朱婧涵，薛嶠，劉嫻，張愛茜,*

1. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 1000852. 中國科學(xué)院大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100049

p,p′-DDE與雄激素受體突變體H874Y及T877A激動性作用機制的理論研究

朱婧涵1,2，薛嶠1,2，劉嫻1,2，張愛茜1,2,*

1. 中國科學(xué)院生態(tài)環(huán)境研究中心 環(huán)境化學(xué)與生態(tài)毒理學(xué)國家重點實驗室，北京 1000852. 中國科學(xué)院大學(xué) 資源與環(huán)境學(xué)院，北京 100049

1,1-二氯-2,2-雙(對氯苯基)乙烯(p,p′-DDE)是一種已知的雄激素受體(androgen receptor, AR)拮抗劑。有趣的是，已有研究證實p,p′-DDE同時可經(jīng)由作用于AR的2種天然突變體H874Y和T877A產(chǎn)生擬雄激素效應(yīng)，但其相互作用的分子機制尚不清晰。本研究聯(lián)用分子動力學(xué)模擬與MM-GBSA方法，以內(nèi)源性激素二氫睪酮(DHT)作為對照，對p,p′-DDE與2種突變體的相互作用分子機制進行了研究。模擬結(jié)果指出范德華相互作用是維持p,p′-DDE與AR突變體結(jié)合的主要驅(qū)動力，而溶劑化作用的差異是導(dǎo)致p,p′-DDE與H874Y具有較高結(jié)合活性的主要原因，H874Y結(jié)合口袋與p,p′-DDE的結(jié)構(gòu)匹配度優(yōu)于與T877A。與內(nèi)源性配體二氫睪酮相比較，范德華作用與靜電相互作用的差異是造成p,p′-DDE比DHT結(jié)合活性低的主要原因，p,p′-DDE與AR突變體之間缺乏氫鍵的穩(wěn)定。MM-GBSA的結(jié)果確定p,p′-DDE與突變體結(jié)合過程的關(guān)鍵氨基酸以疏水性殘基為主，其中L704、M745、L873尤為重要。計算獲得的p,p′-DDE對H874Y及T877A相互作用分子機制有助于理解該污染物在不同人群中內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的差異。

p,p′-DDE；雄激素受體突變體H874Y；雄激素受體突變體T877A；分子動力學(xué)；MM-GBSA

Received14January2017accepted8March2017

Abstract:1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethylene (p,p′-DDE) as a typical androgen receptor (AR) antagonist exhibits agonism effect on AR mutants H874Y or T877A. The structural basis for agonism mechanisms of p,p′-DDE via H874Y/T877A is still unclear. Thus, molecular dynamics (MD) simulations combined with MM-GBSA was used to perform computational calculations for exploring the interaction features of p,p′-DDE-AR mutant complex. The result is consistent with the reported experiment. The Van der Waals interaction is found to be the predominant driving force facilitating the complex stability. Compared with T877A, H874Y presents a higher binding activity with p,p'-DDE due to its favorable solvation effect, and its binding pocket fits p,p′-DDE better than T877A. In comparison with the endogenous ligand dihydrotestosterone, p,p'-DDE shows lower mutant binding affinity because of decreased van der Waals energy and electrostatic energy. The lack of hydrogen bonds between p,p′-DDE and AR-mutants destabilizes the interaction between p,p'-DDE and AR mutants. Moreover, the result of MM-GBSA identifies the key residues between p,p'-DDE and AR mutants. Nonpolar residues in the binding pocket, especially L704, M745and L873, play important roles in the binding process. The obtained molecular mechanism for the interaction between p,p′-DDE and the AR mutants provides insight to the cohort effect observed for the health hazard of the pollutant.

