李愷，劉樹深,*，屈銳

1. 長江水環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 2000922. 同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092

組合指數(shù)在環(huán)境混合物聯(lián)合毒性研究中的初步應(yīng)用

李愷1,2，劉樹深1,2,*，屈銳1,2

1. 長江水環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 2000922. 同濟(jì)大學(xué)環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，上海 200092

化學(xué)品在實(shí)際環(huán)境中總是以組分繁雜多變的混合物形式存在，其混合物的毒性評估與預(yù)測一直是環(huán)境毒理學(xué)研究重點(diǎn)。在環(huán)境毒理學(xué)領(lǐng)域，濃度加和(concentration addition, CA)及獨(dú)立作用(independent action, IA)是評估與預(yù)測化學(xué)混合物聯(lián)合毒性的經(jīng)典模型，一般認(rèn)為CA適用于作用模式相似的混合物體系而IA適用于作用模式相異的混合物體系，但如何使用CA與IA一直存在爭議。組合指數(shù)(combination index, CI)是在半數(shù)效應(yīng)方程基礎(chǔ)上發(fā)展起來的不依賴于作用模式的用于混合物聯(lián)合毒性評估的混合物毒性指數(shù)，具有堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)，不僅能定性地評估毒理學(xué)相互作用，也能定量地評估相互作用的大小，已在藥物組合研究中得以廣泛應(yīng)用，近年來已引起環(huán)境毒理學(xué)研究者興趣。本文就組合指數(shù)及藥物組合應(yīng)用、進(jìn)入環(huán)境毒理學(xué)領(lǐng)域、與CA及IA的關(guān)系、存在的問題等幾個(gè)方面進(jìn)行評述，以期推進(jìn)CI在化學(xué)混合物毒性評估與預(yù)測領(lǐng)域中的應(yīng)用。

組合指數(shù)；藥物組合；聯(lián)合毒性；UD-Ray；置信區(qū)間

Received14 January 2017accepted2 March 2017

Abstract: Various chemicals always exist as complex mixtures in real environment. The assessment and prediction of toxicity for chemical mixtures has been the research focus in environmental toxicology. The concentration addition (CA) and independent action (IA) are the classic additive reference models for the toxicity assessment and prediction of chemical mixture. It is generally recognized that the IA model is suitable to estimate the toxicities of the mixtures of the components showing dissimilar modes of actions (MOA), and the CA to the mixtures consisting of the chemicals with similar MOA. But how to correctly use CA and IA has been controversial for a long time. Combination index (CI) has solid theory basis for the reason that it is based on the median-effect equation and independent of the toxic MOA, and CI could qualitatively determine the toxicological interactions and quantitatively evaluate the degree of interaction. The CI has been widely used in drug combination. In recent years, CI is increasingly attracting interests of environmental toxicology researchers. In this review, the fundamental concepts and its application to drug combination and environmental toxicology field, the differences between CI and CA (or IA), and the existing problems are summarized, aiming to propel the applications of CI in mixture toxicity assessment and prediction.

Keywords: combination index; drug combination; combined toxicity; UD-Ray; confidence intervals

由不同來源及不同種類化學(xué)品組成的化學(xué)混合物普遍存在于實(shí)際環(huán)境體系中，產(chǎn)生的累積與毒性相互作用具有潛在的生態(tài)環(huán)境與健康風(fēng)險(xiǎn)[1-2]。利用單個(gè)化學(xué)組分的濃度-效應(yīng)信息評估或預(yù)測不同濃度組成混合物的毒性效應(yīng)，是目前化學(xué)混合物毒性研究的流行方法[3]。

目前，廣泛應(yīng)用的評估混合物聯(lián)合毒性的加和模型主要是效應(yīng)相加(effect summation, ES)、濃度加和(concentration addition, CA)和獨(dú)立作用(independent action, IA)模型。由于ES模型無法解釋“虛擬組合”現(xiàn)象[4]以及將“無中生有”(something from nothing)現(xiàn)象解釋為潛在協(xié)同作用[2]，因而逐漸淘汰。

