景 勝，彭 靜，包曉航，陳 杰，杜智勇，李 洪，黃 河

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院麻醉科，重慶 400037)

丙泊酚對(duì)發(fā)育小鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的影響*

景 勝，彭 靜，包曉航，陳 杰，杜智勇，李 洪，黃 河△

(第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院麻醉科，重慶 400037)

目的觀察丙泊酚對(duì)發(fā)育小鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的影響。方法將健康同窩日齡7 d(P7)的C57小鼠分為3組：高劑量丙泊酚組、低劑量丙泊酚組和10%脂肪乳對(duì)照組。所有小鼠P7接受藥物處理。高劑量丙泊酚組腹腔注射丙泊酚60 mg/kg；低劑量丙泊酚組腹腔注射丙泊酚30 mg/kg；對(duì)照組腹腔注射同等體積的10%脂肪乳。部分小鼠注藥24 h(P8)后處死，其余小鼠飼養(yǎng)至日齡14 d(P14)處死。采用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)海馬齒狀回中Ki67、巢蛋白(Nestin)、腦脂結(jié)合蛋白(BLBP)及神經(jīng)元核心抗原(NeuN)的形態(tài)及表達(dá)量。結(jié)果高劑量丙泊酚組P8小鼠海馬齒狀回中Ki67標(biāo)記的神經(jīng)干細(xì)胞數(shù)量較10%脂肪乳對(duì)照組明顯減少(P<0.01)，且Nestin及BLBP標(biāo)記的干細(xì)胞纖維數(shù)量、長(zhǎng)度均受損(P<0.05)。P14小鼠海馬齒狀回中NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量低劑量丙泊酚組與10%脂肪乳對(duì)照組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而高劑量丙泊酚組較10%脂肪乳對(duì)照組顯著減少(P<0.01)。結(jié)論高劑量丙泊酚可抑制海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，損傷神經(jīng)干細(xì)胞突起數(shù)量及突起形態(tài)，導(dǎo)致神經(jīng)元成熟障礙。

二異丙酚；干細(xì)胞；海馬

丙泊酚因其誘導(dǎo)起效快、蘇醒迅速且無(wú)蓄積、不良反應(yīng)小等優(yōu)點(diǎn)，在臨床兒科及產(chǎn)科麻醉中已逐漸推廣使用。然而，越來(lái)越多的臨床觀察表明嬰幼兒術(shù)后認(rèn)知功能改變與全身麻醉藥物接觸有密切關(guān)系。近期有研究證實(shí)全身麻醉藥物對(duì)發(fā)育機(jī)體認(rèn)知功能有潛在的毒性作用，然而其具體作用機(jī)制還未明確。文獻(xiàn)報(bào)道海馬齒狀回發(fā)育與機(jī)體認(rèn)知功能緊密相關(guān)，而海馬齒狀回內(nèi)干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)生決定齒狀回發(fā)育，全身麻醉藥物丙泊酚是否通過(guò)調(diào)控海馬齒狀回干細(xì)胞進(jìn)而影響機(jī)體認(rèn)知功能尚不清楚。本研究擬采用丙泊酚處理發(fā)育小鼠模型，通過(guò)免疫組織化學(xué)及免疫熒光檢測(cè)丙泊酚對(duì)發(fā)育小鼠海馬齒狀回干細(xì)胞的影響，探討丙泊酚影響發(fā)育小鼠術(shù)后認(rèn)知功能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑 丙泊酚購(gòu)自Astra Zenenca公司，10%脂肪乳購(gòu)自Fresenius Kabi公司，兔抗Ki67購(gòu)自Thermo公司，鼠抗巢蛋白(Nestin)購(gòu)自BD公司 ，兔抗腦脂結(jié)合蛋白(BLBP)及神經(jīng)元核心抗原(NeuN)均購(gòu)自Milliproe 公司。生物素化抗鼠、抗兔二抗購(gòu)自Invitrogen公司，顯色試劑盒DAB購(gòu)自北京中杉公司，熒光二抗cy3抗兔、488抗鼠購(gòu)自Jackson公司。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1動(dòng)物與分組 本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)同意，所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)步驟均遵照美國(guó)國(guó)家衛(wèi)生局動(dòng)物實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)則(2011版)進(jìn)行，研究所需的健康C57BL/6J臨產(chǎn)孕鼠由第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，小鼠自由充足攝取食物和水，正常晝夜更替，飼養(yǎng)室溫控制在23 ℃左右。小鼠出生當(dāng)日記為P0，將日齡7 d(P7)同窩小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表分為3組：高劑量丙泊酚組、低劑量丙泊酚注射組、10%脂肪乳對(duì)照組。