Keywords: p,p′-DDE; AR mutant H874Y; AR mutant T877A; molecular dynamics simulation; MM-GBSA

雄激素受體(androgen receptor, AR)是核受體超家族成員之一[1]，可與內(nèi)源性雄激素雙氫睪酮(dihydrotestosterone, DHT)結(jié)合進入細(xì)胞核中，結(jié)合靶基因上的雄激素受體反應(yīng)元件，在招募不同類型的共調(diào)節(jié)因子后發(fā)揮其調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄的功能[2]。研究發(fā)現(xiàn)，前列腺癌(prostate cancer, PCa)細(xì)胞中AR編碼區(qū)存在許多天然突變體，而其配體結(jié)合域(ligand binding domain, LBD)是突變發(fā)生頻率最大的區(qū)域[3-4]。T877A和H874Y均是AR-LBD中較為常見的突變。T877A突變發(fā)生于LNCaP細(xì)胞和CRPC組織樣本[5]，它位于AR-LBD的H11上并處在結(jié)合口袋之中[6]，其突變能夠影響AR與雄激素、非雄激素性類固醇(如雌激素和孕激素)和雄激素拮抗劑等多種化合物的調(diào)控效應(yīng)[5]。H874Y突變主要存在于22Rv1細(xì)胞系中，它同樣位于H11上，但遠(yuǎn)離配體結(jié)合口袋[1]，研究表明它能夠間接影響AR的配體和共激活因子結(jié)合的特異性[7]。這2種突變均能夠擴大AR配體特異性的范圍[8-9]，使得AR變得異?；罨a(chǎn)生功能性紊亂[10-11]。

1,1-二氯-2,2-雙(對氯苯基)乙烯(1,1-dichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethylene, p,p′-DDE)是1,1,1-三氯-2,2-雙(對氯苯基)乙烷(1,1,1-trichloro-2,2-bis(p-chlorophenyl)ethane, DDT)最主要的代謝產(chǎn)物，其結(jié)構(gòu)如圖1所示。p,p′-DDE是一種典型的具有穩(wěn)定化學(xué)性質(zhì)、較強親脂性以及抗新陳代謝性的持久性有機污染物，它能夠通過食物鏈逐漸在動物和人體組織中長時間累積[12-13]。有數(shù)據(jù)顯示，p,p′-DDE在人體血漿中的半存留期長達10年[14]。作為一種典型的環(huán)境內(nèi)分泌干擾物，p,p′-DDE具有較強的抗雄激素效應(yīng)[15]，當(dāng)其進入人體后，會與AR的LBD直接結(jié)合，阻斷AR介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路并抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄。目前已有研究表明p,p′-DDE能夠引起嬰幼兒神經(jīng)發(fā)育障礙[16-17]，增大人體患乳腺癌[18]、前列腺癌[19]、糖尿病[20]和病態(tài)妊娠的風(fēng)險[21]。

圖1 p,p′-DDE(左)和二氫睪酮(右)的化學(xué)結(jié)構(gòu)Fig. 1 Chemical structures of p,p′-DDE (left) and dihydrotestosterone (DHT) (right)

研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)AR的His874和Thr877分別突變成Tyr874和Ala877時，p,p′-DDE的抗雄激素效應(yīng)會轉(zhuǎn)變?yōu)閿M雄激素激動效應(yīng)，介導(dǎo)H874Y/T877A突變體發(fā)生異常的雄激素非依賴性激活，在雄激素去勢的情況下刺激PCa細(xì)胞的增殖，促進異種腫瘤的生長。而熒光素酶活性實驗證實，DHT是突變體H874Y和T877A的強激動劑，以DHT作為AR激動活性的陽性對照，p,p′-DDE與H874Y/T877A的活性分別為DHT的36.5%和9.9%，均遠(yuǎn)低于DHT[22]。可見，p,p′-DDE是這2個AR突變體的弱激動劑。但目前對于p,p′-DDE這種奇特的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)還缺乏分子層次的認(rèn)知，尤其是p,p′-DDE對H874Y及T877A的激動性干擾效應(yīng)是更值得關(guān)注的科學(xué)問題。同時，實驗結(jié)果還表明相比于T877A，H874Y對p,p′-DDE具有更高的親和性，但對于其親和性的差異也缺乏研究。目前關(guān)于p,p′-DDE與AR及突變體的研究大多還集中于其生物效應(yīng)層面，缺乏結(jié)構(gòu)方面的信息，這嚴(yán)重制約了全面認(rèn)知p,p′-DDE對AR的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。