一般認(rèn)為，CA模型適用于具有相似作用模式的混合物體系，而IA模型則適用于具有相異作用模式的混合物體系[1,5-7]。然而，這2種方法也存在不足，其一，不能直觀定量地表征混合物毒性相互作用的強(qiáng)度；其二，由于很多物質(zhì)作用模式尚未可知以及如何選擇相異標(biāo)準(zhǔn)也是目前無法解決的難題，因而無法正確選擇CA或IA[8-9]。Chou等[10-14]通過多年的理論研究與實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，提出了基于半數(shù)效應(yīng)方程但不依賴于作用模式的組合指數(shù)(combination index, CI)來評估混合物毒性相互作用，并已廣泛地應(yīng)用于藥物組合研究[15-17]。近年來開始引起環(huán)境科學(xué)工作者的關(guān)注[18-22]。不同于CA和IA，CI既能定性地評估化學(xué)混合物毒性的相互作用，也能定量地表征其相互作用的大小。本文將對CI的提出及應(yīng)用進(jìn)行回顧性評述，并且思考CI方法的優(yōu)化策略，以期推進(jìn)其在環(huán)境毒理學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展。

1 組合指數(shù)與藥物組合應(yīng)用(Combination index and application of drug combination)

自1960年代以來，Chou基于質(zhì)量作用原理推導(dǎo)了近300個(gè)方程，發(fā)現(xiàn)藥物(drug)劑量-效應(yīng)關(guān)系符合類似規(guī)律[12,23-24]，這些方程可歸納統(tǒng)一為一個(gè)稱為半數(shù)效應(yīng)方程(median effect equation, MEE)的形式[25]：

(1)

其中D是藥物濃度；fa是濃度D時(shí)的效應(yīng)，fu= 1 - fa；Dm是半數(shù)效應(yīng)濃度；m是表征劑量-效應(yīng)關(guān)系形狀的系數(shù)，m = 1、>1或<1分別表示雙曲線、S型曲線或扁平S型曲線。

經(jīng)過簡單變換，MEE可以線性化為：

(2)

從線性化的MEE可知，如果藥物濃度D與效應(yīng)fa都足夠精確，那么已知任意2組D與fa數(shù)據(jù)即可通過求解二元一次方程組獲得m和Dm值，即確定劑量-效應(yīng)曲線方程，進(jìn)而求得已知效應(yīng)(fa)下的濃度(D)或已知濃度下的效應(yīng)。MEE已廣泛應(yīng)用于藥理學(xué)研究[26-32]。

1981年在半數(shù)效應(yīng)方程研究取得成功的基礎(chǔ)上，Chou提出了不依賴于組分作用模式(mode of action, MOA)的用于評估藥物聯(lián)合效應(yīng)的組合指數(shù)方法。設(shè)混合物由n個(gè)組分組成，那么在混合物效應(yīng)為x%時(shí)的該混合物的組合指數(shù)(CI)x定義如下：

(3)

CI已被藥理學(xué)工作者廣泛應(yīng)用于藥物組合研究中[33-38]。例如CI曾被用來研究植物吲哚和異硫氰酸鹽對HepG2-C8細(xì)胞的相互作用[1]，研究從植物中來的酚酸對肝毒性的影響作用[39]。Gonzálezpleiter等[40]以魚腥藻和綠藻為測試生物，測定了羥氨芐青霉素、紅霉素、左氧氟沙星、諾氟沙星和四環(huán)素單獨(dú)存在及混合物毒性，采用CI方法來分析混合物，大部分混合物都出現(xiàn)了協(xié)同，并對比了CI、CA和IA這3種方法來預(yù)測混合物的毒性，認(rèn)為CI能更準(zhǔn)確地預(yù)測加和效應(yīng)的偏離。Santillo等[41]應(yīng)用CI研究了單胺氧化酶抑制類藥物(MAO)混合物對PC12、MH1C1和HuH-7細(xì)胞的毒性，發(fā)現(xiàn)均為加和作用。del Rio等[42]用CI來評估組胺和酪胺2種生物胺對腸細(xì)胞的聯(lián)合毒性，實(shí)時(shí)分析研究顯示兩者有明顯的協(xié)同效應(yīng)。Smith等[43]總結(jié)了用CI對自然共生的真菌毒素聯(lián)合毒性所進(jìn)行的研究，認(rèn)為拮抗、加和或協(xié)同作用依賴于其種類、細(xì)胞模型、混合體系，并不一定是時(shí)間或劑量依賴。在藥物組合研究方面，Berenguer-Daize等[30]用CI評估對依維霉素、SN38及替莫唑胺3種抗腫瘤藥物的不同組合下的聯(lián)合作用。Chen等[44]用CI來優(yōu)化2種藥物對腫瘤細(xì)胞化療效果的最佳混合比例，得出Nav∶DOX質(zhì)量比為2∶1時(shí)最優(yōu)。

