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        鐵(Ⅱ)配合物的合成與ct-DNA作用的光譜分析

        2017-10-13 10:17:57陶璐長沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院湖南長沙421019
        化工管理 2017年28期
        關(guān)鍵詞:鵝掌楸虛線配體

        陶璐(長沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖南 長沙 421019)

        鐵(Ⅱ)配合物的合成與ct-DNA作用的光譜分析

        陶璐(長沙醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,湖南 長沙 421019)

        設(shè)計合成一個鐵(Ⅱ)配合物[Fe(LA)2Br2](LA=鵝掌楸堿),以ct-DNA為靶點,通過紫外-可見光譜、熒光光譜和DNA粘度實驗研究了配合物與ct-DNA的鍵合方式。研究表明所合成的配合物與DNA之間存在插入作用和靜電作用。

        配合物;ct-DNA;光譜分析;插入作用

        鵝掌楸堿是一種典型的異喹啉類生物堿,具有顯著的抗腫瘤、抗病毒、抑菌消炎等活性。鐵元素是人生命體內(nèi)必需的微量元素,尤其是二價鐵,每個血紅素都是由卟啉衍生物與鐵(Ⅱ)形成的絡(luò)合物。本文以鵝掌楸堿為配體,與鐵(Ⅱ)離子配位合成配合物[Fe(LA)2Br2](配合物晶體結(jié)構(gòu)見圖1)。以ct-DNA為靶點,通過紫外-可見光譜、熒光光譜和DNA粘度實驗研究了該配合物與ct-DNA的鍵合方式,為研究此類配合物的藥理活性提供了科學(xué)依據(jù)。

        圖1 配合物的晶體結(jié)構(gòu)圖

        1 實驗部分

        1.1 儀器與試劑

        紫外-可見光譜儀;SHIMADZU RF-5301PC熒光光譜儀;Brookfield DV-II pro數(shù)字式旋轉(zhuǎn)粘度計;數(shù)顯多功能測量儀。

        鵝掌楸堿;FeBr2;乙醇;十二烷基磺酸鈉(SDS)、三羥甲基氨基甲烷(Tris)購于Sigma公司、小牛胸腺DNA(ct-DNA)購于華美生物工程公司; GelRed購于Biotium公司);實驗用水均為二次蒸餾水。

        Tris-HCl-NaCl緩 沖 液:Tris 0.005 mol/L,NaCl 0.05 mol/L,pH值以鹽酸滴定調(diào)節(jié)至7.35;

        BPE 緩 沖 液 :Na2HPO40.006 mol/L,NaH2PO40.002 mol/L,Na2EDTA0.001 mol/L,pH = 6.99 ;DNA 純 度 :將適量的ct-DNA溶于Tris-HCl-NaCl 緩沖液中,經(jīng)紫外吸收光譜測定,在260nm和280nm處的吸光度符合:A260nm/A280nm≈1.8~1.9:1,表明DNA中不含蛋白質(zhì),因此使用之前不再純化[1]。DNA儲液濃度為2×10-3mol/L;GelRed濃度:將 原 始 的0.018 mol/L的GelRed用Tris-HCl-NaCl緩 沖 液稀釋為1.8×10-3mol/L的溶液;SDS:0.02 mol/L。

        1.2 實驗方法

        (1) 配合物的合成實驗

        稱 取LA(0.05 mmol,0.014 g)和FeBr2(0.05 mmol,0.001 g)加入到一端封閉的25cmPyrex厚壁玻璃管中,往管中滴加0.7mL EtOH和0.3mL H2O,用液氮冷凍后,在抽真空的條件下將開口端熔封,混合均勻后置于110℃烘箱中,待其靜置反應(yīng)三天后梯度降溫到室溫,生成大量黑色的菱形塊狀晶體(Yield:90%)。挑選合適的單晶進行X-射線衍射分析,確定配合物即[Fe(LA)2Br2]。