為了從結(jié)構(gòu)層面解析p,p′-DDE與H874Y及T877A相互作用的分子基礎(chǔ)，本研究采用分子動力學(xué)(molecular dynamics, MD)模擬的方法，分別對p,p′-DDE-H874Y、p,p′-DDE-T877A復(fù)合物進行了研究，用以探索p,p′-DDE與2種突變體的激動性結(jié)合機制。為了更明晰這種激動性效應(yīng)的分子基礎(chǔ)，我們還對內(nèi)源性配體DHT與H874Y及T877A的復(fù)合物也進行了長程的MD模擬用以對照。4個復(fù)合物體系分別進行了80 ns時長的MD模擬，采用多種結(jié)構(gòu)分析并使用MM-GBSA的方法計算了各體系受體配體之間的結(jié)合自由能與單個氨基酸的能量貢獻。該結(jié)果將有助于在原子層面探索p,p′-DDE與AR突變體產(chǎn)生激動效應(yīng)的分子機制，對全面理解p,p′-DDE與AR的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)提供理論基礎(chǔ)。

1 模擬方法(Methods)

1.1 理論模型的建立

蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(Protein Data Bank, PDB)中缺少p,p′-DDE與H874Y和T877A的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，必須使用理論方法構(gòu)建其復(fù)合物結(jié)構(gòu)。因此，實驗采用Sybyl-X 1.2軟件包中Surflex-Dock模塊進行分子對接，其中H874Y和T877A均采用了PDB中的晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID 分別為2Q7K和2OZ7)，以此來保證受體蛋白模板的可信性。在對接前對蛋白的結(jié)構(gòu)進行了分析與前處理，補全蛋白質(zhì)缺失殘基并確定了相關(guān)氨基酸殘基的質(zhì)子態(tài)。采用Powell方法計算能量優(yōu)化構(gòu)象，Gasteiger Hückel方法計算原子電荷，Tripos標(biāo)準(zhǔn)分子力場進行優(yōu)化，能量收斂標(biāo)準(zhǔn)為0.005 kcal·(mol·?)-1，最大迭代次數(shù)為1 000，最終以打分最高的對接構(gòu)象為基礎(chǔ)，經(jīng)過分子力學(xué)的優(yōu)化，構(gòu)建p,p′-DDE-H874Y和p,p′-DDE-T877A這2種復(fù)合物結(jié)構(gòu)。從PDB中獲得DHT與AR野生型復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 1T7T)，使用Sybyl-X 1.2分別對其進行H874和T877單點氨基酸突變，獲得DHT-H874Y和DHT-T877A的復(fù)合物結(jié)構(gòu)。為了驗證對接方法的可靠性及對接參數(shù)的合理性，在構(gòu)建復(fù)合物結(jié)構(gòu)之前，將晶體結(jié)構(gòu)(PDB ID: 2Q7K、2O7Z)中共結(jié)晶的配體小分子提取出來，重新將其對接至活性口袋，并將所得到的配體最優(yōu)構(gòu)象與其共結(jié)晶構(gòu)象等進行對比。結(jié)果顯示對接獲得的配體2Q7K與2O7Z空間取向和結(jié)合模式與結(jié)晶構(gòu)象完全一致，其均方根偏差分別僅為0.15和0.72 ?(圖2)，表明所采用的對接手段能夠再現(xiàn)共結(jié)晶配體同受體蛋白的結(jié)合模式，生成的原型復(fù)合物適合用于作為后續(xù)分子動力學(xué)模擬的起始結(jié)構(gòu)。

1.2 分子動力學(xué)模擬

在模擬過程中，受體蛋白的拓?fù)鋮?shù)均采用AMBER12中的ff12SB力場構(gòu)建。配體的原子點電荷計算采用AMBER12 antechamber程序AM1-BCC電荷模型，力場參數(shù)使用General AMBER Force Field (GAFF)生成[23]。使用Amber12程序包中LEaP模塊添加體系中缺失的氫原子，并向體系中添加相應(yīng)的Cl-離子以保持體系的電中性。在模擬過程中采用周期邊界條件，溶劑模型為TIP3P水模型，從水盒子的任意邊界到復(fù)合物任意原子之間的距離至少8 ?。

AMBER12 PMEMD程序用于能量最小化、加熱和體系的平衡。首先，對整個體系進行能量最小化。第一步最小化過程以10 kcal·mol-1·?-2的約束力常數(shù)約束溶質(zhì)，對體系進行1 000步的最陡下降法和1 000步的共軛梯度法來先后優(yōu)化體系中的溶劑環(huán)境；第二步最小化過程以2 000步最陡下降法和3 000步共軛梯度法來先后對體系進行全原子優(yōu)化，以去除整個體系中能量不正常的相互作用。每一步的最小化過程中非鍵截斷半徑均為10 ?。