在CI得到學(xué)界認(rèn)可的同時(shí)，為了考察多個(gè)組分構(gòu)成的多元混合物中各個(gè)組分之間的各種相互作用情況，Chou[45]創(chuàng)造性地提出了劑量減少指數(shù)(dose reduction index, DRI)，來表征某組分在混合物引起混合物效應(yīng)的濃度比單獨(dú)存在時(shí)產(chǎn)生效應(yīng)的濃度減少的倍數(shù)。DRI是度量在有協(xié)同效應(yīng)的混合物體系中，在給定的效應(yīng)水平下，每一種藥物與其單獨(dú)使用時(shí)的劑量相比可以減少多少倍。在臨床條件下，DRI至關(guān)重要，劑量減少使得對宿主的毒性減少但治療效率保持穩(wěn)定(或不變)。與DRI一并創(chuàng)造性提出的，還有多邊形等效線圖的概念和構(gòu)建方法，其形象地描述多元混合物中兩兩組分之間的相互作用及程度[46]。多邊形的概念來自于實(shí)際應(yīng)用而非數(shù)學(xué)推導(dǎo)[45]。然而，要系統(tǒng)、簡潔地表達(dá)全部的組合及對應(yīng)體系在某一混合比下的相互作用是一件非常繁復(fù)的事情。例如，即使5個(gè)藥物兩兩組合就多達(dá)10種。多邊形等效線圖則可簡單形象地在視覺上表現(xiàn)出這一系列的總體結(jié)果。在藥物組合研究中，CI結(jié)合DRI與多邊形等效線圖的應(yīng)用，可以更直觀有效地表征不同藥物組合所得效果，以便比較并篩選出最佳藥物組合。

2 進(jìn)入環(huán)境毒理學(xué)領(lǐng)域(Into environmental toxicology field)

藥物及化學(xué)品的使用會使它們最終流向?qū)嶋H環(huán)境。而實(shí)際環(huán)境體系中混合暴露是一種普遍規(guī)律。因此，CI在藥物組合及藥理學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用研究也可為環(huán)境混合物聯(lián)合毒性方面的研究提供理論依據(jù)及技術(shù)支撐，一脈相承。這使得CI在環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用極具現(xiàn)實(shí)意義。

近年來，CI已經(jīng)引起環(huán)境科學(xué)工作者的關(guān)注，有學(xué)者用CI評估次氯酸鈉(NaOCl)、EDTA和氯己定(CHX)等3種根管沖洗液兩兩間二元混合物對MRC5細(xì)胞的聯(lián)合毒性，結(jié)果顯示單個(gè)物質(zhì)對細(xì)胞呈時(shí)間依賴毒性特征，且NaOCl/CHX與NaOCl/EDTA二元混合物為拮抗作用，EDTA/CHX二元混合物呈現(xiàn)由加和轉(zhuǎn)向拮抗的趨勢[47]。Yusoff等[48]用CI評估SG-SBR與HG-SBR中苯酚的抑制效應(yīng)，并以m值來判定擬合曲線的形狀，其結(jié)果為m<1，為平坦的S型，擬合數(shù)據(jù)顯示抑制效應(yīng)與苯酚濃度呈正相關(guān)，即微生物的抑制效應(yīng)隨苯酚濃度的增加而增加。Mater等[49]評估了醫(yī)藥廢水及地表水中的環(huán)丙沙星、三苯氧胺和環(huán)磷酰胺的生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)，指出觀測到的協(xié)同及拮抗作用必須考察低濃度及不同的時(shí)間暴露混合物的生態(tài)毒性效應(yīng)。Gonzálezpleiter等[40]研究了5種抗生素及其混合物對水生光合生物的毒性，用CI、CA和IA這3個(gè)模型評估了混合物的相互作用，認(rèn)為CI能更準(zhǔn)確地預(yù)測。Ma等[50]應(yīng)用CI對12種在中國飲食中常見的農(nóng)藥及其混合物對肝癌細(xì)胞的聯(lián)合毒性進(jìn)行了評估，二元混合物在低濃度呈拮抗、中等濃度呈加和、高濃度為協(xié)同，三元混合物有多種相互作用現(xiàn)象，四元、五元及更多元混合物主要呈拮抗作用，而對于2個(gè)單個(gè)物質(zhì)、1個(gè)二元混合物、3個(gè)多元混合物呈現(xiàn)顯著的時(shí)間或劑量依賴毒性，其認(rèn)為產(chǎn)生細(xì)胞毒性可能歸因于這些農(nóng)藥會潛在引起細(xì)胞促氧化作用或誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。