1.2.2藥物處理 按照本課題組之前研究[1]制備發(fā)育小鼠麻醉暴露模型。腹腔注射不同劑量丙泊酚或10%脂肪乳。高劑量丙泊酚組腹腔注射丙泊酚60 mg/kg，低劑量丙泊酚組腹腔注射丙泊酚30 mg/kg，10%脂肪乳對(duì)照組腹腔注射等體積10%脂肪乳。注射藥物后將小鼠置于37 ℃恒溫充氧保溫箱中，待小鼠麻醉蘇醒后放回母鼠籠。注藥24 h后(P8)處死部分小鼠獲取大腦標(biāo)本，其余小鼠飼養(yǎng)至14 d(P14)處死獲取大腦標(biāo)本。

1.2.3免疫組織化學(xué) P8小鼠通過(guò)拖頸處死；P14小鼠以1%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉,經(jīng)左心室灌注0.9%生理鹽水約50 mL后，繼續(xù)灌注預(yù)冷的4%多聚甲醛約100 mL，灌注完畢后斷頭，收集大腦標(biāo)本用新鮮的4%多聚甲醛固定24 h,隨后采用30%蔗糖溶液脫水，待其充分脫水后，OCT包埋后用萊卡冰凍機(jī)切片(40 μm)，并將其置于凍存液中-20 ℃保存。選取合適的片源用0.01 mol/L PBS漂洗后，3%H2O2室溫處理20 min，0.01%PBS漂洗后浸泡于0.3%Triton X-100中，置于37 ℃孵箱孵育30 min，3%BSA封閉反應(yīng)1 h。分別加入含有一抗工作液兔抗Ki67(1∶500)及BLBP(1∶500)、鼠抗Nestin(1∶200)及NeuN(1∶500)，4 ℃孵育過(guò)夜。0.01%PBS漂洗后BLBP加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的488驢抗鼠IgG(1∶200)；Nestin加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的Cy3驢抗兔IgG(1∶200)；Ki67加入生物素化抗兔二抗(1∶500)；NeuN加入生物素化抗鼠二抗(1∶500)，均在37 ℃孵育2 h。BLBP、Nestin用PBS漂洗后與DAPI室溫下反應(yīng)1 min，漂洗后轉(zhuǎn)移到載玻片上，避光晾干，滴加防淬滅劑后封片。Ki67、NeuN在PBS漂洗后在37 ℃與SABC反應(yīng)1 h，DAB顯示，貼片晾干，中性樹(shù)脂封片。

2 結(jié) 果

2.1高劑量丙泊酚抑制P8小鼠海馬齒狀回內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的增殖 采用細(xì)胞增殖相關(guān)的核抗原標(biāo)記物Ki67檢測(cè)丙泊酚對(duì)P8小鼠海馬齒狀回中神經(jīng)干細(xì)胞的影響(圖1A～F)。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Ki67標(biāo)記的具有增殖功能的神經(jīng)干細(xì)胞主要分布于海馬齒狀回中的顆粒細(xì)胞層。3組Ki67陽(yáng)性細(xì)胞形態(tài)上未見(jiàn)明顯差異，高劑量丙泊酚組齒狀回顆粒細(xì)胞層的Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較低劑量丙泊酚組、10%脂肪乳對(duì)照組減少且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)圖1G。低劑量丙泊酚處理組與10%脂肪乳對(duì)照組間Ki67陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量未見(jiàn)差異(P>0.05)。