優(yōu)化之后的復(fù)合物結(jié)構(gòu)采用Langevin動力學(xué)方法[24]使體系在300 ps內(nèi)由0 K升溫至300 K，碰撞頻率為1 ps-1，約束力常數(shù)為10 kcal·mol-1·?-2。隨后在正則系綜(NVT)條件下進行了50 ps時長的MD模擬對體系進行平衡。最后在等溫等壓(NPT, P=1 atm, T=300 K)條件下分別對4個復(fù)合物體系進行了80 ns的長程動力學(xué)模擬。在模擬中，采用PME方法計算長程靜電相互作用[25]，所有含氫原子的鍵的伸縮均使用SHAKE算法進行約束[26]，整個體系的非鍵截斷半徑為10 ?，時間步長設(shè)置為2 fs[27-28]，每2 ps保存一幀構(gòu)象。

1.3 MM-GBSA自由能計算

為了從能量層面探究p,p′-DDE-H874Y、p,p′-DDE-T877A、DHT-H874Y和DHT-T877A這4個復(fù)合物體系中配體與蛋白質(zhì)之間的相互作用機制，實驗采用MM-GBSA方法計算蛋白質(zhì)-配體復(fù)合物之間的結(jié)合自由能。結(jié)合自由能的計算原理如下：

ΔGbind=Gcomplex-(Gprotein+Gligand)

(1)

Gbind=Emm+Gsolv-TS

(2)

Emm=Einternal+Eelectrostatic+EvdW

(3)

Gsolv=GGB+GSA

(4)

GSA=γSASA+b

(5)

Gcomplex、Gprotein和Gligand分別為復(fù)合物、蛋白質(zhì)和配體的自由能。Emm和Gsolv代表分子力學(xué)自由能及溶劑化自由能。TS為結(jié)合構(gòu)象熵，包括溶質(zhì)分子在構(gòu)象上的平移、轉(zhuǎn)動以及振動[29]。Emm包括內(nèi)能Einternal(鍵能伸縮Ebond、鍵角彎曲能Eangle和二面角扭轉(zhuǎn)能Edihedral)，靜電能Eelectrostatic和范德華能EvdW[30]。Gsolv包括極性溶劑化自由能GGB和非極性溶劑化自由能GSA[30]。極性溶劑化自由能GGB由廣義波恩(Generalized Born, GB)[31]模型計算得出，而非極性溶劑化自由能ΔGSA則是使用LCOP方法[32]計算溶劑可及表面積(solvent accessible surface area, SASA)，通過經(jīng)驗公式GSA=γSASA+b計算得出[33]；本實驗中，水分子探測半徑為1.4 ?[34]，表面張力常數(shù)γ為0.0072 kcal·mol-1·nm-2[35]，常數(shù)b為0。使用MM-GBSA方法在40～80 ns軌跡中選取500幀軌跡，計算Emm、GGB、GSA和每個氨基酸殘基對結(jié)合自由能的能量貢獻。構(gòu)象熵變-TΔS采用AMBER12中Nmode模塊的正則模分析方法計算[30]，由于熵的計算量龐大[35]，實驗從40～80 ns軌跡中每800 ps選取1幀，共選取50幀來計算熵。

2 結(jié)果與討論(Results and discussions)

