高丹，馬清萍，張躍恒，姚志峰，林志芬,3,*，于洋

1. 污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實驗室，同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海2000922. 上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海2013063. 上海市化學(xué)品分析、風(fēng)險評估與控制重點(diǎn)實驗室，上海2000924. 環(huán)境保護(hù)部固體廢物與化學(xué)品管理技術(shù)中心，北京100029

磺胺與群體感應(yīng)抑制劑對費(fèi)氏弧菌發(fā)光和生長聯(lián)合毒性效應(yīng)對比研究

高丹1，馬清萍2，張躍恒2，姚志峰1，林志芬1,3,*，于洋4

1. 污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實驗室，同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海2000922. 上海海洋大學(xué)海洋科學(xué)學(xué)院，上海2013063. 上海市化學(xué)品分析、風(fēng)險評估與控制重點(diǎn)實驗室，上海2000924. 環(huán)境保護(hù)部固體廢物與化學(xué)品管理技術(shù)中心，北京100029

抗生素類藥物在廣泛應(yīng)用的同時，也帶來了細(xì)菌耐藥性問題。因此，越來越多的抗生素替代品如群體感應(yīng)抑制劑(QSIs)被研究和應(yīng)用，在未來二者可能共存于環(huán)境之中。為了對它們混合物聯(lián)合毒性評價進(jìn)行系統(tǒng)的研究，本文選擇費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri, V. fischeri)為受試生物，測定了5種磺胺類抗生素(SAs)與6種QSIs對V. fischeri的發(fā)光強(qiáng)度(HV)和生長量(OD600)的聯(lián)合毒性作用，初步探討了SAs與QSIs對V. fischeri發(fā)光聯(lián)合毒性和生長聯(lián)合毒性差異的原因。結(jié)果表明：SAs與QSIs聯(lián)合作用于V. fischeri時，對發(fā)光的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗，對生長的聯(lián)合毒性表現(xiàn)為拮抗或加和，且TUHV>TUOD。這可能是由于QSIs對V. fischeri的發(fā)光的抑制作用可以削弱SAs對發(fā)光的促進(jìn)作用，而SAs與QSIs對V. fischeri的生長都表現(xiàn)出抑制作用，兩者沒有互相削弱作用。同時，基于分子對接和回歸分析法的研究表明了靶蛋白上結(jié)合的化合物有效濃度不同也可能是造成SAs與QSIs聯(lián)合作用于V. fischeri時TUHV>TUOD的主要原因。該研究可以為抗生素與QSIs聯(lián)合暴露的生態(tài)風(fēng)險評價提供借鑒。

磺胺類抗生素；群體感應(yīng)抑制劑；費(fèi)氏弧菌；發(fā)光強(qiáng)度；生長量；聯(lián)合毒性

Received12 January 2017accepted20 February 2017

Abstract: To solve the problem of resistance induced by indiscriminate use of antibiotics, more and more alternatives of antibiotics have been studied and applied such as quorum sensing inhibitors (QSIs). Therefore, they inevitably coexist with antibiotics in the environment. In this study, the combined toxicity of five sulfonamides (SAs) and six QSIs to the luminescence and cell proliferation of Vibrio fischeri (V. fischeri)was measured, and the possible reason for the differences between these effects was also explored. The results revealed that the combined toxicity of the mixture on the luminescence was antagonism, and the combined toxicity of the mixture on the cell proliferation was antagonism or addition. Furthermore, the comparison of their joint effects on the luminescence and cell proliferation was TUHV>TUOD. The inhibition of QSIs on the luminescence can weaken the stimulation of SAs on the luminescence, but the impact of SAs and QSIs on the cell proliferation can not interact with each other. Another possible reason is the difference of their effective combined concentration obtained by the approach of molecular docking and regression analysis. The work can provide some basic data for the ecological risk assessment of joint effects of SAs and QSIs.

