王 平,郭曉宇,高 宇,劉 劍,山秀杰,張 蕊,葛曉春,馮增斌,李桂芳

(1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 067000 )

利拉魯肽對(duì)高脂喂養(yǎng)大鼠胰腺β細(xì)胞ATF4/CHOP通路的影響

王 平1,郭曉宇1,高 宇2△,劉 劍1,山秀杰2,張 蕊2,葛曉春2,馮增斌2,李桂芳2

(1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.承德醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科 067000 )

目的觀察利拉魯肽對(duì)高脂喂養(yǎng)大鼠胰腺GRP78、轉(zhuǎn)錄活化因子4(ATF4)、CCAAT區(qū)/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)、TRB3蛋白和mRNA表達(dá)情況，探討利拉魯肽對(duì)高脂喂養(yǎng)大鼠胰腺ATF4/CHOP通路的影響。方法將雄性Wistar大鼠44只分為對(duì)照組、高脂組、干預(yù)組1、干預(yù)組2，每組11只，對(duì)照組給予普通飲食，其余3組給予高脂飲食喂養(yǎng)8周后，干預(yù)組1給予利拉魯肽100 μg·kg-1·d-1皮下注射；干預(yù)組2給予利拉魯肽200 μg·kg-1·d-1皮下注射。藥物干預(yù)2周后處死，每組取5只大鼠行清醒狀態(tài)下高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)計(jì)算葡萄糖輸注率(GIR)，測(cè)定其余大鼠空腹血糖(FBG)、空腹胰島素(FINS)、血清游離脂肪酸(FFA)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)，計(jì)算胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-β)，Western blot和Realtime-PCR技術(shù)檢測(cè)胰腺GRP78、ATF4、CHOP和TRB3蛋白及mRNA的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，高脂組FBG、FFA、TC、FINS、TG、LDL-C水平顯著升高，HDL-C、GIR和HOMA-β明顯下降(P<0.05或P<0.01)，與高脂組相比，干預(yù)組2 HDL-C、GIR和HOMA-β升高(P<0.05或P<0.01)，其余指標(biāo)明顯下降；與干預(yù)組1相比，干預(yù)組2的血FGB、FFA、TC下降，GIR和HOMA-β升高(P<0.05)。與對(duì)照組相比，高脂組GRP78、ATF4、CHOP和TRB3蛋白及mRNA的表達(dá)明顯升高；與高脂組相比，干預(yù)組1與干預(yù)組2隨利拉魯肽濃度升高，GRP78、ATF4、CHOP和TRB3蛋白及mRNA表達(dá)逐漸下降。結(jié)論利拉魯肽可呈濃度依賴性改善高脂喂養(yǎng)大鼠胰島素抵抗及保護(hù)胰島β細(xì)胞，其作用機(jī)制可能涉及胰腺內(nèi)質(zhì)網(wǎng)ATF4/CHOP通路。

胰島素抗藥性;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;轉(zhuǎn)錄活化因子-4;CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白；利拉魯肽