CI不僅僅在水環(huán)境等相關(guān)研究中有所應(yīng)用，還更多地聚焦于多種環(huán)境介質(zhì)混合污染物的毒性相互作用評價(jià)[18,20,40]。有學(xué)者[51]運(yùn)用CI法研究2個(gè)殺蟲劑，高效氯氟氰菊酯和吡蟲啉，與重金屬鎘對蚯蚓的相互作用，發(fā)現(xiàn)在人工濾土試驗(yàn)中，高效氯氟氰菊酯和鎘在低效應(yīng)時(shí)有輕微協(xié)同，在濃度高于某值時(shí)轉(zhuǎn)為輕微拮抗，含有吡蟲啉的二元混合物則呈現(xiàn)拮抗。含有吡蟲啉的三元混合物也對蚯蚓有拮抗。Feng等[52]用CI評估了農(nóng)藥-離子液體-取代酚六元混合物體系對秀麗線蟲的時(shí)間毒性，發(fā)現(xiàn)該混合物體系產(chǎn)生了時(shí)間協(xié)同作用。Tang等[22]用CI評估重金屬-農(nóng)藥-離子液體三元混合物體系的聯(lián)合毒性，發(fā)現(xiàn)混合物中草甘膦的濃度分?jǐn)?shù)增加時(shí)，其毒性呈現(xiàn)向加和甚至拮抗變化的趨勢。Liu等[21]用CI評估了不含J型組分混合物的毒性相互作用，表明除少數(shù)混合物射線在高效應(yīng)水平疑似存在協(xié)同或拮抗外，其余所有混合物均為加和作用。Wang等[51]運(yùn)用CI評價(jià)了除草劑、殺蟲劑和重金屬三元混合物體系的聯(lián)合毒性并顯示出協(xié)同作用。Chen等[53]運(yùn)用CI評價(jià)了四元、五元、六元、七元及八元混合物體系的聯(lián)合毒性，并將CI與CA和IA進(jìn)行對比。

區(qū)別于藥物組合與藥理學(xué)領(lǐng)域，環(huán)境混合物聯(lián)合毒性的研究對進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評價(jià)、改進(jìn)環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)和環(huán)境容量都有很強(qiáng)的推動作用和現(xiàn)實(shí)意義。環(huán)境混合物的復(fù)雜性使得研究人員不能只局限于在固定濃度比(或等效應(yīng)濃度比)下研究二元混合物，這也是CI在藥物組合與環(huán)境混合物方面應(yīng)用的差異。對于二元混合物的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，Chou等[54]提出的對角等比率組合設(shè)計(jì)能大大地減少實(shí)驗(yàn)需要的動物數(shù)量(即大大減少所需數(shù)據(jù)點(diǎn)的數(shù)量)，與直接均分射線設(shè)計(jì)法[55]一樣，優(yōu)化了固定濃度比射線法(fixed concentration ratio ray, FCRR)。對于多組分混合物，例如三元混合物，Chou[9]推薦對其進(jìn)行兩兩組合，簡化計(jì)算。然而組分越多，即便簡化也會大大增加工作量，還是需要優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

在環(huán)境混合物聯(lián)合毒性研究中，前文提及的DRI與多邊形等效線圖的應(yīng)用鮮有問津，但對于研究多組分的環(huán)境混合物聯(lián)合毒性及對環(huán)境生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)進(jìn)行評價(jià)而言，這2種方法可更加形象地表達(dá)關(guān)鍵組分對混合物聯(lián)合毒性的貢獻(xiàn)及混合物體系相互作用關(guān)系，值得拓展與深入研究。