Keywords: sulfonamides; quorum sensing inhibitors; Vibrio fischeri;luminescence; cell proliferation; combined toxicity

抗生素自發(fā)現(xiàn)以來，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療衛(wèi)生、農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)等領(lǐng)域。隨著抗生素的研究與應(yīng)用，世界范圍內(nèi)抗生素的使用量逐年增加。其中，中國是世界上生產(chǎn)和使用抗生素最多的國家之一，據(jù)統(tǒng)計我國每年生產(chǎn)和使用的抗生素量高達(dá)21萬噸，其中48%的抗生素被用于農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)[1]。但是近年來隨著抗生素大范圍無節(jié)制的使用，造成抗生素的環(huán)境濃度較高，如方龍飛[2]對黃浦江上游典型抗生素的含量進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)磺胺類抗生素(SAs)平均含量范圍在0.38 ng·L-1～127.68 ng·L-1，四環(huán)素類抗生素(TCs)平均含量范圍在10.81 ng·L-1～916.77 ng·L-1。同時，隨著抗生素的不合理應(yīng)用，其造成的抗性基因問題也已經(jīng)引起人們廣泛的關(guān)注[3-4]，人們不得不尋求抗生素替代品來減緩抗性基因的產(chǎn)生速度。細(xì)菌群體感應(yīng)系統(tǒng)(quorum sensing system, QS系統(tǒng))的發(fā)現(xiàn)為開發(fā)抗生素的替代藥物提供了一條新思路。QS系統(tǒng)是指細(xì)菌通過分泌和感應(yīng)一種叫作自誘導(dǎo)分子(autoinducer, AI)的化學(xué)信號分子進(jìn)行交流，并協(xié)調(diào)群體行為的一種現(xiàn)象，包括細(xì)菌的生物發(fā)光、細(xì)胞膜的合成、致毒因子和細(xì)胞分裂等。群體感應(yīng)抑制劑(quorum sensing inhibitions, QSIs)可抑制細(xì)菌的QS系統(tǒng)，進(jìn)而影響相應(yīng)毒性基因的表達(dá)，而且不易產(chǎn)生抗藥性，因此QSIs被認(rèn)為是未來最有發(fā)展前景的抗生素替代品，已經(jīng)受到研究者的高度重視[5-6]。近年來，QSIs因其獨(dú)特的性質(zhì)在醫(yī)療和食品添加劑行業(yè)中得到了廣泛的應(yīng)用[6]。隨著QSIs的研究與應(yīng)用，其可能會進(jìn)入環(huán)境之中，并與環(huán)境中現(xiàn)有的大量抗生素共存，從而對環(huán)境中的生物體造成混合毒性。因此，開展抗生素與QSIs聯(lián)合毒性及其機(jī)制的研究具有重要的意義，可以為生態(tài)風(fēng)險評價提供科學(xué)依據(jù)。

有關(guān)抗生素與QSIs的聯(lián)合毒性，學(xué)界已經(jīng)進(jìn)行了相關(guān)的研究：主要以費(fèi)氏弧菌(Vibrio fischeri,V. fischeri)的發(fā)光為測試終點(diǎn)，對SAs與QSIs的急性聯(lián)合毒性，以及磺胺類抗生素磺胺氯噠嗪(SCP)、磺胺類增效劑甲氧芐嘧啶(TMP)和4-溴-5-溴亞甲基-2(5氫)-呋喃酮(FC-30)的三元慢性聯(lián)合毒性進(jìn)行了初步的研究，發(fā)現(xiàn)SAs與QSIs對V. fischeri的急性聯(lián)合效應(yīng)較為復(fù)雜，存在相加、拮抗和協(xié)同3種作用，并指出QSIs與靶蛋白LuxR的競爭結(jié)合能力的差異可能是它們與SAs聯(lián)合毒性不同的主要原因[7]。同時研究發(fā)現(xiàn)SCP、TMP和FC-30對V. fischeri的三元慢性聯(lián)合效應(yīng)為拮抗[8]。但是對于SAs與QSIs的二元慢性聯(lián)合毒性及機(jī)制的研究還僅僅處于起步階段。另外，上述研究均是以發(fā)光菌的發(fā)光(HV)為測試終點(diǎn)進(jìn)行毒性表征，而學(xué)術(shù)界以大腸桿菌為受試生物檢測化合物對環(huán)境的毒性時，通常以生長量(OD600)作為測試終點(diǎn)進(jìn)行毒性表征[9-10]。那么，用發(fā)光菌的OD600表征毒性的結(jié)果如何？它是否與用發(fā)光菌的HV表征毒性的結(jié)果一致？這是本研究所關(guān)注和所要回答的問題。

