的受試溞運(yùn)動受到抑制時(shí)被測物質(zhì)的濃度)在0.6～2.1 mg·L-1時(shí)，表明該大型溞符合實(shí)驗(yàn)要求，可用于毒性實(shí)驗(yàn)。暴露前2 h將實(shí)驗(yàn)用溞置于充氧飽和的人工稀釋水中培養(yǎng)，以適應(yīng)新的實(shí)驗(yàn)條件。采用人工稀釋水的原因是為控制實(shí)驗(yàn)條件的穩(wěn)定，避免自來水中的雜質(zhì)對GO毒性的干擾。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

毒性實(shí)驗(yàn)用暴露溶液的配制：將GO儲備液超聲分散30 min后，用充氧飽和的人工稀釋水(配制比例如表1所示[16]，用氫氧化鈉或鹽酸溶液調(diào)節(jié)pH至7.8左右)將儲備液稀釋成不同濃度的暴露液?？紤]到GO會團(tuán)聚沉淀，暴露液均為當(dāng)天暴露前新鮮配制。

GO在超純水中的粒徑表征：粒徑表征參照Nogueira等[1]的研究方法進(jìn)行，用超純水配制濃度為0.01 mg·L-1(實(shí)驗(yàn)中設(shè)定最低濃度)的GO分散液，超聲分散30 min(與毒性實(shí)驗(yàn)中暴露液配制的超聲時(shí)間相同)，然后用納米粒度儀(Malvern, Nano-ZS90, England)進(jìn)行測定。

大型溞的急性毒性實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)采用24 h內(nèi)新生的幼溞，實(shí)驗(yàn)方法參照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)化學(xué)品測試導(dǎo)則No.202 (2004)《溞類急性活動抑制試驗(yàn)》進(jìn)行[17]。正式實(shí)驗(yàn)根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的GO濃度范圍進(jìn)行設(shè)置，共設(shè)置6個(gè)等梯度的實(shí)驗(yàn)濃度組和1個(gè)空白對照組，每個(gè)濃度設(shè)置4個(gè)平行樣。暴露時(shí)間為48 h，實(shí)驗(yàn)期間不喂食。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，空白對照組中大型溞的死亡率低于10%，則表明實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。毒性表征采用48 h-LC50(48 h內(nèi)50%的受試溞死亡時(shí)被測物質(zhì)的濃度)表示。

大型溞的慢性毒性實(shí)驗(yàn)：實(shí)驗(yàn)采用24 h內(nèi)新生的幼溞，實(shí)驗(yàn)方法參照經(jīng)濟(jì)合作與發(fā)展組織(OECD)化學(xué)品測試導(dǎo)則No.211 (1998)：《大型溞繁殖試驗(yàn)》進(jìn)行[18]。根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定GO對大型溞無急性毒性濃度范圍后設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度組和1個(gè)空白對照組，每組10個(gè)平行樣。暴露時(shí)間為21 d，每天喂食，隔天更換實(shí)驗(yàn)溶液。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，空白對照組大型溞的死亡率低于20%且平均每只母溞總產(chǎn)溞量大于60只，則實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效。毒性表征采用21 d-LC50、母溞頭胎出生時(shí)間、頭胎幼溞數(shù)、單胎最高產(chǎn)溞數(shù)和總產(chǎn)溞數(shù)表示。

大型溞體內(nèi)SOD、CAT活力以及MDA含量的測定：實(shí)驗(yàn)用溞為出生3～4 d幼溞。根據(jù)急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定GO對大型溞無急性毒性濃度范圍后，設(shè)置5個(gè)實(shí)驗(yàn)濃度組和1個(gè)空白對照組。暴露48 h后，準(zhǔn)確稱取大型溞的待測組織的重量，加入適當(dāng)用量的磷酸緩沖溶液后，在冰水浴條件下機(jī)械勻漿，10 000 r·min-1，離心20 min，取上清液(每組3個(gè)平行樣)，按南京建成生物研究所的試劑盒要求測定總蛋白含量、SOD和CAT活力以及MDA含量。

大型溞的光學(xué)顯微鏡觀察：在急性毒性和慢性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將暴露后的大型溞用人工稀釋水沖洗2～3次后置于光學(xué)顯微鏡(Olympus, Model YS100, Japan)下觀察，并用相機(jī)(Canon, EOS 760D, Japan)記錄結(jié)果。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

