李永慧，楊 梅

(1.青海省西寧市第一人民醫(yī)院 810002；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001)

高原低氧致應(yīng)激性潰瘍大鼠模型的建立*

李永慧1，楊 梅2△

(1.青海省西寧市第一人民醫(yī)院 810002；2.青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院，西寧 810001)

目的建立大鼠高原低氧致應(yīng)激性潰瘍實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。方法將大鼠分為6 組：常氧組、高原低氧2 d組、高原低氧4 d組、高原低氧6 d組、高原低氧8 d組和高原低氧10 d組。除常氧組外，其余各組大鼠分別在低壓氧艙內(nèi)(模擬海拔5 000 m)飼養(yǎng)2、4、6、8 d 和10 d。觀察各組大鼠胃黏膜潰瘍指數(shù)、胃液量、胃蛋白酶活性和胃液pH值的變化。結(jié)果大鼠在低壓氧艙內(nèi)模擬海拔 5 000 m 高原低氧2、4、6、8、10 d后，均可見胃黏膜多個(gè)不同程度的點(diǎn)狀和線狀出血、糜爛及潰瘍形成；潰瘍指數(shù)明顯增加；胃液量和pH值均明顯下降，胃蛋白酶活性明顯升高。各指標(biāo)變化均在高原低氧第6天時(shí)最明顯。結(jié)論大鼠在模擬海拔5 000 m的低壓氧艙內(nèi)飼養(yǎng)2～10 d，均可建立高原低氧致應(yīng)激性潰瘍動(dòng)物模型，且最佳時(shí)間是6 d。

應(yīng)激性潰瘍；高原低氧；模型

應(yīng)激性潰瘍是機(jī)體在各種應(yīng)激因素(創(chuàng)傷、手術(shù)、低氧、寒冷、心理因素等)的刺激下發(fā)生的胃腸道黏膜急性糜爛、潰瘍、出血等，病情危重，病死率高[1]。高原是人類最具挑戰(zhàn)性的環(huán)境之一，高原環(huán)境具有氧分壓低、紫外線強(qiáng)、氣候寒冷、輻射高、氣候多變等特點(diǎn)。高原低氧環(huán)境可引起機(jī)體復(fù)雜的病理生理改變,包括消化系統(tǒng)的改變，可發(fā)生急性胃腸黏膜缺血、缺氧、黏膜屏障破壞，導(dǎo)致胃十二指腸黏膜糜爛和潰瘍，嚴(yán)重者引起上消化道大出血和穿孔[2-4]。高原應(yīng)激性潰瘍也是急性高原病的常見表現(xiàn)。目前隨著相關(guān)高原活動(dòng)的增多，每年到達(dá)高原的人數(shù)將超過200萬，因此，高原低氧致胃腸應(yīng)激性潰瘍引起了高原醫(yī)學(xué)工作者的高度重視。為進(jìn)一步研究高原低氧致胃腸應(yīng)激性潰瘍的發(fā)病機(jī)制及藥物、心理等防治，本實(shí)驗(yàn)通過在低壓氧艙內(nèi)模擬5 000 m高原環(huán)境，觀察高原低氧應(yīng)激不同時(shí)間(低氧2、4、6、8、10 d)大鼠胃潰瘍指數(shù)、胃酸及胃蛋白酶的改變，確定高原低氧致應(yīng)激性潰瘍最佳的模型條件。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康SD大鼠100只,雌雄各半，體質(zhì)量(220±20)g，購于甘肅中醫(yī)學(xué)院，合格證號(hào)：SYXK (甘) 2011-0001。