2.2丙泊酚抑制P8小鼠后海馬齒狀回內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的數(shù)量且損傷神經(jīng)干細(xì)胞突起 Nestin是一種中間絲類(lèi)型的蛋白，是神經(jīng)干細(xì)胞的特征性標(biāo)記物，同時(shí)能標(biāo)記放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的突起。通過(guò)免疫熒光檢測(cè)Nestin評(píng)估丙泊酚對(duì)P8小鼠海馬齒狀回中神經(jīng)干細(xì)胞的影響(圖2A～F)。研究結(jié)果表明：高劑量丙泊酚組海馬齒狀回中Nestin陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較10%脂肪乳對(duì)照組和低劑量丙泊酚組顯著減少(P<0.01)，見(jiàn)圖2G，同時(shí)發(fā)現(xiàn)高劑量丙泊酚組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞突起出現(xiàn)受損。

2.3丙泊酚對(duì)P8小鼠海馬齒狀回內(nèi)放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的影響 采用放射狀膠質(zhì)細(xì)胞突起的特異性標(biāo)記物BLBP檢測(cè)丙泊酚對(duì)P8小鼠海馬齒狀回中神經(jīng)干細(xì)胞形態(tài)的影響(圖3A～F)。免疫熒光結(jié)果顯示：高劑量丙泊酚組海馬齒狀回中BLBP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較10%脂肪乳對(duì)照組和低劑量丙泊酚組顯著減少(P<0.01)，見(jiàn)圖3G，且放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)突起受損較明顯；而與10%脂肪乳對(duì)照組相比較，低劑量丙泊酚處理組僅觀察到海馬齒狀回中BLBP陽(yáng)性細(xì)胞放射狀膠質(zhì)細(xì)胞的長(zhǎng)突起受損。

**：P<0.01，與對(duì)照組比較;*：P<0.05，與低劑量組比較

**：P<0.01，與對(duì)照組比較;*：P<0.05，與低劑量組比較

**：P<0.01，與對(duì)照組比較;*：P<0.05，與低劑量組比較

**：P<0.01，與對(duì)照組比較

2.4高劑量丙泊酚抑制P14小鼠海馬齒狀回內(nèi)成熟神經(jīng)元的數(shù)量 NeuN能夠特異性標(biāo)記成熟神經(jīng)元。通過(guò)評(píng)估P14小鼠海馬齒狀回中NeuN陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)量檢測(cè)丙泊酚對(duì)發(fā)育小鼠海馬齒狀回內(nèi)神經(jīng)元成熟的影響(圖4A～F)。免疫組織化學(xué)結(jié)果發(fā)現(xiàn)高劑量丙泊酚組海馬齒狀回中NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較10%脂肪乳對(duì)照組顯著減少(P<0.01)，見(jiàn)圖4G，其余未見(jiàn)明顯差異。

3 討 論

越來(lái)越多的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明在腦發(fā)育關(guān)鍵時(shí)期接觸全身麻醉藥物會(huì)對(duì)大腦產(chǎn)生潛在毒性，并可能損傷機(jī)體遠(yuǎn)期的認(rèn)知功能。最近臨床回顧性研究表明小于3歲嬰幼兒?jiǎn)未谓佑|全身麻醉藥物可能會(huì)導(dǎo)致學(xué)習(xí)、記憶和抽象推理障礙，且小于2歲嬰幼兒接觸兩次或多種麻醉藥物在19歲之前診斷注意力缺陷運(yùn)動(dòng)障礙風(fēng)險(xiǎn)是健康人的2倍[1-2]。既往研究表明嬰幼兒術(shù)后學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知能力障礙發(fā)生發(fā)展與全身麻醉藥物暴露有一定關(guān)聯(lián)[3]。

丙泊酚因麻醉誘導(dǎo)起效快、蘇醒迅速且無(wú)蓄積、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)，已成為臨床產(chǎn)科和兒科手術(shù)麻醉最常用全身麻醉藥物之一。既往研究證實(shí)丙泊酚通過(guò)GABA受體影響腦內(nèi)細(xì)胞凋亡或腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)改變[4-7]。同時(shí)有研究表明嬰幼兒使用全身麻醉藥物與認(rèn)知功能改變之間沒(méi)有因果關(guān)系[8]。而Stargatt等[9]的隊(duì)列研究指出丙泊酚是引起嬰幼兒行為改變的重要危險(xiǎn)因素之一；Wilder等[3]研究表明嬰幼兒期使用丙泊酚能導(dǎo)致后期學(xué)習(xí)障礙。況且，眾所周知與丙泊酚作用機(jī)制相似的乙醇在孕期或嬰幼兒期使用會(huì)導(dǎo)致嬰幼兒行為異常和認(rèn)知障礙。