LC50及95%置信區(qū)間的計(jì)算參照Morrison等[19]的方法，使用SPSS 18.0(IBM，USA)軟件中的probit analysis進(jìn)行。慢性毒性和氧化損傷毒性實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用平均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差形式表示，用OriginPro 9.0(OriginLab，USA)軟件繪圖，用SPSS 18.0軟件中單方差分析(One-way ANOVA)中的土耳其檢驗(yàn)(Tukey’s test)進(jìn)行差異性分析(P < 0.05)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 GO的粒徑表征

經(jīng)納米粒度儀分析得出GO在超純水中的平均粒徑為(1 108 ± 51) nm，即平均粒徑在1 μm左右。

2.2 GO對大型溞的急性毒性

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選用不同濃度的GO懸浮液對大型溞進(jìn)行急性毒性實(shí)驗(yàn)，大型溞在暴露48 h后死亡率情況如表2所示。

由表2可以看出，GO濃度小于50.0 mg·L-1時(shí)，對大型溞沒有表現(xiàn)出急性致死毒性，由此可以認(rèn)為GO對大型溞急性毒性的最大無影響濃度(no observed effect concentration, NOEC)為50.0 mg·L-1。隨著GO濃度從65.0 mg·L-1增加到143.0 mg·L-1時(shí)，大型溞的死亡率由10%逐漸增加到100%，表明GO對大型溞的毒性表現(xiàn)出一定的劑量-效應(yīng)關(guān)系。

表2 氧化石墨烯(GO)對大型溞的急性毒性Table 2 Acute toxicity of graphene oxide (GO) to D. magna

經(jīng)計(jì)算得到GO對大型溞急性毒性的48 h-LC50值為84.2 mg·L-1(95%置信區(qū)間為81.6～87.0 mg·L-1)。

2.3 GO對大型溞的慢性毒性

在急性毒性研究的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了GO對大型溞的慢性毒性。將大型溞暴露在不同濃度的GO懸浮液中，在21 d后統(tǒng)計(jì)其母溞死亡率、母溞頭胎出生時(shí)間、頭胎幼溞數(shù)、單胎最高產(chǎn)溞數(shù)和總產(chǎn)溞數(shù)情況，結(jié)果如圖1所示。

不同濃度GO暴露后的母溞的存活狀況如圖1(A)所示。大型溞暴露于濃度為0.01 mg·L-1的GO中21 d后沒有出現(xiàn)死亡；當(dāng)GO濃度從0.1 mg·L-1增加到50.0 mg·L-1，大型溞的死亡率由10%逐漸增加到100%。經(jīng)計(jì)算可得GO對大型溞慢性毒性的21 d-LC50值為3.3 mg·L-1(95%置信區(qū)間為0.4～15.2 mg·L-1)。由此可以看出，大型溞的21 d死亡率與GO呈現(xiàn)出一定的濃度效應(yīng)。

在此基礎(chǔ)上，考察了GO對大型溞繁殖的毒性效應(yīng)。不同濃度的GO對母溞頭胎出生時(shí)間的影響如圖1(B)所示。由圖中可以看出，當(dāng)GO濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，GO會延遲大型溞頭胎的出生時(shí)間，從8 d延長至10 d；當(dāng)GO濃度為10.0 mg·L-1時(shí)，大型溞在實(shí)驗(yàn)周期21 d中均未生第一胎。GO對母溞頭胎幼溞數(shù)、單胎最高產(chǎn)溞數(shù)和總產(chǎn)溞數(shù)的影響如圖1(C)所示，由圖中可以看出，當(dāng)GO濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，GO開始對母溞頭胎幼溞數(shù)和總產(chǎn)溞數(shù)表現(xiàn)出抑制作用，數(shù)量分別由8只和73只減少到4只和51只；當(dāng)GO濃度為1.0 mg·L-1時(shí)，GO開始對母溞單胎最高產(chǎn)溞數(shù)表現(xiàn)出抑制作用，產(chǎn)溞量由24只降低到17只。由此可以看出，GO對大型溞具有一定的慢性毒性，且母溞死亡率、母溞頭胎幼溞數(shù)以及總產(chǎn)溞量3個(gè)指標(biāo)較為敏感。

圖1 GO對大型溞的慢性毒性注：A，母溞死亡率；B，母溞頭胎出生時(shí)間；C，母溞頭胎幼溞數(shù)，母溞單胎最高產(chǎn)溞數(shù)，每只母溞的總產(chǎn)溞數(shù)。 柱形圖上不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。Fig. 1 Chronic toxicity of GO on D. magnaNote: A, Mortality of parent animals; B,Time to production of first brood; C, Number of offspring of first brood, Number of offspring of the most productive brood, Total number of offspring. Different letters above each column indicate statistically significant differences (P<0.05).