2型糖尿病是一種進(jìn)展性疾病，胰島素抵抗(insulin resistance,IR)和胰島β細(xì)胞功能減退是兩個(gè)主要發(fā)病機(jī)制。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)可促進(jìn)IR和β細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致胰島功能衰竭[1]。胰高血糖素樣多肽-1(GLP-1)類似物利拉魯肽是治療2型糖尿病的新型降糖藥，該藥物可抑制胰腺β細(xì)胞凋亡，保護(hù)胰島β細(xì)胞功能并改善IR，但具體機(jī)制不明[2]。本實(shí)驗(yàn)利用利拉魯肽對(duì)高脂喂養(yǎng)IR大鼠進(jìn)行干預(yù)，觀察其對(duì)ERS相關(guān)轉(zhuǎn)錄活化因子4(ATF4)/CCAAT區(qū)/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)通路的影響，探討利拉魯肽改善IR保護(hù)胰島β細(xì)胞的可能機(jī)制，為其治療糖尿病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物與飼料 Wistar雄性大鼠44只，購(gòu)于北京維通利華。普通飼料組成：總熱量為337 kCal/100 g，碳水化合物64.19%，脂肪12.04%，蛋白質(zhì)23.77%。高脂飼料組成：總熱量為486 kCal/100 g，碳水化合物30.01%，脂肪53.75%，蛋白質(zhì)16.24%。普通飼料及高脂飼料購(gòu)于北京科奧協(xié)力有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d，分為對(duì)照組、高脂組、干預(yù)組1、干預(yù)組2，每組11只。對(duì)照組給予普通飲食，高脂組、干預(yù)組1、干預(yù)組2給予高脂飼料喂養(yǎng)，喂養(yǎng)8周后，對(duì)照組給予普通飲食+生理鹽水每日皮下注射，高脂組給予高脂飲食+生理鹽水每日皮下注射，干預(yù)組1給予高脂飲食+利拉魯肽100 μg·kg-1·d-1皮下注射，干預(yù)組2給予高脂飲食+利拉魯肽200 μg·kg-1·d-1皮下注射。藥物干預(yù)2周后各組取5只大鼠行清醒狀態(tài)下高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn)計(jì)算葡萄糖輸注率(GIR),判定大鼠胰島素抵抗情況。腹主動(dòng)脈取血處死各組其余大鼠，快速分離胰腺組織迅速置于-80 ℃液氮中隨后轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱中保存，用于Western blot和Real-time PCR檢測(cè)。

1.3清醒狀態(tài)高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗(yàn) 參照文獻(xiàn)[3]進(jìn)行。

1.4血液相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定 全血標(biāo)本室溫放置2 h，1 000 r/min離心20 min，取上清液，-80 ℃冰箱保存。使用全自動(dòng)生化分析儀采用FINS法測(cè)定空腹血糖(FBG)、總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)和高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)。血清游離脂肪酸(FFA)用ELISA試劑盒測(cè)定(購(gòu)于南京建成生物工程研究所)。

1.5胰島β細(xì)胞功能指數(shù)(HOMA-β)計(jì)算 HOMA-β=20×FINS/(FBG-3.5)。

1.6Western blot分析 將凍存的胰腺剪成小塊，取100 mg組織加入1 mL蛋白裂解液，冰上裂解30 min,4 ℃ 12 000 r/min離心10 min,取上清液，嚴(yán)格按照BCA法測(cè)定蛋白濃度。進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，每孔上樣40 μg，樣品分離后轉(zhuǎn)移至PVDF膜，設(shè)置電壓100 V，總電泳時(shí)間2 h左右。封閉、TBST洗膜分別加入GRP78一抗、ATF4一抗、CHOP一抗、TRB3一抗和β-actin一抗(購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司)室溫?fù)u床孵育2 h，TBST洗膜3次，分別加入二抗(購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司)4 ℃搖床過夜，TBST洗膜3次。在暗室中，ECL發(fā)光劑在X光膠片曝光。以β-actin為內(nèi)參對(duì)照，將膠片掃描后用Image J軟件分析。