3 與CA及IA的關(guān)系(The difference from CA or IA)

半數(shù)效應(yīng)方程與組合指數(shù)最獨(dú)特也是最重要的特點(diǎn)就是方程的每一項(xiàng)都是比值(方程1、方程3)。因此，對于化學(xué)品(或藥物)實(shí)體，單位是可以抵消的，從而成為一個(gè)無量綱[9]。此特點(diǎn)是它們可以廣泛應(yīng)用的核心內(nèi)容，即不依賴于組分作用模式。而前已述及環(huán)境中的污染物往往以混合物的形式出現(xiàn)，混合物體系復(fù)雜多變，其組分的作用模式難以一一考究，在選擇模型過程中很難統(tǒng)一或者嚴(yán)格區(qū)分不同的作用模式，因此對CA與IA模型的使用前提一直是眾多科研工作者爭論的焦點(diǎn)之一[7-8,56-58]。而CI避免了這種爭論，就更具理論意義、更加適用于復(fù)雜混合污染物的毒性分析。

(4)

顯然，當(dāng)CI = 1時(shí)就是濃度加和模型CA的表達(dá)式：

(5)

單從數(shù)學(xué)層面而言，方程5左側(cè)值可以看作方程4左側(cè)CI值的歸一化處理。需要強(qiáng)調(diào)的是，CI、CA或IA所表達(dá)的劑量效應(yīng)關(guān)系本質(zhì)上并不揭示機(jī)理。當(dāng)表達(dá)協(xié)同(或拮抗)效應(yīng)時(shí)，常常會涉及協(xié)同的機(jī)理是什么？這是一個(gè)很難回答的問題。事實(shí)上，我們對藥物及化學(xué)品機(jī)理知之甚少。這里的一個(gè)論點(diǎn)是，所指的機(jī)理是什么，是藥理學(xué)上的、生物化學(xué)的、細(xì)胞水平的、分子水平的、化學(xué)的、或量子力學(xué)水平上？細(xì)究機(jī)理時(shí)，我們還面對一個(gè)問題：當(dāng)受試生物達(dá)到作用靶點(diǎn)時(shí)，我們實(shí)際上不知道其在達(dá)到作用靶點(diǎn)前有多少事件發(fā)生。這可能是幾個(gè)階段或數(shù)百個(gè)階段。此外，當(dāng)我們談及2個(gè)或多個(gè)藥物或化學(xué)品的協(xié)同或拮抗效應(yīng)時(shí)被認(rèn)為是相互的。雖然我們知道單個(gè)組分在混合物中的劑量或效應(yīng)貢獻(xiàn)，但我們并不能定量地知道每一個(gè)藥物或化學(xué)品對所導(dǎo)致觀察到的協(xié)同或拮抗效應(yīng)中機(jī)理貢獻(xiàn)的比例[9]。因此，有關(guān)CA模型適用于具有相似作用模式的混合物體系，而IA模型則適用于具有相異作用模式的混合物體系的理論基礎(chǔ)并不穩(wěn)固，還需驗(yàn)證[57,63]。在選擇評估模型對環(huán)境混合物體系進(jìn)行相互作用評估時(shí)，應(yīng)當(dāng)將CI、CA或IA作為一個(gè)工作模型來使用，將受試生物體看作黑箱，不必關(guān)注藥物或化學(xué)品對受試生物的作用方式和作用位點(diǎn)。

那么，從數(shù)學(xué)角度并剔除CI、CA模型建立的理論基礎(chǔ)討論，半數(shù)效應(yīng)方程的作用等同于用于毒性數(shù)據(jù)非線性擬合的Hill函數(shù)或Logit函數(shù)或Weibull函數(shù)(或其他函數(shù))，區(qū)別在于半數(shù)效應(yīng)方程、Logit函數(shù)及Weibull函數(shù)為兩參數(shù)模型，Hill函數(shù)為四參數(shù)模型。因此，CI與CA本質(zhì)上并無太多差異，或者說CI就是CA，但CI不僅可直觀地定性表達(dá)相互作用，而且可定量地表示毒性相互作用的大小。