2.4 GO對大型溞的致毒機(jī)理探究

2.4.1 光學(xué)顯微鏡觀察

為探究GO對大型溞的致毒機(jī)理，將暴露48 h和21 d后的大型溞置于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖2所示。與48 h控制組的圖2(A)相比，可以看出暴露于GO中的大型溞的消化道中有深棕色物質(zhì)積累(見圖2(B))，表明GO能夠被大型溞直接吞食，并積累在消化道中。與21 d控制組的圖2(C)相比，可以看出在喂食柵藻的情況下，暴露21 d后的大型溞消化道內(nèi)仍有GO積累(見圖2(D, E, F, G))。

2.4.2 SOD、CAT活力以及MDA含量的測定結(jié)果

為進(jìn)一步探究GO對大型溞的致毒機(jī)理，對暴露在GO懸浮液中48 h后的大型溞體內(nèi)的SOD和CAT活力以及MDA含量情況進(jìn)行了測定，結(jié)果如圖3所示。

暴露在不同濃度GO中的大型溞體內(nèi)的SOD和CAT活力的變化情況如圖3(A和B)所示。當(dāng)GO的濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，GO對SOD和CAT活力均表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)效應(yīng)；隨著GO濃度的增加，大型溞體內(nèi)SOD和CAT活力分別由164.8 U·mg prot-1和48.6 U·mg prot-1逐漸增加到237.3 U·mg prot-1和70.6 U·mg prot-1。

暴露在不同濃度GO中的大型溞體內(nèi)MDA含量的變化情況如圖3(C)所示。當(dāng)GO的濃度為0.1 mg·L-1時(shí)，GO對MDA含量表現(xiàn)出顯著的促進(jìn)效應(yīng)；隨著GO濃度的增加，MDA含量由1.3 nmol·mg prot-1逐漸增加到2.0 nmol·mg prot-1。

GO對數(shù)濃度分別與對應(yīng)的大型溞體內(nèi)SOD和CAT活力及MDA含量的線性擬合曲線如圖3所示。通過圖3中擬合方程的R2值和P值，可以看出GO的濃度與CAT和MDA的相關(guān)性較好，而與SOD的相關(guān)性稍差。

3 討論(Discussion)

本研究通過大型溞的急性毒性實(shí)驗(yàn)，給出了GO對大型溞的急性毒性數(shù)據(jù)(48 h-LC50為84.2 mg·L-1)，對GO的生物毒性數(shù)據(jù)作了很好的補(bǔ)充。大型溞作為國際上公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)受試生物被廣泛應(yīng)用于廢水[20-22]、重金屬[23]、納米材料[24-26]等污染物的生物毒性評價(jià)中，因此GO對大型溞毒性數(shù)據(jù)的補(bǔ)充就顯得尤為重要。已有文獻(xiàn)報(bào)道了GO對其他水生動、植物的急性毒性數(shù)據(jù)，如GO對紋藤壺[12]48 h-LC50值為560 mg·L-1，對豐年蝦[13]48 h-LC50值為650 mg·L-1。由此可以看出，與紋藤壺和豐年蝦相比，GO對大型溞的急性毒性作用較強(qiáng)，或者說大型溞對GO的急性毒性(48 h)響應(yīng)比較敏感。另外，96 h的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明GO對月牙藻生長的96 h-EC50值為20 mg·L-1[1]，對小眼蟲生長的96 h-EC50值為3.76 mg·L-1[11]。本研究發(fā)現(xiàn)大型溞暴露在濃度為50.0 mg·L-1的GO懸浮液中96 h后沒有出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，這說明與小眼蟲和月牙藻相比，GO對大型溞的亞慢性毒性(96 h)作用較弱。

圖2 GO在大型溞體內(nèi)的攝入情況注：A，空白(48 h)；B，GO濃度為50 mg·L-1 (48 h)；C，空白(21 d)；D～G，GO濃度分別為0.01、0.1、1和10 mg·L-1 (21 d)。Fig. 2 Ingestion of GO by D. magnaNote: A, control (48 h); B, 50 mg·L-1 of GO (48 h); C, control (21 d); D-G,concentrations of GO was 0.01, 0.1, 1 and 10 mg·L-1 respectively (21 d).

圖3 GO濃度對大型溞體內(nèi)SOD和CAT活力及MDA含量的影響注：柱形圖上不同字母表示存在顯著性差異(P<0.05)。圖中斜線為GO對數(shù)濃度分別 與對應(yīng)的大型溞體內(nèi)SOD和CAT活力及MDA含量的線性擬合曲線。Fig. 3 Effect of GO concentrations on SOD and CAT activities and MDA content in D. magnaNote: Different letters above each column indicate statistically significant differences (P<0.05). The linear fit was shown as oblique lines between logarithm concentration of GO and SOD and CAT activities and MDA content in D. magna, respectively.