蛋白質(zhì)的空間結(jié)構(gòu)在很大程度上決定了蛋白質(zhì)的功能，其中同源模建和分子對接是研究蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的重要工具。同源模建法可以構(gòu)建模擬蛋白的結(jié)構(gòu)，主要根據(jù)是蛋白序列的相似性，是目前最成熟的預(yù)測蛋白結(jié)構(gòu)的一種方法；而分子對接是研究小分子配體與受體生物大分子的相互作用,并預(yù)測其結(jié)合模式和親和力的一種理論模擬方法[11]。近年來，同源建模和分子對接方法已成為計算機(jī)輔助藥物研究領(lǐng)域的一項重要技術(shù)，在數(shù)據(jù)庫搜尋、組合庫設(shè)計及蛋白作用研究方面得到了廣泛發(fā)展[11]。如Long等[9]研究了SAs和幾種抗生素對大腸桿菌的聯(lián)合毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同的抗生素和SAs的聯(lián)合毒性不同，存在協(xié)同、相加和拮抗3種作用，并且通過分子對接和回歸分析的方法指出這種差異與化合物和對應(yīng)靶蛋白之間的有效結(jié)合濃度相關(guān)。秦孟楠等[12]測定了4種取代脲類除草劑對銅綠微囊藻和羊角月牙藻的96 h急性毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)4種取代脲類除草劑對羊角月牙藻的毒性均大于銅綠微囊藻，并且通過同源建模和分子對接的方法指出取代脲類除草劑與羊角月牙藻的D1蛋白的結(jié)合能力大于銅綠微囊藻，這可能是導(dǎo)致羊角月牙藻對取代脲類除草劑更加敏感的原因。

本研究以經(jīng)典模式生物費(fèi)氏弧菌(V. fischeri)作為受試生物，選取5種SAs(磺胺二甲基嘧啶(SCP)、周效磺胺(SDX)、磺胺甲惡唑(SMX)、磺胺吡啶(SPY)、磺胺二甲異唑(SIX))與6種QSIs(2-甲基四氫呋喃-3-酮(2M3F)、2(5H)-呋喃酮(25HF)、1-吡咯烷-1-環(huán)己烯(1P1C)、L-脯氨醇(S2P)、D-脯氨醇(R2P)、(R)-3-吡咯烷醇(R3P))作為研究對象，分別以發(fā)光強(qiáng)度(HV)和生長量(OD600)作為測試終點(diǎn)進(jìn)行毒性表征，測定了SAs與QSIs對V. fischeri的聯(lián)合毒性，并通過同源建模和分子對接的方法分析了SAs與QSIs對V. fischeri發(fā)光聯(lián)合毒性和生長聯(lián)合毒性差異的原因，以期為生態(tài)風(fēng)險評價提供借鑒意義。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 試劑與生物

V. fischeri (NO.ATTCC7744)購自中科院北京菌種保藏中心。

SAs：磺胺二甲基嘧啶(SCP)、周效磺胺(SDX)、磺胺甲惡唑(SMX)、磺胺吡啶(SPY)、磺胺二甲異唑(SIX)。QSIs：2-甲基四氫呋喃-3-酮(2M3F)、2(5H)-呋喃酮(25HF)、1-吡咯烷-1-環(huán)己烯(1P1C)、L-脯氨醇(S2P)、D-脯氨醇(R2P)、(R)-3-吡咯烷醇(R3P)。SAs與QSIs均為分析純，購自Sigmar-Aldrich化學(xué)制品有限公司(St. Louis, MO, USA)，具體信息見表1。

1.2 V. fischeri慢性毒性測定

1.2.1 工作菌液配制

取適量斜面三代菌種接入5 mL液體培養(yǎng)基，在22 ℃恒溫條件下培養(yǎng)至對數(shù)生長期(12～16 h)成為搖瓶菌液。磁力攪拌40 min后，調(diào)整細(xì)菌光值至15 000～20 000，即可將制成的工作菌液用于毒性測定。