回到模型的理論基礎(chǔ)，值得一提的是組合指數(shù)基于質(zhì)量作用定律，半數(shù)效應(yīng)方程的重排或采用它的對數(shù)形式可推導(dǎo)出生物醫(yī)學(xué)科學(xué)中的4個(gè)主要方程，即對于一階酶動力學(xué)(m=1)的Michaelis-Menten方程、用于主要配體占據(jù)生物受體的高階Hill方程、用于配體-受體結(jié)合及解離的Scatchard方程，以及用于pH離子化的Henderson-Hasselbalch方程[9]。這樣，共用相同數(shù)學(xué)形式的方程可具有不同的物理化學(xué)意義，同時(shí)半數(shù)效應(yīng)方程的兩邊是比值，這樣等式中左右兩側(cè)的值是沒有單位的，這比CA及IA模型的理論基礎(chǔ)更為扎實(shí)，可完全避免作用模式異同的爭論。

4 組合指數(shù)與混合物設(shè)計(jì)的優(yōu)化策略(Optimization)

環(huán)境混合物聯(lián)合毒性研究是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)的課題，在人力、物力、財(cái)力條件有限的情況下，如何更有效地對環(huán)境混合物聯(lián)合毒性進(jìn)行評估，同時(shí)兼顧實(shí)際環(huán)境體系的復(fù)雜性，值得研究者深思。而從混合物毒性相互作用的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)開始，不失為一個(gè)好的開端。

在此，我們有必要重申混合物體系與混合物射線的概念：具有明確化合物組分的一系列混合物稱之為混合物體系，如二元混合物、三元混合物；混合物體系中的一系列具有固定濃度分?jǐn)?shù)的混合物稱之為混合物射線。每一個(gè)混合物體系中均包含了無數(shù)個(gè)不同固定比的混合物射線。只有從固定的混合物射線形成的劑量-效應(yīng)曲線所得毒性大小才能與單個(gè)物質(zhì)的毒性作比較，而非一個(gè)混合物體系。

實(shí)際環(huán)境混合物體系的復(fù)雜多變使得要全面研究所有混合物是不可能的，所以混合物的濃度組成或濃度配比必須進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。藥物組合研究多為組分較少，毒性研究比較普遍，其設(shè)計(jì)方法相對完善的二元混合物。對于多元混合物的設(shè)計(jì)，環(huán)境科學(xué)領(lǐng)域的學(xué)者多只用固定濃度比射線法與等效應(yīng)濃度比射線法(equivalent effect concentration ratio ray, EECR)，但兩者都只是設(shè)計(jì)了一條混合物射線，而非系統(tǒng)完整的混合物體系，且EECR法是固定濃度比為某特定效應(yīng)濃度(如EC50)的FCRR法，是FCRR法的一種特例。這2種方法設(shè)計(jì)的混合物組分濃度比的分布范圍較窄，不能反映混合物組分在整個(gè)多維濃度空間內(nèi)不同濃度分?jǐn)?shù)的混合，也不能代表環(huán)境實(shí)體的濃度分布，即使再多的等效應(yīng)濃度比混合物，也不可能完全探測到混合物的整體濃度空間。另外，雖有學(xué)者認(rèn)為等毒性濃度比射線可以最大化估計(jì)毒性效應(yīng)[64]，但此論斷并不準(zhǔn)確，因?yàn)椴⑽纯疾烊康幕旌衔餄舛瓤臻g。混合物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與混合物聯(lián)合毒性評價(jià)密不可分，模型評價(jià)得到的混合物相互作用往往具有組成依賴性。例如在研究二元重金屬對Tympanotonus fuscatus毒性時(shí)發(fā)現(xiàn)，鋅銅比為1∶4時(shí)，呈強(qiáng)拮抗，而鋅銅等毒性比時(shí)則為加和[65]。Cedergreen等[66]指出氯丙酸與特丁津的二元混合物對浮游植物L(fēng)emna minor的聯(lián)合毒性與組成成分濃度有關(guān)，混合物中氯丙酸所占比例越高則拮抗作用越大。