2.1 復(fù)合物的整體結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性

均方根偏差(root-mean-square deviation, RMSD)可以反映出整個模擬過程蛋白結(jié)構(gòu)的變化。實驗使用AMBER中的ptraj程序計算了蛋白質(zhì)主鏈原子(Cα, C, N)的RMSD值來表征整個體系的平衡與穩(wěn)定性，并計算處于活性位點距離配體在4 ?以內(nèi)的氨基酸殘基Cα原子的RMSD值來表征結(jié)合模式的穩(wěn)定性，圖3所示。圖3a表明，4個復(fù)合物體系的RMSD值在模擬6 ns之后均未發(fā)生顯著的變化且漲落范圍低于1.8 ?，這說明H874Y和T877A在分別結(jié)合DHT或p,p′-DDE之后未發(fā)生劇烈的構(gòu)象變化，2種復(fù)合物激動構(gòu)象的穩(wěn)定性與之前的實驗結(jié)果是一致的，也說明了p,p′-DDE在H874Y及T877A中是激動作用。但還應(yīng)注意到每個復(fù)合的RMSD值都存在差異性，其中，p,p′-DDE-T877A復(fù)合物主鏈原子RMSD值最高，說明T877A在結(jié)合p,p′-DDE之后構(gòu)象變化最大，整個復(fù)合物的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性低于其他3個復(fù)合物體系；H874Y和T877A與DHT結(jié)合后，RMSD值均比與p,p′-DDE復(fù)合物低，這反應(yīng)了DHT與AR突變體的結(jié)合比p,p′-DDE更穩(wěn)定。此外，p,p′-DDE-H874Y復(fù)合物蛋白質(zhì)主鏈原子在30～36 ns之間發(fā)生了一定程度的波動，之后持續(xù)保持穩(wěn)定。進一步分析了活性區(qū)域附近氨基酸及配體自身的RMSD曲線，如圖3b及3c所示?？梢钥闯?，相比與DHT，2個p,p′-DDE復(fù)合物中結(jié)合位點附近氨基酸的RMSD的波動幅度較大，這反映出p,p′-DDE在模擬過程中經(jīng)歷了結(jié)構(gòu)調(diào)整，由于PDB中并沒有p,p′-DDE及AR的晶體結(jié)構(gòu)，所構(gòu)建的p,p′-DDE復(fù)合物在模擬前僅經(jīng)過分子力學(xué)優(yōu)化，因此p,p′-DDE在MD模擬過程中的構(gòu)象變化也說明了MD模擬能夠更好地表現(xiàn)受體配體之間的誘導(dǎo)-契合效應(yīng)。為了避免初始模型的不準(zhǔn)確及模擬本身升溫等因素的影響，我們選取軌跡中最平穩(wěn)的40～80 ns之間的軌跡進行進一步的結(jié)構(gòu)分析。

圖3 (a)p,p′-DDE-H874Y、p,p′-DDE-T877A、DHT-H874Y和DHT-T877A復(fù)合物體系的雄激素受體(AR)主鏈原子隨時間變化的RMSD曲線；(b)處于活性位點距離配體在4 ?之內(nèi)的氨基酸Cα原子隨時間變化的RMSD曲線；(c)配體隨時間變化的RMSD曲線Fig. 3 RMSDs time profile of (a) backbone atoms of the androgen receptor (AR); (b) Cα atoms for the residues around 4 ? of the ligand; (c) ligand

2.2 聚類分析

實驗使用AverageLinkage算法對40～80 ns的軌跡進行了聚類分析，按照Cα原子的RMSD值聚類，最終得到5個構(gòu)象的集合。其中，p,p′-DDE-H874Y、p,p′-DDE-T877A、DHT-H874Y和DHT-T877A這4個體系最大聚類構(gòu)象集合所占總的構(gòu)象比例分別為74.3%、56.7%、91.8%和99.7%，這也反映出在模擬的后半程，整個復(fù)合物非常穩(wěn)定。實驗選擇軌跡中占有率最高的構(gòu)象作為最具有代表性構(gòu)象，將其與初始構(gòu)象進行對比，如圖4所示。從圖4a中可以看出，DHT-AR復(fù)合物體系未發(fā)生明顯的變化，且DHT的位置也基本穩(wěn)定；而在p,p′-DDE-AR的2個突變體復(fù)合物中(圖4b)，p,p′-DDE在結(jié)合口袋處的位置均存在較大的偏移，這意味著p,p′-DDE與AR的結(jié)合不如DHT穩(wěn)定。

2.3 MM-GBSA結(jié)合自由能及重要氨基酸的識別

為了系統(tǒng)性地研究p,p′-DDE與H874Y及T877A結(jié)合活性的來源，通過MM-GBSA方法從能量角度來探究p,p′-DDE與H874Y及T877A的相互