1.2儀器 DHY-3000型低壓氧艙(貴州風(fēng)雷軍械機(jī)械有限公司)；pH S-2C 型精密酸度計(jì)(上海雷磁儀器廠)；xMark酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組 健康SD大鼠由蘭州(海拔1 800 m)轉(zhuǎn)運(yùn)到西寧(海拔2 260 m)后，分為6 組，每組8只：常氧組、低氧2 d組、低氧4 d組、低氧6 d組、低氧8 d組和低氧10 d組。除常氧組外，其余各組大鼠分別在青海大學(xué)醫(yī)學(xué)院高原醫(yī)學(xué)研究中心提供的低壓氧艙內(nèi)(模擬海拔5 000 m，氧分壓42 mm Hg，溫度16.9～24 ℃,濕度37%～50%)飼養(yǎng)2、4、6、8 d和10 d，每天早上開艙1 h、晚上開艙半小時(shí)進(jìn)行加食、給水及清理衛(wèi)生。常氧組大鼠飼養(yǎng)在艙外動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室(海拔2 260 m，晝夜采光，通風(fēng)良好，室溫22 ℃左右)，自由呼吸空氣、攝食和飲水，其他飼養(yǎng)條件相同。

1.3.2胃液量、胃液pH值和胃蛋白酶活性測(cè)定 各組大鼠在低壓氧艙(模擬海拔5 000 m)和常氧條件下(海拔2 260 m)飼養(yǎng)相應(yīng)時(shí)間后，腹腔注射20%烏拉坦(0.4 mL/100 g體質(zhì)量)

圖1高原低氧不同時(shí)間對(duì)大鼠胃黏膜的影響

進(jìn)行麻醉，背位固定，沿腹部中線縱行打開腹腔，分別結(jié)扎賁門和幽門下方一段十二指腸后剪斷胃與食管及十二指腸連接處，取出全胃。用注射器抽取胃內(nèi)所有胃液，置于刻度離心管中，測(cè)量其體積，即胃液量。取出的胃液以3 000 r/min 離心10 min，取上清液用pH S-2C 型精密酸度計(jì)檢測(cè)胃液pH值。取部分上清胃液，按照胃蛋白酶測(cè)定試劑盒說明書進(jìn)行操作，取反應(yīng)終止后的樣本在660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度(A)，按說明書上公式計(jì)算胃液中胃蛋白酶的活性。

1.3.3胃黏膜潰瘍指數(shù)(UI)的測(cè)定 將上述方法取出的大鼠全胃，抽取完胃液后，從十二指腸處向胃內(nèi)注射10%甲醛約5 mL(根據(jù)胃的大小控制劑量，所用甲醛能充盈胃即可，向胃內(nèi)注射甲醛時(shí)要緩慢推注，避免用力過猛使甲醛迸出或?qū)⑽笓纹?，再將胃放入10%甲醛溶液中浸泡15 min后沿胃大彎剪開，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗胃腔內(nèi)殘留物及黏膜表面上的血跡，將胃平放于玻璃板上，在10倍放大鏡下觀察腺胃區(qū)點(diǎn)線狀糜爛、出血情況。用數(shù)碼相機(jī)在固定光源和固定位置拍照，采用PhotoShop CS6軟件測(cè)量潰瘍長(zhǎng)度和寬度，并計(jì)算UI。UI計(jì)算方法根據(jù)Guth標(biāo)準(zhǔn)稍加改良：潰瘍小于1 mm為1分，1～2 mm為2分，2～3 mm為3分，3～4 mm為4分，大于4 mm將其分段計(jì)分，病灶寬度大于1 mm時(shí)則加倍計(jì)分，每只動(dòng)物的累計(jì)總分即為該動(dòng)物的UI。

2 結(jié) 果

2.1高原低氧不同時(shí)間對(duì)大鼠胃黏膜的影響 常氧組大鼠胃黏膜表面光滑，呈粉紅色，黏膜皺襞整齊清晰；高原低氧2、4、6、8、10 d組大鼠胃黏膜表面附有血痂，冷生理鹽水沖洗后，可見多個(gè)不同程度的點(diǎn)狀和線狀出血、糜爛及潰瘍形成。尤以高原低氧6 d組最為明顯，見圖1。

2.2高原低氧不同時(shí)間對(duì)大鼠胃黏膜組織UI的影響 高原低氧2、4、6、8、10 d組大鼠的UI均明顯高于常氧組，但在高原低氧6 d時(shí)大鼠的UI最高。說明高原低氧2、4、6、8、10 d均可致應(yīng)激性潰瘍，并且高原低氧6 d是建立高原低氧致應(yīng)激性潰瘍的最佳時(shí)間，見表1。