為了有效合理地探索整個(gè)混合物濃度空間的毒性變化規(guī)律，劉樹深教授課題組創(chuàng)造性地將我國數(shù)學(xué)家王元和方開泰[67]提出的一種新的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)——均勻設(shè)計(jì)思想引入混合物聯(lián)合毒性研究之中，提出了均勻設(shè)計(jì)射線法(uniform design ray, UD-Ray)[68]。以3組分各5個(gè)濃度的實(shí)驗(yàn)體系為例，比較析因設(shè)計(jì)(factorial design, FD)、正交設(shè)計(jì)(orthogonal design, OD)和均勻設(shè)計(jì)(uniform design, UD)3種優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法所選擇的三維濃度空間中有代表性的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，結(jié)果如圖1所示。對于析因設(shè)計(jì)，當(dāng)考察3個(gè)因素各5個(gè)水平時(shí)所需要的實(shí)驗(yàn)數(shù)為35= 125次(不考慮重復(fù))，而正交實(shí)驗(yàn)雖然只需要25次實(shí)驗(yàn)，僅為析因設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)數(shù)的1/5，但實(shí)驗(yàn)數(shù)仍是比較多的。顯然，均勻設(shè)計(jì)所需代表性實(shí)驗(yàn)最少，僅需5次實(shí)驗(yàn)。

基于此，等效應(yīng)濃度比或固定濃度比并不能很好地表達(dá)一個(gè)混合物體系的毒性，更難以模擬實(shí)際環(huán)境中化學(xué)混合物的多種濃度變化。對混合物毒性的評估與預(yù)測應(yīng)當(dāng)更多地應(yīng)用UD-Ray進(jìn)行混合物聯(lián)合毒性研究的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。該方法可使實(shí)驗(yàn)點(diǎn)在濃度范圍內(nèi)均勻散布的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，具有能充分代表混合物中的各種濃度變化的樣本校正集，能

有效地選擇有代表性的實(shí)驗(yàn)點(diǎn)，能更好地實(shí)現(xiàn)不同組成混合物聯(lián)合毒性的真正預(yù)測。正因其獨(dú)到的優(yōu)勢，已被多次應(yīng)用在混合物毒性實(shí)驗(yàn)中[3, 21-22,50,69]。

除卻混合物設(shè)計(jì)優(yōu)化方面的考量，另個(gè)一直注意的問題是目前所有關(guān)于CI應(yīng)用的文獻(xiàn)都把它作為一個(gè)準(zhǔn)確的參考標(biāo)準(zhǔn)來實(shí)施混合物毒性相互作用評價(jià)。事實(shí)上，所有毒性實(shí)驗(yàn)都存在實(shí)驗(yàn)誤差，不同毒物或污染物具有不同的劑量-效應(yīng)特征(如短長期毒性差異與含無效應(yīng)組分等)，劑量-效應(yīng)曲線擬合也存在擬合誤差，這些都會影響CI指數(shù)的不確定度。因此，必須考慮CI指數(shù)的置信區(qū)間。Liu等[21]綜合考慮實(shí)驗(yàn)誤差、不同劑量-效應(yīng)特征與擬合誤差對CI的影響，構(gòu)建了基于觀測置信區(qū)間的CI指數(shù)(combination index based on the confidence intervals, CI-Int)，并將其應(yīng)用在二元及多元混合物相互作用研究中，使其能夠更加準(zhǔn)確地評估混合物毒性。

組合指數(shù)結(jié)合UD-Ray及置信區(qū)間，對于在環(huán)境混合物聯(lián)合毒性研究方面的應(yīng)用必將是協(xié)同效應(yīng)，正所謂寶鞍配良駒，寶玉配佳人。

5 融會貫通助推毒理學(xué)發(fā)展(Development by correct understanding)

對組合指數(shù)開創(chuàng)性的拓展，使得其在環(huán)境混合物聯(lián)合毒性研究領(lǐng)域的應(yīng)用更趨完善，類似的拓展同樣可以推廣至藥物組合及藥理學(xué)的研究中。公式的推導(dǎo)與拓展在使用層面上，更容易被學(xué)者接受和理解，但這并不意味著能用好對應(yīng)的評估模型。

Liu等[70]在評論“The synergistic toxicity of the multi-chemical mixtures: Implications for risk assessment in the terrestrial environment”[53]一文時(shí)談及就CI而言，并不能預(yù)測混合物聯(lián)合毒性，只能評估混合物相互作用。在此，有必要對CA與CI模型所涉及的ECx,mix的數(shù)學(xué)推導(dǎo)再次討論說明。