納米材料中，除GO外，其他碳納米材料對大型溞的急性毒性已有報(bào)道。如有研究表明碳納米管對大型溞的48 h-LC50值為29.3 mg·L-1[27]；C60對大型溞的48 h-LC50值為7.9 mg·L-1[28]；穩(wěn)定分散在沒食子酸(gallic acid)中的C70即C70-GA對大型溞的96 h-LC50值為0.4 mg·L-1[24]。與本研究結(jié)果相比，上述納米材料對大型溞的急性毒性較GO的毒性強(qiáng)(GO的NOEC為50 mg·L-1)，這說明GO是一種環(huán)境較為友好的納米材料，為其工業(yè)化的廣泛應(yīng)用提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

相較于急性毒性來說，慢性毒性也同樣應(yīng)該引起人們的重視。有研究報(bào)道GO在環(huán)境中的濃度大概為0.01～1 mg·L-1[24]。在此濃度范圍下GO對大型溞沒有表現(xiàn)出急性致死毒性，但從本研究的結(jié)果來看，即使在這么低濃度下，長期暴露后仍然會對大型溞的生殖(如頭胎出生時(shí)間、總產(chǎn)溞量)產(chǎn)生影響，甚至導(dǎo)致死亡。考慮到生物種群及生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，慢性毒性研究對污染物的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)的意義也同樣應(yīng)該引起足夠的重視[30]。

關(guān)于GO等納米材料對大型溞的慢性毒性，已有文獻(xiàn)報(bào)道過其他碳納米材料對大型溞的慢性毒性。Seda等[24]的研究表明，C70-GA對大型溞慢性毒性的21 d NOEC為0.125 mg·L-1，C70濃度達(dá)到1 mg·L-1時(shí)，會顯著抑制母溞存活率和母溞總產(chǎn)溞量。Mendon?a等[31]研究表明金剛石對大型溞慢性毒性的21 d NOEC為0.63 mg·L-1，當(dāng)金剛石濃度達(dá)到1.3 mg·L-1時(shí)能夠顯著抑制母溞總產(chǎn)溞量。由此可以看出，相對于其他的碳納米材料來說，GO對大型溞的慢性毒性比C70-GA和金剛石的毒性強(qiáng)。

本研究表明GO能夠被大型溞直接吞食，并積累在消化道中，因此消化道堵塞被認(rèn)為是GO對大型溞的可能致毒途徑之一。大型溞是一種濾食生物，它在“濾水”的同時(shí)能攝入水中尺寸在0.4～4 μm的物質(zhì)[32]。本研究所用的GO在純水中的平均粒徑為1 μm左右，雖然GO在人工稀釋水中會發(fā)生團(tuán)聚，但單獨(dú)分散的GO平均粒徑在1 μm左右，因此這部分GO是能夠被大型溞直接吞食的。被吞食的GO容易積累在大型溞的消化道中，很可能造成消化道的堵塞，從而阻止大型溞的正常攝食，表現(xiàn)出體長、繁殖數(shù)量等指標(biāo)的降低，甚至可能引起死亡[27,33-34]。GO容易蓄積在水生生物的腸道中，這個(gè)發(fā)現(xiàn)在豐年蝦的研究中也有報(bào)道[13]。有研究認(rèn)為：在喂食藻類的情況下，大型溞可以排除體內(nèi)積累的納米材料。但是，這種排除也只是部分排除，而不是完全的排除。例如，Guo等[16]用碳標(biāo)記的石墨烯懸浮液對大型溞進(jìn)行的恢復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，養(yǎng)殖24 h后大型溞體內(nèi)蓄積的石墨烯含量基本沒有變化；同等條件下，飼以柵藻后大型溞體內(nèi)積累的石墨烯有90%被排出，但是仍有部分殘留在體內(nèi)。Petersen等[35]研究碳納米管在大型溞消化道中的蓄積情況時(shí)也有類似的發(fā)現(xiàn)。因此，根據(jù)圖2中顯示的GO在大型溞體內(nèi)的排除情況，我們推測消化道堵塞是GO對大型溞慢性毒性的可能致毒途徑。