表1 高原低氧不同時(shí)間對(duì)大鼠UI的影響

*：P<0.05，**：P<0.01，與常氧組比較

表2 高原低氧不同時(shí)間對(duì)大鼠胃液量、pH值和胃蛋白酶活性的影響

*：P<0.05，**：P<0.01，與常氧組比較

2.3高原低氧不同時(shí)間對(duì)大鼠胃液量、pH和胃蛋白酶活性的影響 與常氧組比較，高原低氧2、4、6、8、10 d組大鼠的胃液量和pH值均明顯下降，胃蛋白酶活性明顯升高。pH值和胃蛋白酶活性在高原低氧6 d時(shí)變化最明顯，而胃液量在高原低氧8 d時(shí)變化最明顯。說明高原低氧可抑制胃液的分泌，但能提高胃液酸度和胃蛋白酶的活性，見表2。

3 討 論

應(yīng)激是機(jī)體在各種內(nèi)外環(huán)境因素及社會(huì)、心理因素刺激時(shí)所出現(xiàn)的全身性非特異性適應(yīng)反應(yīng)，嚴(yán)重的應(yīng)激可導(dǎo)致胃腸道黏膜的損傷，產(chǎn)生胃腸道黏膜的糜爛、潰瘍甚至穿孔，即應(yīng)激性潰瘍[5]。應(yīng)激刺激因素較多，如大手術(shù)、嚴(yán)重創(chuàng)傷、重度全身性感染、寒冷、高原缺氧、腦出血、燒傷以及處于高度緊張狀態(tài)的高強(qiáng)度軍事訓(xùn)練導(dǎo)致的心理和過勞應(yīng)激等，均可能誘發(fā)應(yīng)激性潰瘍、出血甚至穿孔，一旦這種并發(fā)癥發(fā)生，導(dǎo)致原發(fā)病加重，病死率可高達(dá)到50%[6-8]。

應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生機(jī)制及藥物等的防治是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究的重要課題，而應(yīng)激性潰瘍動(dòng)物模型是研究應(yīng)激性潰瘍損傷機(jī)制及防治的必要基礎(chǔ)。根據(jù)誘發(fā)應(yīng)激性潰瘍的應(yīng)激刺激因素不同，目前建立應(yīng)激性潰瘍的動(dòng)物模型主要有以下幾種方法:(1)單純束縛應(yīng)激：將動(dòng)物四肢縛住,背位固定于木板或鐵絲網(wǎng)上,放置6 h以上。(3)冷束縛應(yīng)激：將動(dòng)物束縛后再置于4 ℃的冰箱中3 h以上。(4)水浸-束縛應(yīng)激：將動(dòng)物束縛后再置于20～23 ℃的水浴中3 h以上。(5)燒傷應(yīng)激：動(dòng)物麻醉后脫毛，置于96 ℃的熱水中18 s，導(dǎo)致30%體表面積Ⅲ度燙傷。(6)力竭性運(yùn)動(dòng)應(yīng)激:將尾部負(fù)有2%體質(zhì)量重物的大鼠放入裝有33～36 ℃水的塑料桶內(nèi)，當(dāng)大鼠經(jīng)過10 s 后仍不能返回水面或運(yùn)動(dòng)極度不協(xié)調(diào)時(shí)即從水中撈出[9]。也有研究者選擇心理性應(yīng)激、噪聲應(yīng)激、腦出血應(yīng)激等方法制作應(yīng)激性潰瘍模型。

高原環(huán)境是一個(gè)特殊的生態(tài)環(huán)境系統(tǒng),急進(jìn)高原由于環(huán)境的強(qiáng)烈變化，機(jī)體缺氧及人們對(duì)高原的恐懼造成機(jī)體應(yīng)激反應(yīng)，也可導(dǎo)致應(yīng)激性潰瘍[10-12]。研究高原低氧致胃腸應(yīng)激性潰瘍的發(fā)病機(jī)制和防治，不能簡(jiǎn)單采用上述的建模方式,而應(yīng)建立高原低氧性應(yīng)激性潰瘍模型。本研究結(jié)果顯示：大鼠在低壓氧艙內(nèi)模擬海拔5 000 m高原低氧2、4、6、8、10 d后，胃黏膜均可見多個(gè)不同程度的點(diǎn)狀和線狀出血、糜爛及潰瘍形成；UI明顯升高；胃液量和pH值均明顯下降，胃蛋白酶活性明顯升高。各指標(biāo)變化均在高原低氧第6天時(shí)最明顯。說明大鼠在模擬海拔5 000 m的低壓氧艙內(nèi)飼養(yǎng)6 d，是建立高原低氧性應(yīng)激性潰瘍動(dòng)物模型的最佳時(shí)間。