1.2.2 毒性實驗

取待測化合物用適量二甲基亞砜(DMSO)配制成標(biāo)準(zhǔn)溶液，實驗時用2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))NaCl稀釋成對數(shù)梯度系列，取80 μL加入96孔板中。同時取80 μL的2%NaCl作為空白樣。在每個樣品中加入80 μL 2.5倍培養(yǎng)基和40 μL的工作菌液。每個濃度點(diǎn)至少做3個平行。振蕩均勻后，在22 ℃、180 r·min-1的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，采用多功能酶標(biāo)儀LB940測定發(fā)光強(qiáng)度(HV)和生長量(OD600)。根據(jù)單一慢性毒性實驗結(jié)果，配制成等毒性比的二元混合溶液，之后采用和單一慢性毒性測試類似的方法，獲得混合毒性數(shù)據(jù)。計算混合體系的聯(lián)合毒性效應(yīng)。

1.2.3 毒性測試數(shù)據(jù)表征

化合物毒性用其對V. fischeri的發(fā)光抑制率和生長抑制率表述，如式(1)所示:

IHV/OD(%)=(1-S/C)×100/%

(1)

其中，IHV為以HV為測試終點(diǎn)時的抑制率，IOD為以O(shè)D600為測試終點(diǎn)時的抑制率，S為V. fischeri在藥物作用下的HV或者OD600平均值，C為V. fischeri在無藥物作用下的空白HV或者OD600平均值。

實驗所得聯(lián)合毒性效應(yīng)使用毒性單位(toxic unit, TU)表示，其計算方法如式(2)所示：

TU=CA/EC50A+CB/EC50B

(2)

其中，CA和CB是混合體系半數(shù)抑制效應(yīng)時單一污染物(A、B)在混合體系中的摩爾濃度(mol·L-1)；EC50A和EC50B分別是污染物單一污染時的半數(shù)效應(yīng)濃度。

根據(jù)Broderius等[13]的研究，TU=1.00±0.20時表示聯(lián)合毒性效應(yīng)為加和，TU <0.80時表示聯(lián)合毒性效應(yīng)為協(xié)同，TU >1.20時表示聯(lián)合毒性效應(yīng)為拮抗。

1.3 分子對接及Ebinding的計算1.3.1 受體蛋白的同源建模

使用Accelrys公司的Discovery Studio (V 3.1)進(jìn)行同源建模。受體蛋白序列獲取與比對分析服務(wù)由NCBI(National Center for Biotechnology Information)免費(fèi)提供；模板蛋白結(jié)構(gòu)由PDB(Protein Data Bank)獲取。同源建模方法采用Discovery Studio (V 3.1)內(nèi)置方法，以同源性模板蛋白與目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)相似為前提，由目標(biāo)蛋白氨基酸序列組建其結(jié)構(gòu)，并對初始模型使用Loop Refinement進(jìn)行優(yōu)化，使用Ramachandran Plot與Verify-3D對優(yōu)化后的蛋白模型進(jìn)行評價。

1.3.2 分子對接及Ebinding的計算

使用Accelrys公司的Discovery Studio(V 3.1)內(nèi)置CDOKER方法進(jìn)行分子對接，采用CDOKER interaction energy(Ebinding)作為評價參數(shù)[14]，最大負(fù)值即為最穩(wěn)定對接構(gòu)象。

表1 實驗用化合物相關(guān)信息表Table 1 Detailed information of test chemicals

2 結(jié)果與討論(Results and discussion)

2.1 SAs與QSIs對V. fischeri的單一毒性

本文以V. fischeri的發(fā)光強(qiáng)度和生長量為測試終點(diǎn)，研究了5種SAs與6種QSIs的毒性效應(yīng)，結(jié)果如表2和圖1所示。