1.7Real-time PCR檢測(cè) 按照 Trizol說(shuō)明書從胰腺組織提取總RNA。應(yīng)用Fast Quant RT kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒(天根生化科技有限公司)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系20 μL，嚴(yán)格按照說(shuō)明書反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以此為模板進(jìn)行RT-PCR，以β-actin作為內(nèi)參。每個(gè)循環(huán) 94 ℃變性15 s，68 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s。利用檢測(cè)到的熒光信號(hào)，得到每份標(biāo)本的擴(kuò)增曲線及熔點(diǎn)曲線，檢測(cè)反應(yīng)的特異性，得到各自的Ct值，每組均重復(fù)3次進(jìn)行。引物由Invitrogen公司設(shè)計(jì)合成，引物序列如下：GRP78上游5′-AAC CCA GAT GAG GCT GTA GCA-3′,下游5′-ACA TCA AGC AGA ACC AGG TCA C-3′;ATF4上游5′-GCA TCT GTA TGA GCC CTG AGT CC-3′,下游5′-CCA CGA GGA ACA CCT GGA GAA G-3′;CHOP上游5′-CCT CGC TCT CCA GAT TCCA-3′,下游5′-CTC ATT CTC CTG CTC CTT CTC C-3′;TRB3上游5′-TCA AGT TGC GTC GAT TTG TCT TC-3′,下游5′-CAG TCA TCA CAC AGG CAT CCT C-3′;β-actin上游5′-ATG CCA TCC TGC GTC TGG ACC TGG C-3′,下游5′- AGC ATT TGC GGT GCA CGA TGG AGG G-3′。得出Ct值通過公式2-ΔΔCt分析計(jì)算各目的基因相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1一般項(xiàng)目 與對(duì)照組相比，高脂組的血FBG、FFA、TC、TG、FINS、LDL-C均顯著升高，HDL-C、HOMA-β和GIR明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；與高脂組相比，干預(yù)組2血FBG、FFA、TC、FINS、TG、LDL-C均明顯下降，HOMA-β和GIR升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)；干預(yù)組1血FFA下降,HOMA-β和GIR明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);與干預(yù)組1比較，干預(yù)組2大鼠的FBG、FFA、TC明顯下降，HOMA-β和GIR明顯升高(P<0.05)，見表1。

表1 4組大鼠一般項(xiàng)目比較

a：P< 0.05，與對(duì)照組比較；b：P<0.01，與對(duì)照組比較；c：P<0.05，與高脂組比較；d：P<0.01，與高脂組比較；e：P<0.05，與干預(yù)組1比較

2.2各組大鼠胰腺ERS相關(guān)因子mRNA的表達(dá) 與對(duì)照組相比，高脂組胰腺GRP78、ATF4、CHOP、和TRB3 mRNA顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。與高脂組比較，干預(yù)組1和干預(yù)組2的GRP78、ATF4、CHOP和TRB3 mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與干預(yù)組1比較，干預(yù)組2 GRP78、ATF4、CHOP和TRB3的mRNA表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

*：P<0.05，與對(duì)照組比較；#：P<0.05,與高脂組比較；△：P<0.05,與干預(yù)組1比較

圖1各組大鼠胰腺ERS相關(guān)因子mRNA的表達(dá)

2.3各組大鼠胰腺ERS相關(guān)蛋白表達(dá)情況 Western blot檢測(cè)4組大鼠胰腺組織中GRP78、ATF4、CHOP和TRB3蛋白相對(duì)表達(dá)水平的比較：與對(duì)照組比較，高脂組GRP78、ATF4、CHOP、和TRB3的蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組(P<0.05)，經(jīng)利拉魯肽干預(yù)后，干預(yù)組1和干預(yù)組2 GRP78、ATF4、CHOP、和TRB3蛋白表達(dá)均下調(diào)，明顯低于高脂組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與干預(yù)組1比較，干預(yù)組2各組蛋白減少(P<0.05)，見圖2。

圖2 各組大鼠胰腺ERS相關(guān)蛋白表達(dá)情況

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)高脂飲食可導(dǎo)致機(jī)體代謝改變及IR和胰島β細(xì)胞功能紊亂，同時(shí)高脂環(huán)境是機(jī)體誘發(fā)IR的獨(dú)立危險(xiǎn)因素之一[4-6]。HOMA-β是用于評(píng)價(jià)個(gè)體的胰島β細(xì)胞功能的指標(biāo)，胰島β細(xì)胞功能降低則其數(shù)值降低，功能增強(qiáng)則其數(shù)值升高。鉗夾實(shí)驗(yàn)中GIR是國(guó)際上評(píng)價(jià)IR的金標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)值越低提示IR越明顯。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，高脂喂養(yǎng)大鼠與對(duì)照組相比，GIR、HOMA-β下降，F(xiàn)INS升高，出現(xiàn)了高胰島素血癥、IR及胰島β功能減退。同時(shí)出現(xiàn)FFA、TC、TG、LDL-C均顯著升高，HDL-C顯著性降低的血脂紊亂。利拉魯肽是一種長(zhǎng)效GLP-1類似物，利拉魯肽干預(yù)高脂喂養(yǎng)大鼠2周后，GIR升高，F(xiàn)INS下降，HOMA-β升高，血糖、血脂降低，HDL-C升高，且與100 μg·kg-1·d-1的利拉魯肽組比較，200 μg·kg-1·d-1利拉魯肽干預(yù)效果更明顯，這表明利拉魯肽呈濃度依賴性降低高脂飲食大鼠血糖、血脂，有效改善IR和胰島β功能減退，與既往的結(jié)果相似[7]。