全身麻醉藥物引起認(rèn)知功能障礙主要表現(xiàn)為海馬主宰的空間定向力受損、學(xué)習(xí)和記憶力受損，但其發(fā)生機(jī)制尚未明確。研究表明，決定海馬功能的重要因素取決于海馬顆粒下區(qū)齒狀回中神經(jīng)干細(xì)胞產(chǎn)生發(fā)育成熟神經(jīng)元的能力[10-11]。出生后早期海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞為放射狀膠質(zhì)細(xì)胞(radial glial cells,RGCs)，與大腦皮質(zhì)內(nèi)的RGCs類(lèi)似，海馬齒狀回內(nèi)的RGCs為具有極性特征的雙極細(xì)胞，其放射狀長(zhǎng)突起起到了類(lèi)似于“腳手架”的作用，從而引導(dǎo)海馬齒狀回內(nèi)神經(jīng)干細(xì)胞的遷移、分化[12]。海馬齒狀回中RGCs的神經(jīng)發(fā)生是形成新學(xué)習(xí)記憶的基礎(chǔ)。Barry等[13]證實(shí)RGCs在神經(jīng)發(fā)生在大腦功能的發(fā)育中發(fā)揮重要的作用。出生后海馬神經(jīng)發(fā)生可以被環(huán)境因素和神經(jīng)遞質(zhì)改變調(diào)控[14-15]。因此，丙泊酚是否通過(guò)調(diào)控海馬神經(jīng)干細(xì)胞神經(jīng)發(fā)生從而影響機(jī)體后期認(rèn)知功能值得研究。

Ki67是一種增殖細(xì)胞相關(guān)的核抗原，其功能與有絲分裂密切相關(guān)，是目前用來(lái)判斷細(xì)胞增殖能力的主要指標(biāo)之一。本研究免疫組織化學(xué)結(jié)果表明高劑量60 mg/kg丙泊酚組較10%脂肪乳對(duì)照組海馬齒狀回的Ki67陽(yáng)性細(xì)胞明顯減少，低劑量30 mg/kg丙泊酚組與10%脂肪乳對(duì)照組無(wú)明顯差異，提示丙泊酚抑制發(fā)育小鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞增殖且呈劑量依賴(lài)性。新生期海馬齒回神經(jīng)干細(xì)胞作為海馬神經(jīng)發(fā)生的起始點(diǎn)，其數(shù)量減少必將對(duì)海馬的正常發(fā)育過(guò)程造成影響，這可能導(dǎo)致更遠(yuǎn)期的神經(jīng)功能改變。

Nestin是神經(jīng)干細(xì)胞特征性標(biāo)記物，同時(shí)可以標(biāo)記RGCs的突起[16]。筆者發(fā)現(xiàn)相對(duì)于10%脂肪乳對(duì)照組，高劑量60 mg/kg丙泊酚不僅減少RGCs的突起數(shù)量，還導(dǎo)致長(zhǎng)突起的形成障礙。這個(gè)結(jié)論筆者又通過(guò)主要表達(dá)于RGCs，功能涉及神經(jīng)元的發(fā)育的BLBP指標(biāo)進(jìn)行驗(yàn)證，免疫熒光BLBP研究結(jié)論和Nestin熒光研究結(jié)果趨勢(shì)一致。這提示丙泊酚不僅影響發(fā)育小鼠齒狀回中干細(xì)胞增殖能力，還能夠抑制RGCS的發(fā)生。RGCS在海馬的神經(jīng)發(fā)生中發(fā)揮關(guān)鍵作用，一方面其能夠提供“腳手架”引導(dǎo)海馬中神經(jīng)元的遷移，形成正常海馬的分層結(jié)構(gòu)；另一方面，RGCS作為神經(jīng)祖細(xì)胞的一種，可以進(jìn)一步分化成為神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，是海馬中神經(jīng)元及膠質(zhì)細(xì)胞的來(lái)源。RGCs的發(fā)育受阻，對(duì)于海馬正常結(jié)構(gòu)形成及功能都有一定的影響。