對于方程推導(dǎo)，回顧方程5，指定效應(yīng)時(shí)，應(yīng)用CA模型預(yù)測混合物濃度的公式為：

(6)

其中ECx,mix是CA預(yù)測的混合物產(chǎn)生x%效應(yīng)時(shí)的濃度。Chen等[53]論文中依據(jù)CA的推導(dǎo)，在CI方程的基礎(chǔ)上推導(dǎo)了一個(gè)預(yù)測方程：

(7)

其中CIxcomp是混合物產(chǎn)生x%效應(yīng)時(shí)由計(jì)算得到的CI值。對于CA模型，方程6根據(jù)單個(gè)組分的劑量-效應(yīng)曲線以及其在混合物中的比例計(jì)算。而對于方程7，首先需要計(jì)算得到CI值。簡單的講，方程6僅有一個(gè)變量，而方程7則為一個(gè)變量一個(gè)因變量。根據(jù)方程3，在給定效應(yīng)下計(jì)算CI值必須知道混合物的總濃度，即得到ECx,mix必須先獲得混合物的劑量-效應(yīng)曲線，從而擬合得到對應(yīng)的濃度，這違背了“預(yù)測”一詞的本意，顯得本末倒置。值得注意的是，方程6與方程7有本質(zhì)的區(qū)別，方程6在計(jì)算ECx,mix值僅需依據(jù)效應(yīng)濃度ECx,j以及其在混合物射線中混合比pj，無關(guān)于混合物射線的劑量-效應(yīng)曲線。

同樣的理解偏差，也存在其他一些學(xué)者的研究成果中。Gonzálezpleiter等[40]用CI、CA、IA這3個(gè)模型評估了5種抗生素混合物對水生光合生物聯(lián)合毒性，認(rèn)為CI能更準(zhǔn)確地預(yù)測。Chen等[71]在人工土、濾紙上研究了2種除草劑(去草胺與阿特拉津)和一種殺蟲劑(高效氯氟氰菊酯)，對陸地非目標(biāo)生物蚯蚓的單個(gè)及聯(lián)合毒性，并比較CI與傳統(tǒng)模型CA與IA，認(rèn)為CI可以在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評估中準(zhǔn)確地預(yù)測混合物毒性。Trombini等[72]分別用CA、IA及CI預(yù)測了撲熱息痛、卡馬西平、雙氯芬酸及布洛芬4種新型環(huán)境污染物的混合物對無節(jié)幼蟲的毒性，認(rèn)為CA和IA不能很好地預(yù)測藥物混合物毒性，而CI可以。Chen等、Trombini等及Gonzálezpleiter等并未正確理解CI模型及“預(yù)測”這一概念。在此，我們強(qiáng)調(diào)對評估模型的透徹理解及正確使用，是進(jìn)行環(huán)境混合物聯(lián)合毒性研究的重要前提之一。

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◆

ApplicationoftheCombinationIndexintheAssessmentofCombinedToxicityofEnvironmentalMixture

Li Kai1,2, Liu Shushen1,2,*, Qu Rui1,2

1. Key Laboratory of Yangtze River Water Environment, Ministry of Education, Shanghai 200092, China2. College of Environmental Science and Engineering, Tongji University, Shanghai 200092, China

10.7524/AJE.1673-5897.20170114001

2017-01-14錄用日期2017-03-02

1673-5897(2017)3-062-10

X171.5

A

劉樹深(1961—)，男，博士，教授，博士生導(dǎo)師。全國優(yōu)秀博士學(xué)位論文獲得者。主要研究方向?yàn)榛瘜W(xué)混合物分析毒理與分子模擬，近年在國內(nèi)外學(xué)術(shù)期刊發(fā)表論文100余篇，其中SCI收錄80多篇。

國家自然科學(xué)基金(21377097，21177097)

李愷(1986-)，男，博士研究生，研究方向?yàn)榛瘜W(xué)混合物毒理學(xué)，E-mail: lee2061@163.com；

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: ssliuhl@263.net

李愷, 劉樹深, 屈銳. 組合指數(shù)在環(huán)境混合物聯(lián)合毒性研究中的初步應(yīng)用[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2017, 12(3): 62-71

Li K, Liu S S, Qu R. Application of the combination index in the assessment of combined toxicity of environmental mixture [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2017, 12(3): 62-71 (in Chinese)