研究發(fā)現(xiàn)高糖、高脂等應(yīng)激情況下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡被打破，使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)折疊錯(cuò)誤并堆積在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)，持續(xù)應(yīng)激引發(fā)ERS及細(xì)胞凋亡[8]。分子伴侶葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白(GRP78)是ERS標(biāo)志性蛋白。已有相關(guān)研究證實(shí)高脂條件下，大鼠胰腺發(fā)生IR，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子GRP78表達(dá)升高，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)通路，引起胰島功能衰退，導(dǎo)致糖尿病,本研究結(jié)果與之相似，高脂大鼠胰腺GRP78表達(dá)升高，這說(shuō)明IR和胰島功能減退與ERS密切相關(guān)[9]。雙鏈RNA依賴的蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的一種Ⅰ型跨膜蛋白，是ERS的3條通路之一，持續(xù)的ERS可使PERK激活下游真核起始因子2α(elF2α)和轉(zhuǎn)錄活化因子-4(ATF4)、前凋亡因子CCAAT增強(qiáng)結(jié)合蛋白同源蛋白(CHOP)和調(diào)解凋亡基因假性激酶Tribbles 3(TRB3)，CHOP和TRB3均參與細(xì)胞凋亡[10-12]。國(guó)外學(xué)者認(rèn)為，脂毒性較糖毒性更易誘發(fā)ERS，參與細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致IR和胰島功能衰退，出現(xiàn)糖尿病[8-9]。已有研究發(fā)現(xiàn)，在INS-1細(xì)胞，棕櫚酸誘導(dǎo)GRP78、ATF4、CHOP表達(dá)升高，提示FFA引發(fā)的ERS反應(yīng)可能在脂毒性所導(dǎo)致的β細(xì)胞凋亡的過程中發(fā)揮重要作用[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在高脂情況下，血中FFA升高，脂代謝紊亂，大鼠胰腺GRP78、ATF4、CHOP和TRB3的蛋白和mRNA均明顯升高，說(shuō)明高脂引起凋亡相關(guān)蛋白和基因的表達(dá)異常誘發(fā)ERS，可能參與IR和胰島細(xì)胞功能下降有關(guān)，與上述研究結(jié)果相一致。

Moffett等[14]發(fā)現(xiàn)利拉魯肽可減少糖尿病大鼠胰腺β細(xì)胞的凋亡，保護(hù)胰島β細(xì)胞，但是相關(guān)機(jī)制尚未闡明。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)利拉魯肽干預(yù)后，GRP78、 ATF4、CHOP的蛋白和mRNA及表達(dá)明顯下降，提示GLP-1受體激動(dòng)劑利拉魯肽可能通過ATF4/CHOP通路緩解ERS來(lái)保護(hù)胰島β細(xì)胞功能。已有研究發(fā)現(xiàn)TRB3不僅參與動(dòng)脈硬化病理變化，而且與IR、糖尿病密切相關(guān)[15]。本研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用利拉魯肽后不僅改善IR，而且下調(diào)了TRB3的表達(dá)，但二者之間的具體機(jī)制尚不清楚，需進(jìn)一步研究。近期臨床試驗(yàn)也證實(shí)，利拉魯肽一方面調(diào)節(jié)紊亂的血脂、血糖，改善IR等心血管危險(xiǎn)因素，另一方面也改善患者的胰島β細(xì)胞功能[16-18]。