2.1.1 SAs對V. fischeri的單一毒性

由表2可知，5種SAs對V. fischeri的發(fā)光毒性-lgEC50HV范圍在4.25～5.03 mol·L-1，生長毒性-lgEC50OD范圍在4.19～5.12 mol·L-1。此外，將V. fischeri的-lgEC50HV和-lgEC50OD對比發(fā)現(xiàn)，同一抗生素對V. fischeri的發(fā)光和生長的毒性差值較小，其中SIX的差值最大，但也僅為0.16 mol·L-1。由于V. fischeri發(fā)光是一個由細(xì)菌熒光酶催化的黃素核苷酸和長鏈脂肪醛以及分子氧參與的氧化反應(yīng)[15]，是生化水平的檢測，反應(yīng)時間短，檢測速度快；而細(xì)菌的OD值是反應(yīng)細(xì)菌種群的密度，細(xì)菌繁殖周期與單純的氧化反應(yīng)相比時間較長。因此，一般認(rèn)為用細(xì)菌的發(fā)光值表達(dá)化合物的毒性比OD值表達(dá)毒性更加敏感[15-16]，但由本文實驗結(jié)果可知，某些磺胺類化合物用發(fā)光值和OD值來表達(dá)化合物的毒性幾乎一致。

2.1.2 QSIs對V. fischeri的單一毒性

由表2可知，6種QSIs對V. fischeri的發(fā)光毒性-lgEC50HV范圍在1.76～2.90 mol·L-1，生長毒性-lgEC50OD范圍在1.74～2.87 mol·L-1，且同一種QSIs對V. fischeri的-lgEC50HV>-lgEC50OD。本文研究的QSIs

分為呋喃酮類(包括2M3F和25HF)和吡咯類(包括1P1C、S2P、R2P和R3P)，比較它們的毒性可以看出：

(1)由圖1可知呋喃酮類QSIs之間的毒性差別較大，如發(fā)光效應(yīng)中25HF的發(fā)光毒性-lgEC50HV為2.90 mol·L-1，而2M3F的發(fā)光毒性-lgEC50HV僅為1.76 mol·L-1，兩者的差值為1.14 mol·L-1；生長效應(yīng)中25HF的生長毒性-lgEC50OD為2.87 mol·L-1，而2M3F的生長毒性-lgEC50OD僅為1.74 mol·L-1，兩者的差值為1.13 mol·L-1。

圖1 SAs與QSIs對V. fischeri發(fā)光與生長的單一毒性比較Fig. 1 Comparisons of the single toxicity of SAs and QSIs on the luminescence and cell proliferation of V. fischeri

表2 磺胺類抗生素(SAs)與群體感應(yīng)抑制劑(QSIs)對V. fischeri的發(fā)光和生長的單一毒性Table 2 The single toxicity of sulfonamides (SAs) and quorum sensing inhibitions (QSIs) on the luminescence and cell proliferation of V. fischeri

(2)4種吡咯類QSIs的毒性都十分接近，發(fā)光毒性-lgEC50HV范圍在2.20～2.85 mol·L-1，S2P和1P1C的差值最大，但也僅為0.65 mol·L-1；生長毒性-lgEC50OD范圍在1.84～2.73 mol·L-1，S2P和1P1C的差值最大，但也僅0.89 mol·L-1。

可見，呋喃酮類QSIs之間的毒性差別較大，而吡咯類QSIs之間的毒性都十分接近。這與它們結(jié)構(gòu)的不同密切相關(guān)，呋喃酮類QSIs相互之間結(jié)構(gòu)差異較大，所以產(chǎn)生的毒性差異較大；而吡咯類QSIs中R2P、R3P、S2P結(jié)構(gòu)極其相似，所以產(chǎn)生的毒性也大致相當(dāng)。

2.2 SAs與QSIs對V. fischeri的聯(lián)合毒性2.2.1 聯(lián)合毒性的作用類型

5種SAs與6種QSIs的二元等毒性比混合毒性實驗結(jié)果如表3和圖2所示，并且對每一組混合物對應(yīng)的TUHV和TUOD進(jìn)行了差異顯著性檢驗，在顯著性水平0.05以下相關(guān)的相關(guān)系數(shù)用1個星號“*”加以標(biāo)記，在顯著性水平0.01以下顯著相關(guān)的相關(guān)系數(shù)用2個星號“**”加以標(biāo)記，結(jié)果如圖2所示。