有關(guān)高原低氧性應(yīng)激性潰瘍的發(fā)生機(jī)制目前尚不十分清楚,有研究者認(rèn)為，急進(jìn)高原由于受到低壓、低氧的影響可引起腸黏膜絨毛卷曲、倒伏、凝結(jié),腸黏膜微血管損傷,胃腸黏膜分泌型IgG的分泌減少,導(dǎo)致腸黏膜上皮細(xì)胞凋亡和自噬,使黏膜屏障功能被嚴(yán)重破壞[13-14]。同時(shí),急進(jìn)高原由于環(huán)境的強(qiáng)烈變化，機(jī)體缺氧使機(jī)體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)[15]。應(yīng)激時(shí)：一方面交感神經(jīng)興奮，兒茶酚胺類物質(zhì)分泌增多，引起內(nèi)臟血管收縮，黏膜下層動(dòng)靜脈短路開放，造成黏膜缺血缺氧。另一方面，下丘腦-腺垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)興奮，使腎上腺皮質(zhì)激素分泌增多，皮質(zhì)激素能促進(jìn)胃酸的分泌,抑制胃黏液的分泌,同時(shí)加強(qiáng)甲狀腺素的作用，甲狀腺素能提高胃黏膜細(xì)胞的代謝率,使應(yīng)激狀態(tài)下胃黏膜缺血缺氧造成的能量代謝障礙進(jìn)一步加劇。另外，高原地區(qū)迷走神經(jīng)興奮性增強(qiáng)，胃酸分泌增多。使過量H+反流入細(xì)胞內(nèi),胃黏膜內(nèi)酸堿平衡失調(diào)，導(dǎo)致大量代謝產(chǎn)物產(chǎn)生以及炎性介質(zhì)失控，使胃黏膜微循環(huán)完全停滯，促進(jìn)了潰瘍的形成[15]。

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Establishmentofratmodelofplateauhypoxiacausedstressulcer

LiYonghui1，YangMei2△

(1.XiningMunicipalFirstPeople′sHospital,Xining,Qinghai810002,China;2.MedicalCollege,QinghaiUniversity,Xining,Qinghai810001,China)

ObjectiveTo establish the rat experimental animal model of plateau hypoxia caused stress ulcer.MethodsRats were randomly divided into the normoxia group,plateau hypoxia 2,4,6,8,10 d groups.Except the normoxia group,the rats in other groups were fed in a hypobaric chamber( simulated altitude 5000 m) for 2,4,6,8,10 d srespectively.Then the gastric mucosal ulcer index,gastric juice volume,pepsin activity and PH value of gastric juice were observed in each group.ResultsDifferent degrees of point-like and line-like bleeding,erosion and ulcer formation could be seen in rat gastric mucosa in the hypobaric chamber( simulated altitude 5 000 m) on 2,4,6,8,10 d of plateau hypoxia;the ulcer index was significantly increased;the PH value and gastric juice volume were significantly decreased and the pepsin activity was significantly elevated. The changes of various indexes were most obvious on 6 d of plateau hypoxia.ConclusionRats fed in a hypobaric chamber simulating a altitude of 5 000 m for 2-10 d can eastablish the altitude hypoxia caused stress ulcer animal model,moreover the optimal time is 6 d.

stress ulcer；plateau hypoxia；model

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.025

R573.1

A

1671-8348(2017)27-3825-03

2016-11-01

2017-04-17)

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81360687)。

李永慧(1980-)，本科，副主任醫(yī)師，從事消化內(nèi)科的臨床工作?！?/p>

，E-mail:ym_0208@163.com。