作用。表1列出了p,p′-DDE-H874Y、p,p′-DDE-T877A、DHT-H874Y和DHT-T877A的結(jié)合自由能，分別為-25.08 kcal·mol-1、-24.82 kcal·mol-1、-33.58 kcal·mol-1和-32.44 kcal·mol-1，計算結(jié)果有利于受體與配體的結(jié)合，且順序與實驗活性順序相一致，這進一步驗證了p,p′-DDE是AR突變體的弱激動劑。對于4個復(fù)合物體系，范德華相互作用(ΔEvdW)是結(jié)合自由能最大來源，是維持結(jié)合穩(wěn)定性的主要驅(qū)動力；同時，范德華相互作用在不同化合物之間也存在差異，主要是因為p,p′-DDE與DHT自身分子性質(zhì)不同所造成。p,p′-DDE中通過一個sp2雜化的碳原子將2個對位氯取代的苯環(huán)相互連接在一起，看似對稱的結(jié)構(gòu)，實則由于苯環(huán)和sp2雜化碳形成的σ鍵以及乙烯基碳與氯形成的σ鍵可以沿著鍵軸旋轉(zhuǎn)而導(dǎo)致2個苯環(huán)并非在一個平面上，即該分子本身就是極性分子，具有永久偶極。而DHT的甾核具有較高的結(jié)構(gòu)剛性，可塑性低于p,p′-DDE。另外，DHT多為飽和C原子使得其極性較低與口袋更匹配，因此DHT與受體結(jié)合時具有更強的范德華作用。對比p,p′-DDE與DHT復(fù)合物，靜電能(ΔEelectrostatic)的差異巨大，是導(dǎo)致2個化合物結(jié)合活性不同的重要原因。p,p′-DDE與H874Y及T877A的靜電能僅為-2.48 kcal·mol-1及-2.63 kcal·mol-1，說明p,p′-DDE與突變體之間幾乎沒有穩(wěn)定的靜電相互作用如氫鍵、鹽橋等。而由于化合物處于AR的疏水空腔，考慮極性溶劑化自由能之后，對整體的極性相互作用(ΔGpol)而言，DHT-H874Y的ΔGpol是有利于結(jié)合的(-1.82 kcal·mol-1)，但DHT-T877A(0.43 kcal·mol-1)、p,p′-DDE-H874Y(3.13 kcal·mol-1)和p,p′-DDE-T877A(3.41 kcal·mol-1)復(fù)合物的ΔGpol均不利于結(jié)合。對于DHT-T877A復(fù)合物來說，這表明突變一方面減弱了受體配體之間的靜電相互作用，另一方面也帶來了更為不利的極性溶劑化效應(yīng)。而相對于p,p′-DDE-H874Y而言，p,p′-DDE-T877A也含有更為不利的極性溶劑化作用。由于T877A突變處于結(jié)合口袋區(qū)域，這反映出T877A的突變加劇了化合物與口袋之間的不兼容性。上述結(jié)果說明p,p′-DDE是AR這2種突變體的弱激動劑，其親和性較DHT低的原因主要是靜電相互作用較弱，另一方面p,p′-DDE較少的非極性基團也導(dǎo)致其與AR突變體的范德華相互作用偏低。

通過比較p,p′-DDE-H874Y與p,p′-DDE-T877A，我們發(fā)現(xiàn)p,p′-DDE對H874Y表現(xiàn)出更高的親和性。通過對比可以看出，2個突變體之間的結(jié)合自由能差別很小，主要的區(qū)別在于溶劑化作用，p,p′-DDE與H874Y的溶劑化能為0.39 kcal·mol-1，而p,p′-DDE與T877A的溶劑化能為1.09 kcal·mol-1。這更進一步說明了T877A突變引起了結(jié)合口袋環(huán)境的改變，導(dǎo)致p,p′-DDE與結(jié)合口袋的不兼容性，和我們之前的結(jié)論相一致。T877A對p,p′-DDE結(jié)合活性的影響更為明顯。

圖5 單個氨基酸殘基的結(jié)合自由能Fig. 5 Binding free energy of individual amino acid residue

表1 復(fù)合物DHT-H874Y、DHT-T877A、p,p′-DDE-H874Y和p,p′-DDE-T877A之間的結(jié)合自由能(kcal·mol-1)Table 1 The calculated binding free energies of DHT-H874Y, DHT-T877A, p,p′-DDE-H874Y and p,p′-DDE-T877A (kcal·mol-1)

Note: ①ΔGpol=ΔEelectrostatic+ΔGGB; ②ΔGnonpol=ΔEvdW+ΔGSA; ③ΔG=ΔEvdW+ΔEelectrostatic+ΔGGB+ΔGSA; ④ΔΔG=ΔG -TΔS.