圖2 SAs與QSIs對V. fischeri發(fā)光與生長的 聯(lián)合毒性比較Fig. 2 Comparisons of the combined toxicity of SAs and QSIs on the luminescence and cell proliferation of V. fischeri

由圖2可知，SAs與QSIs聯(lián)合作用于V. fischeri時，TUHV>TUOD。用HV來表達(dá)化合物的毒性時，聯(lián)合效應(yīng)均表現(xiàn)為拮抗作用，TUHV范圍為1.56～2.81；而用OD來表達(dá)化合物的毒性時，16組混合物中有10組聯(lián)合效應(yīng)表現(xiàn)為拮抗作用，6組聯(lián)合效應(yīng)表現(xiàn)為加和作用，TUOD范圍為0.90～2.57。那么是什么原因?qū)е耂As與QSIs聯(lián)合作用于V. fischeri時TUHV>TUOD呢？

2.2.2 聯(lián)合毒性差異定性原因分析

已有的V. fischeri發(fā)光通路的研究表明，低濃度的SAs可能促進(jìn)LuxR的mRNA表達(dá)，刺激LuxR蛋白的合成[17]。細(xì)菌分泌的群體感應(yīng)信號分子N-3-oxo-hexanoyl-homoserine lactone(3-oxo-C6-HSL)可以與LuxR結(jié)合形成C6-LuxR復(fù)合物，該復(fù)合物可以和luxICDABEG基因的啟動子結(jié)合，促進(jìn)luxICDABEG編碼熒光素酶，從而使發(fā)光細(xì)菌發(fā)光增強(qiáng)[18]。因此，如圖3所示，低濃度的SAs可能會通過上述過程促進(jìn)發(fā)光菌發(fā)光。隨著SAs的濃度增加，SAs對LuxR的作用濃度達(dá)到飽和時，剩余的SAs可以與PABA競爭二氫葉酸合成酶(Dhps)，抑制二氫葉酸的形成，影響細(xì)菌DNA的合成，從而抑制細(xì)菌的生長繁殖[19]。由于發(fā)光細(xì)菌發(fā)光是密度依賴型的一種作用方式，當(dāng)細(xì)菌的生長受到抑制時，最終會在光值上得以體現(xiàn)。此外，本文研究的QSIs與C6是結(jié)構(gòu)類似物，如圖3所示，當(dāng)QSIs與SAs聯(lián)合作用于V. fischeri時，QSIs可以與C6競爭性結(jié)合LuxR蛋白，影響細(xì)菌的群體感應(yīng)系統(tǒng)，導(dǎo)致V. fischeri的發(fā)光強(qiáng)度減弱，這可以削弱SAs對V. fischeri發(fā)光的促進(jìn)作用[20]。因此，SAs與QSIs聯(lián)合作用于V. fischeri時，對發(fā)光效應(yīng)有明顯的拮抗作用，具體機(jī)制如圖3所示。

研究表明，SAs可以抑制V. fischeri的生長[19]。此外，如圖3所示，低濃度的SAs可能會促進(jìn)LuxR蛋白的合成，合成的LuxR蛋白可以和C6結(jié)合形成C6-LuxR復(fù)合物，這一過程也可以促進(jìn)LuxI蛋白的合成，LuxI蛋白可進(jìn)一步刺激細(xì)菌體內(nèi)C6的合成，從而使以上過程不斷得到加強(qiáng)[21]。當(dāng)SAs與QSIs聯(lián)合作用于V. fischeri時，QSIs可以和C6競爭結(jié)合LuxR蛋白，導(dǎo)致LuxI蛋白的合成量下降，進(jìn)而使C6的合成量降低，C6-LuxR復(fù)合物的數(shù)量減少，最終導(dǎo)致體系中LuxR蛋白量相對升高，SAs消耗量降低，這可以使SAs與Dhps的作用濃度升高，從而進(jìn)一步抑制V. fischeri的生長。因此，SAs與QSIs對V. fischeri生長的作用效果一致，均為抑制作用，具體機(jī)制如圖3所示。