綜上所述，高脂飲食出現(xiàn)脂代謝紊亂和胰島素抵抗和胰島細(xì)胞功能受損，應(yīng)用利拉魯肽后改善IR，調(diào)節(jié)糖脂代謝,緩解胰腺ERS，抑制ATF4-CHOP-TRB3通路基因的表達(dá)，減少胰島細(xì)胞凋亡起到保護(hù)胰島細(xì)胞功能作用，但是利拉魯肽在其他組織中是否通過相同機(jī)制改善IR減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，有待進(jìn)一步研究。

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EffectsofliraglutideonATF4/CHOPpathwayofpancreaticbetacellsinratsfedwithhigh-fatdiet

WangPing1，GuoXiaoyu1，GaoYu2△，LiuJian1，ShanXiujie2，ZhangRui2，GeXiaochun2，F(xiàn)engZengbin2,LiGuifang2

(1.ChengdeMedicalUniversity,Chengde,Hebei067000,China;2.DepartmentofEndocrinology,AffiliatedHospitalofChengdeMedicalUniversity,Chengde,Hebei067000,China)

ObjectiveTo observe the effects of liraglutide on GRP78,ATF4,CHOP and TRB3 protein and mRNA expression in rats which fed with high fat diet，and to explore the effect of liraglutide on ATF4/CHOP pathway of pancreas in rats fed with high fat diets.MethodsForty-four male Wistar rats were randomly divided into the control group,high fat group,intervention group 1 and intervention group 2,11 cases in each group.The control group was fed with common food,other 3 groups were fed with high fat diet for 8 weeks.Then the intervention group 1 was given with liraglutide (100 μg·kg-1·d-1) by subcutaneous injection;the intervention group 2 was given liraglutide (200 μg·kg-1·d-1) by subcutaneous injection.After 2 weeks medication intervention,the rats were killed.Five rats were taken from each group and performed the hyperinsulinemic englycemic clamp experiment under waking state for calculating the glucose infusion rate(GIR).The fasting blood glucose(FBG),fasting insulin(FINS),serum free fatty acid(FFA),total cholesterol(TC),triglyceride(TG),low density lipoprotein cholesterol(LDL-C) and high density lipoprotein(HDL) were examined,and islet beta cell function index(HOMA-β) were calculated.PCR and Western blot method were used to detect the expression of pancreas GRP78,ATF4,CHOP and TRB3 protein and mRNA.ResultsCompared with the control group,the levels of FBG,FFA,TC,FINS,TG and LDL-C in the high fat group were significantly increased,the levels of HDL-C,GIR and HOMA-β were significantly decreased(P<0.05 orP<0.01);compared with the high fat group,the levels of HDL-C,GIR and HOMA-β in the intervention group 2 were increased(P<0.05 orP<0.01),the other indicators were significantly decreased;compared with the intervention group 1,blood FGB,FFA,TC in the intervention group 2 were decreased,while the levels of GIR and HOMA-β were increased(P<0.05).Compared with the control group,expression of GRP78,ATF4,CHOP and TRB3 protein and mRNA in the high fat group were significantly increased;compared with the high fat group,the expression of GRP78,ATF4,CHOP and TRB3 protein and mRNA in the intervention group 1 and 2 were gradually decreased with the liraglutide concentration increase.ConclusionLiraglutide can improve insulin resistance and protect pancreatic beta cells in a concentration-dependent manner,its mechanisms may involve in the pancreatic endoplasmic reticulum ATF4/CHOP pathway.

insulin resistance;endoplasmic reticulum stress;ATF4;CCAAT/EBP homologous protein;liraglutide

10.3969/j.issn.1671-8348.2017.27.004

R322.57

A

1671-8348(2017)27-3755-04

2016-11-19

2017-04-07)

王平(1990-)，在讀碩士，主要從事糖尿病與脂代謝方面研究?！?/p>

，E-mail:yugao815@163.com。