為了進一步確定在結(jié)合過程中的關(guān)鍵氨基酸，我們將結(jié)合自由能總能量分解到每個單獨的氨基酸上。圖5分別標(biāo)出了4個體系中對結(jié)合自由能貢獻值小于-0.80 kcal·mol-1的重要氨基酸殘基。DHT-H874Y、DHT-T877A、p,p′-DDE-H874Y和p,p′-DDE-T877A重要氨基酸數(shù)目分別為12個、13個、9個及7個。顯然，DHT與H874Y及T877A中更多的氨基酸存在分子間相互作用，與AR結(jié)合的更為緊密。從圖5中還可以看出，L704、M742、M745、F764、L873在4個復(fù)合物的配體受體結(jié)合過程中均有重要貢獻，表明了這些氨基酸對化合物與AR的2種突變體結(jié)合的重要性，而這些氨基酸均為非極性氨基酸，也再一次驗證了非極性相互作用對穩(wěn)定配體受體相互作用的重要性。尤其應(yīng)當(dāng)注意到L704、M745、L873這3個氨基酸對突變體與p,p′-DDE的自由能貢獻非常顯著，是p,p′-DDE與突變體結(jié)合極為重要的氨基酸。相對于DHT而言，p,p′-DDE并沒有貢獻顯著的極性氨基酸，而DHT則與N705有很強的分子間相互作用。除此之外，對比p,p′-DDE-H874Y與p,p′-DDE-T877A可以看出(如圖6所示)，p,p′-DDE與H874Y之間有更多的非極性氨基酸存在分子間相互作用，也表明了p,p′-DDE與H874Y的結(jié)合口袋更兼容。

從分解能中也可以確定每個氨基酸與p,p′-DDE及DHT之間的作用方式，如圖7所示。對p,p′-DDE來說，不論是與H874Y還是T877A結(jié)合，氨基酸的范德華力均是其自由能貢獻的主要來源。而對于DHT-H874Y來說，N705和T877有顯著的極性自由能貢獻(分別為-3.74 kcal·mol-1，-2.93 kcal·mol-1)。但在p,p′-DDE-H874Y復(fù)合物中，T877的主要作用方式是非極性相互作用，表明了該氨基酸與p,p′-DDE之間沒有穩(wěn)定的靜電作用。在p,p′-DDE-AR復(fù)合物中，T877A的突變直接破壞了原本T877對結(jié)合的貢獻，導(dǎo)致了配體與T877A結(jié)合的減弱。

2.4 氫鍵相互作用分析

實驗進一步計算了80 ns模擬過程中p,p′-DDE和DHT與H874Y及T877A之間的氫鍵。在氫鍵的判定中以原子間距離小于3 ?，角度大于130°作為統(tǒng)計占有率的臨界值。從表2和圖6可知，在DHT-H874Y復(fù)合物體系中，DHT的17-OH基團與N705、T877形成2個非常穩(wěn)定的氫鍵，占有率分別為94.68%和84.26%。在DHT-T877A復(fù)合物體系中，DHT的17-OH基團與N705形成了一個穩(wěn)定的氫鍵，占有率達到91.61%，而T877A的突變直接破壞了另一條氫鍵。計算結(jié)果與前面靜電能和單個氨基酸能量分析所得到的結(jié)論相一致。此外，DHT的O3原子分別與一分子結(jié)晶水、R752及Q711形成了不穩(wěn)定的氫鍵(數(shù)據(jù)未列出)。這種氫鍵相互作用的現(xiàn)象在晶體學(xué)實驗中也被報道過[5]。p,p′-DDE與H874Y及T877A之間并未形成較為穩(wěn)定的氫鍵，從而降低了總的結(jié)合能。Askew等[36]發(fā)現(xiàn)在H874Y突變體中，突變后的Y874與處在H4上的Y739之間形成了穩(wěn)定的氫鍵，能夠促進AR activation function 2(AF-2)區(qū)域與共激活因子的結(jié)合，提高AR的轉(zhuǎn)錄活性。本研究發(fā)現(xiàn)，H874Y的Y874與Y739之間形成了占有率為80%的氫鍵(如圖6所示)，而在T877A中卻并未發(fā)現(xiàn)此氫鍵，此計算結(jié)果進一步支持了細(xì)胞活性實驗的結(jié)果。之前的分析表明DHT在整個模擬過程的構(gòu)象非常穩(wěn)定而p,p′-DDE并不穩(wěn)定，這說明氫鍵的形成能直接穩(wěn)定配體與AR結(jié)合口袋之間的相互作用，對配體與受體的結(jié)合起到了重要的作用。