表3 SAs與QSIs對V. fischeri發(fā)光和生長的聯(lián)合毒性Table 3 The combined toxicity of SAs and QSIs on the luminescence and cell proliferation of V. fischeri

圖3 SAs與QSIs對V. fischeri發(fā)光和生長的聯(lián)合毒性作用機(jī)制假設(shè)圖Fig. 3 Mechanistic hypothesis for the combined toxicity between SAs and QSIs on the luminescence and cell proliferation of V. fischeri

由以上分析可知，對于V. fischeri的發(fā)光效應(yīng)而言，QSIs對發(fā)光的抑制作用可以削弱SAs對發(fā)光的促進(jìn)作用，而對于V. fischeri的生長效應(yīng)而言，SAs與QSIs對生長都表現(xiàn)出抑制作用，兩者沒有互相削弱作用。因此SAs與QSIs聯(lián)合作用于V. fischeri時，TUHV>TUOD，即發(fā)光效應(yīng)和生長效應(yīng)相比，聯(lián)合用藥對前者表現(xiàn)出更大的拮抗性。這是SAs與QSIs聯(lián)合作用于發(fā)光菌時TUHV>TUOD的定性解釋。

2.2.3 聯(lián)合毒性差異定量原因分析

Zou等[22]在研究磺胺類化合物與其增效劑對明亮發(fā)光桿菌的急性聯(lián)合毒性與慢性聯(lián)合毒性時，采用化合物與目標(biāo)靶蛋白的結(jié)合能(Ebinding)表征化合物與目標(biāo)靶蛋白的相互作用，發(fā)現(xiàn)急性聯(lián)合毒性與慢性聯(lián)合毒性的差異與靶蛋白的不同有關(guān)。此外，對比急性聯(lián)合毒性及慢性聯(lián)合毒性測試體系中各受體結(jié)合能前的擬合系數(shù)可進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，急性聯(lián)合毒性與慢性聯(lián)合毒性的差異，不僅與靶蛋白的不同有關(guān)，還與靶蛋白上結(jié)合的化合物有效濃度不同密切相關(guān)。那么，SAs與QSIs聯(lián)合作用于V. fischeri時TUHV>TUOD是否與靶蛋白上結(jié)合的化合物有效濃度不同相關(guān)呢？

從上文有關(guān)SAs與QSIs對V. fischeri發(fā)光效應(yīng)影響的混合毒性機(jī)制的分析中可知，SAs與QSIs的混合毒性和以下3個方面相關(guān)：SAs可能通過刺激LuxR蛋白的合成，從而促進(jìn)發(fā)光細(xì)菌發(fā)光，同時研究表明LitR蛋白可以調(diào)控LuxR蛋白的合成[23]，因此我們推測SAs對LuxR蛋白合成的刺激作用，源于SAs與LitR蛋白的作用；SAs通過競爭結(jié)合Dhps蛋白最終對發(fā)光產(chǎn)生抑制效應(yīng)；QSIs與LuxR蛋白結(jié)合，從而阻斷部分luxICDABEG的表達(dá)，使得V. fischeri的發(fā)光減弱。因此本文選擇SAs與QSIs和不同的目標(biāo)靶蛋白之間相互作用的結(jié)合能Ebinding值作為表征參數(shù)，與測得的聯(lián)合毒性數(shù)據(jù)-lgEC50MHV值進(jìn)行回歸分析，回歸結(jié)果如下式所示：

(3)

從上文有關(guān)SAs與QSIs對V. fischeri生長效應(yīng)影響的混合毒性機(jī)制的分析中，可以看出SAs與QSIs的混合毒性和以下2個方面相關(guān)：SAs通過競爭結(jié)合Dhps蛋白從而對生長產(chǎn)生抑制效應(yīng)；QSIs通過競爭結(jié)合LuxR蛋白，抑制LuxI蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致C6生成量降低，C6-LuxR復(fù)合物的數(shù)量減少，體系中LuxR蛋白量相對升高，導(dǎo)致SAs與Dhps作用的濃度升高，從而進(jìn)一步抑制發(fā)光菌的生長。因此本文選擇SAs與QSIs和不同的目標(biāo)靶蛋白之間相互作用的結(jié)合能Ebinding值作為表征參數(shù)，與測得的聯(lián)合毒性數(shù)據(jù)-lgEC50MOD值進(jìn)行回歸分析，回歸結(jié)果如下式所示：