通過(guò)檢測(cè)成熟神經(jīng)元標(biāo)記物NeuN觀察海馬區(qū)域成熟神經(jīng)元數(shù)量，發(fā)現(xiàn)高劑量60 mg/kg丙泊酚組P14小鼠海馬齒狀回中NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少且與10%脂肪乳對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而低劑量30 mg/kg丙泊酚組與10%脂肪乳對(duì)照組比較NeuN陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)未見(jiàn)明顯差異,提示高劑量丙泊酚抑制小鼠海馬齒狀回神經(jīng)干細(xì)胞發(fā)育成熟，并最終導(dǎo)致神經(jīng)元數(shù)量減少。海馬中神經(jīng)元是海馬發(fā)揮正常功能的基礎(chǔ)，這提示結(jié)構(gòu)的改變及神經(jīng)元數(shù)量的減少是丙泊酚暴露引起的行為改變的關(guān)鍵因素。

綜上所述，本研究結(jié)果表明丙泊酚抑制發(fā)育小鼠海馬齒狀回中神經(jīng)干細(xì)胞的增殖，同時(shí)損傷干細(xì)胞突起數(shù)量和形態(tài)，最后導(dǎo)致成熟神經(jīng)元的減少。丙泊酚影響發(fā)育小鼠海馬齒狀回干細(xì)胞的毒性作用呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性。筆者合理推測(cè)高劑量丙泊酚會(huì)影響海馬齒狀回神經(jīng)發(fā)生，通過(guò)此機(jī)制也能解釋臨床觀察發(fā)現(xiàn)嬰幼兒接觸全身麻醉藥物丙泊酚后出現(xiàn)認(rèn)知功能改變，但是其如何具體參與到臨床行為學(xué)的改變，有待后期更深入的研究。

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Effectsofpropofolonneuralstemcellsinmousedevelopinghippocampaldentategyrus*

JingSheng,PengJing,BaoXiaohang,ChenJie,DuZhiyong,LiHong,HuangHe△

(DepartmentofAnesthesiology,XinqiaoHospital,ThirdMilitaryMedicalUniversity,Chongqing400037,China)

ObjectiveTo observe the effects of propofol on neural stem cells in mouse developing hippocampal dentate gyrus (DG).MethodsHealthy 7 d old mice from the same litters were randomly allocated into three groups:high dose propofol group,low dose propofol group and 10% fat emulsion control group.All mice were treated with drugs on postnatal 7 d.The mice in high dose propofol group were intraperitoneally injected with 60 mg/kg propofol;the mice in low dose group were intraperitoneally injected 30 mg/kg propofol;while the mice in the control group with equivalent volume of 10% fat emulsion.Some mice were sacrificed at 24 h after medication injection,and the others were sacrificed at postnatal 14 d.The morphology and expression levels of Ki67,Nestin,BLBP and NeuN in hippocampal DG were detected by immunohistochemical method.ResultsHealthy 7 d old mice from the same litters were randomly allocated into three groups:high dose propofol group,low dose propofol group and 10% fat emulsion control group.All mice were treated with drugs on postnatal 7 d.The mice in high dose propofol group were intraperitoneally injected with 60 mg/kg propofol;the mice in low dose group were intraperitoneally injected 30 mg/kg propofol;while the mice in the control group with equivalent volume of 10% fat emulsion.Some mice were sacrificed at 24 h after medication injection,and the others were sacrificed at postnatal 14 d.The morphology and expression levels of Ki67,Nestin,BLBP and NeuN in hippocampal DG were detected by immunohistochemical method.ConclusionHigh dose propofol inhibits the proliferation of neural stem cells in hippocampal DG,and impaired the prominence number of neural stem cells and causes neurons dysmaturity.

propofol;stem cells;hippocampus

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.005

R994.1

A

1671-8348(2017)27-3759-04

2016-11-28

2017-05-06)

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81370210)。

景勝(1982-)，碩士，主治醫(yī)師，主要從事麻醉藥物毒性研究?！?/p>

，E-mail:13708385559@163.com。