除了GO外，其他碳納米材料在大型溞體內(nèi)的蓄積情況也有相關(guān)的研究報(bào)道。如Guo等[16]將新生幼溞置于250 μg·L-1的石墨烯懸浮液暴露24 h后，發(fā)現(xiàn)幼溞體內(nèi)蓄積的石墨烯重量約占小溞干重的1%，隨后將暴露后的小溞置于清潔的人工稀釋水中進(jìn)行養(yǎng)殖，24 h后幼溞體內(nèi)蓄積的石墨烯含量基本沒有改變；研究還發(fā)現(xiàn)，將已懷卵的母溞在250 μg·L-1的石墨烯懸浮液中暴露24 h后，在新生幼溞體內(nèi)也會檢測出石墨烯。除此之外，Stanley等[27]在研究多壁碳納米管對大型溞的毒性時(shí)，認(rèn)為堵塞在消化道中的納米材料可能抑制了大型溞對藻類的攝入，從而影響大型溞的生長和繁殖。

除了消化道堵塞，氧化損傷也被認(rèn)為是GO對大型溞的可能致毒途徑之一。SOD和CAT是生物體內(nèi)2種重要的抗氧化酶。SOD可以特異性地將O2·-催化分解為H2O2和O2，CAT可以催化H2O2分解為無毒性的H2O和O2，從而將活性氧(ROS)保持在較穩(wěn)定的水平，保護(hù)生物體免受ROS的損害[11]。ROS的量超過了抗氧化清除能力時(shí)，會對機(jī)體造成氧化損傷，如脂質(zhì)過氧化。MDA是脂質(zhì)過氧化的主要產(chǎn)物。生物體內(nèi)SOD和CAT活力及MDA含量的變化能夠闡明污染物的毒性機(jī)制。在本研究中大型溞體內(nèi)SOD和CAT活力升高，表明大型溞清除O2·-和H2O2自由基的能力增強(qiáng)，也表明了GO能夠誘導(dǎo)大型溞體內(nèi)產(chǎn)生過量的活性氧物種(如O2·-和H2O2)。而MDA含量的增加表明產(chǎn)生的過量的ROS已對大型溞造成了脂質(zhì)過氧化。由此可以看出氧化損傷可能是GO對大型溞的致毒途徑之一。

本研究表明GO會使大型溞體內(nèi)SOD和CAT活力及MDA含量升高。除此之外，也有研究表明GO對其他水生生物也會造成氧化損傷。如，Hu等[11]的研究表明，當(dāng)GO濃度為2.5 mg·L-1時(shí)，能夠顯著誘導(dǎo)小眼蟲體內(nèi)SOD和CAT活力及MDA含量的升高，這與本研究的結(jié)果一致。但是，Mesaric等[13]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)GO濃度高達(dá)500 mg·L-1時(shí)對豐年蝦體內(nèi)CAT活力沒有顯著影響。Zhao等[29]也發(fā)現(xiàn)，GO濃度在10～1 000 μg·L-1時(shí)，對擬南芥體內(nèi)SOD和CAT活力均沒有顯著的影響。另外，這說明GO對生物體內(nèi)抗氧化酶的影響機(jī)制較為復(fù)雜，需要進(jìn)行更為深入的研究。

本研究以大型溞為受試生物，考察了GO對大型溞的急性毒性和慢性毒性，為GO的生態(tài)毒性數(shù)據(jù)提供了補(bǔ)充；GO對大型溞的致毒機(jī)理的考察表明消化道堵塞和氧化損傷可能是GO對大型溞的主要致毒途徑。本研究的結(jié)果為GO的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)研究提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。同時(shí)我們也應(yīng)看到，由于環(huán)境水體中的溶解性有機(jī)質(zhì)、重金屬等物質(zhì)的存在，都可能對排放到水體中的GO的毒性造成影響，因此有必要對影響GO生物毒性的相關(guān)物理及環(huán)境等因素進(jìn)行后續(xù)的研究。

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◆

TheToxicEffectsofGrapheneOxideonCrustaceanDaphniamagna

Shi Liu, Wang Dong, Zhang Ying*, Cao Di, Meng Tiantian, Guo Xi, Zhou Jiti

Key Laboratory of Industrial Ecology and Environmental Engineering (MOE), School of Environmental Science and Technology, Dalian University of Technology, Dalian 116024, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170114007

2017-01-14錄用日期2017-03-30

1673-5897(2017)3-416-09

X171.5

A

張瑛(1972-)，女，博士，副教授，主要研究方向?yàn)樗鷳B(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)及健康風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)。

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(21477014，21261140334)；中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目

石柳(1991-)，女，碩士研究生，研究方向?yàn)樗鷳B(tài)風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)，E-mail: shiliumail@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: yzhang@dlut.edu.cn

石柳, 王棟, 張瑛, 等. 氧化石墨烯對大型溞的生物毒性效應(yīng)研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2017, 12(3): 416-424

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