(4)

(N=16, R2=0.663, SD=0.217, F=15.732, P=0.000)

(5)

方程(3)中SAs與QSIs的有效作用濃度比可表示為：

(6)

方程(4)中SAs與QSIs的有效作用濃度比可表示為：

(7)

綜上所述：

(1)本文分別測定了5種SAs與6種QSIs(呋喃酮類和吡咯類)對V. fischeri發(fā)光和生長的單一毒性，結(jié)果表明：同一種SAs對V. fischeri發(fā)光和生長的毒性差值較??；QSIs中呋喃酮類QSIs之間毒性差別較大，而吡咯類QSIs之間的毒性都十分接近，這與它們結(jié)構(gòu)的不同密切相關(guān)。

(2)測定了SAs與QSIs對V. fischeri發(fā)光和生長的聯(lián)合毒性，結(jié)果表明SAs與QSIs聯(lián)合作用于V. fischeri時，TUHV>TUOD。這可能是由于QSIs對發(fā)光的抑制作用可以削弱SAs對發(fā)光的促進(jìn)作用，而SAs與QSIs對V. fischeri的生長都表現(xiàn)出抑制作用，兩者沒有互相削弱作用。

(3)化合物與靶蛋白結(jié)合的有效濃度不同也可能是造成SAs與QSIs聯(lián)合作用于V. fischeri時TUHV>TUOD的主要原因。

需要指出的是，本文研究的是5種SAs與6種QSIs對V. fischeri的等毒性比聯(lián)合毒性，但是有時聯(lián)合毒性的結(jié)果與使用的目標(biāo)化合物的濃度存在很大的關(guān)系，不同的濃度配比可能會出現(xiàn)不同的聯(lián)合毒性結(jié)果。因此，在后續(xù)研究中建議增加這些污染物對V. fischeri的二元非等比聯(lián)合毒性效應(yīng)研究。

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◆

TheComparativeStudyontheCombinedToxicityofSulfonamidesandQuorumSensingInhibitorsontheLuminescenceandCellProliferationofVibriofischeri

Gao Dan1, Ma Qingping2, Zhang Yueheng2, Yao Zhifeng1, Lin Zhifen1,3,*, Yu Yang4

1. State Key Laboratory of Pollution Control and Resource Reuse, School of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China2. School of Marine Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China3. Shanghai Key Laboratory for Chemicals Analysis, Risk Assessment and Control, Shanghai 200092, China4. Solid Waste and Chemicals Management Center, Ministry of Environmental Protection, Beijing 100029, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170112010

2017-01-12錄用日期2017-02-20

1673-5897(2017)3-290-11

X171.5

A

林志芬(1972-)，女，博士，教授，主要研究方向為混合污染物生物效應(yīng)及人體健康評價。

同濟(jì)大學(xué)污染控制與資源化研究國家重點(diǎn)實驗室自主研究(重點(diǎn))項目(PCRRY16007)；國家自然科學(xué)面上基金(21377096, 21577105, 21777123)；上海市科學(xué)技術(shù)委員會科研計劃課題(14DZ2261100, 17DZ1200103)；環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點(diǎn)實驗室開放基金課題(KF2016-11)

高丹(1992-)，女，碩士研究生，研究方向為微生物毒理學(xué)，E-mail: gdwhygar@163.com;

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: lzhifen@#edu.cn

高丹，馬清萍，張躍恒, 等. 磺胺與群體感應(yīng)抑制劑對費(fèi)氏弧菌發(fā)光和生長聯(lián)合毒性效應(yīng)對比研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2017, 12(3): 290-300

Gao D, Ma Q P, Zhang Y H, et al. The comparative study on the combined toxicity of sulfonamides and quorum sensing inhibitors on the luminescence and cell proliferation of Vibrio fischeri [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 290-300 (in Chinese)