本實驗對DHT-H874Y、DHT-T877A、p,p′-DDE-H874Y和p,p′-DDE-T877A這4個復(fù)合物進行了長程MD模擬，同時使用MM-GBSA方法計算了復(fù)合物之間的結(jié)合自由能，探討了p,p′-DDE與AR的2種突變體H874Y及T877A激動性結(jié)合的分子機制。模擬結(jié)果與細(xì)胞實驗結(jié)果保持一致。計算表明，范德華相互作用是維持p,p′-DDE和DHT與AR突變體結(jié)合的主要驅(qū)動力。相比于p,p′-DDE，DHT與AR之間形成了非常穩(wěn)定的氫鍵，具有極為有利的靜電相互作用，這種差異是導(dǎo)致p,p′-DDE與DHT結(jié)合活性差異的重要原因。p,p′-DDE與H874Y的結(jié)合口袋更為融洽，具有更為有利的溶劑化能，T877A的突變則加劇了p,p′-DDE與結(jié)合口袋的不兼容性。MM-GBSA結(jié)果確定了p,p′-DDE與H874Y及T877A結(jié)合的重要氨基酸殘基，尤其是L704、M745、L873對結(jié)合自由能的貢獻非常顯著。以上結(jié)果基于分子層面給出了p,p′-DDE與H874Y及T877A之間的結(jié)合機制，對深入理解p,p′-DDE經(jīng)由AR介導(dǎo)的環(huán)境內(nèi)分泌干擾效應(yīng)并為進一步認(rèn)識該污染物在不同人群中健康風(fēng)險的差異提供了必要理論支持和有益借鑒。

表2 主要殘基的氫鍵生成情況Table 2 The hydrogen bonds of the key residues

圖2 晶體結(jié)構(gòu)中配體與重新對接后配體姿態(tài)與構(gòu)象的比較Fig. 2 The superposition of initial crystal structureand the re-docking conformation

圖4 (a) DHT-H874Y和DHT-T877A軌跡的聚類分析； (b) p,p′-DDE-H874Y和p,p′-DDE-T877A軌跡的聚類分析注：藍(lán)色表示最具有代表性構(gòu)象，綠色代表初始構(gòu)象。Fig. 4 Cluster analysis of (a) DHT-H874Y and DHT-T877A; (b) p,p′-DDE-H874Y and p,p′-DDE-T877ANote: Blue represent the most representative structure; green represent the initial structure.

圖6 重要氨基酸的分布及重要氫鍵的形成(氫鍵以藍(lán)色虛線表示)Fig. 6 Distributions of key amino acid residues and hydrogen bonds colored by blue line

圖7 配體(p,p′-DDE和DHT)與H874Y/T877A關(guān)鍵氨基酸結(jié)合的能量貢獻Fig. 7 The energy contributions to the binding between key residues of H874Y/T877A and ligand (p,p′-DDE and DHT)

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◆

TheoreticalInvestigationonAgonismMechanismofp,p′-DDEviaInteractingwithAndrogenReceptorMutantsH874YandT877A

Zhu Jinghan1,2, Xue Qiao1,2, Liu Xian1,2, Zhang Aiqian1,2,*

1. State Key Laboratory of Environmental Chemistry and Ecotoxicology, Research Center for Eco-environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing100085, China2. College of Resources and Environment, University of Chinese Academy of Sciences, Beijing100049, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170114002朱婧涵, 薛嶠, 劉嫻, 等. p,p′-DDE與雄激素受體突變體H874Y及T877A激動性作用機制的理論研究[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報，2017, 12(3): 214-224

2017-01-14錄用日期2017-03-08

1673-5897(2017)3-214-11

X171.5

A

張愛茜(1972—)，女，博士，研究員，主要研究方向為理論環(huán)境化學(xué)。

國家自然科學(xué)基金(21621064, 21507152)；中國科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)科技專項課題(XDB14030500)

朱婧涵(1992-)，女，碩士，研究方向為理論環(huán)境化學(xué)，E-mail: nanaqq7@hotmail.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: aqzhang@rcees.ac.cn

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