        (2)配合物的光譜分析實驗

        用DMSO作為溶劑將配合物配制2×10-3mol/L的儲備液。紫外-可見光譜滴定分析:將配合物溶液稀釋至2×10-5mol/L。①配合物與ct-DNA的紫外-可見光譜分析,按[ct-DNA]/[配合物]=0、0.1、0.2…1.1的比例依次測定紫外-可見光譜。②配合物與SDS的紫外-可見光譜分析,按[SDS]/[配合物]=0、0.5、1的比例分別測其紫外-可見光譜。DNA粘度的測定:溫度恒定在35℃,配合物儲備液以微量進樣器滴加 至ct-DNA的BPE緩 沖 液(1×10-3mol/L,23mL)中,按 照[配合物]/[DNA]= 0、0.01、0.02…0.10的累加比例逐漸滴加,反應(yīng)等量時間分別記錄η,以配合物的(η/η0)1/3對([配合物]/[DNA])作粘度分析曲線圖。熒光光譜滴定分析:a.配合物與ct-DNA的熒光光譜分析,配合物溶液稀釋至2×10-5mol/L,按[ct-DNA]/[配合物]=0、1、2…10的比例分別測其熒光光譜。b.GelRed、配合物與ct-DNA競爭性鍵合熒光光譜分析,將[ct-DNA]/[GelRed]比值固定為10:1,按[配合物]/[GelRed]=0:1、1:1、2:1…的比例趨勢依次加入配合物,觀察隨著配合物濃度的增加熒光曲線的變化,直到熒光曲線飽和。

        2 結(jié)果與討論

        化合物與DNA作用方式可分為共價結(jié)合、非共價結(jié)合和剪切作用三種,其中非共價結(jié)合主要包括:靜電結(jié)合、溝槽結(jié)合和插入結(jié)合三種形式[2]。

        2.1 配合物與ct-DNA的紫外-可見光譜分析

        圖2中虛線表示未加入ct-DNA時配合物的紫外吸收曲線,實線為隨著ct-DNA加入配合物的紫外吸收曲線。虛線中247nm和269nm處的特征吸收峰歸屬于稠環(huán)共軛體系的π→π*電子躍遷,416nm處的特征吸收峰歸屬于雜環(huán)N和羰基O的n→π*電子躍遷。隨著ct-DNA濃度的逐漸增加,吸收光譜表現(xiàn)出了減色和紅移現(xiàn)象。根據(jù)公式{ [DNA]/(εa-εf)=[DNA]/(εb-εf)+1/[Kb(εb-εf)]} 計 算 配 合 物 與DNA 作用的結(jié)合常數(shù)Kb([DNA]代表DNA的濃度;εa為表觀摩爾吸光系數(shù);εb為與DNA結(jié)合后的摩爾吸光系數(shù);εf為配合物的摩爾吸光系數(shù))。通常對DNA具有較強插入作用的化合物,其和ct-DNA的結(jié)合常數(shù)Kb>105mol/L。以[ct-DNA]為x軸,[ct-DNA]/( εa-εf)為y軸 作 圖,線 性 擬 合 得 到Kb=4.08×104mol/L,接近105mol/L。因此可以推斷,配合物與DNA存在插入作用。

        2.2 配合物與SDS靜電作用分析

        圖3中虛線表示配合物在二次蒸餾水中的紫外吸收曲線,實線表示隨著SDS加入配合物的紫外吸收曲線。隨著SDS濃度增大,247nm處的紫外吸收光譜出現(xiàn)了減色現(xiàn)象,吸光度由0.66763?降到0.60703?,說明配合物與SDS存在著靜電作用,可以推測配合物與同帶負電荷的DNA可能存在靜電作用。

        2.3 DNA粘度實驗

        當(dāng)平面小分子插入到DNA雙鏈相鄰的堿基對之間時,堿基對的間距會增大。DNA的結(jié)構(gòu)變松弛,相應(yīng)溶液的粘度會增大。而靜電作用、溝槽鍵合等則不會引起DNA溶液粘度的增加。所以測定溶液粘度是檢測配合物與DNA是否以插入方式結(jié)合最有效的方法[3]。

        圖2 配合物與ct-DNA相互作用的紫外光譜

        圖3 配合物與SDS的靜電作用圖

        圖4中實心三角形所連曲線是配體LA與ct-DNA作用后的相對粘度變化曲線,實心正方形所連曲線是配合物與ct-DNA作用后的相對粘度變化曲線。隨著配體、配合物的依次加入,ct-DNA溶液的粘度呈現(xiàn)明顯增大的趨勢。當(dāng)[配合物]/[ct-DNA]=0.1時,相對粘度比值(η/η0)1/3=1.1811。由此可以推測,配合物是以經(jīng)典的插入鍵合方式產(chǎn)生作用。配合物較配體使ct-DNA溶液粘度的增加的強度更高。表明配體LA與金屬配位后,提高了配體LA對生物大分子DNA的鍵合作用。

        2.4 熒光光譜分析

        圖5中虛線表示未加入ct-DNA時配合物的熒光發(fā)射曲線,實線表示隨著ct-DNA的濃度增大,配合物與ct-DNA作用后的熒光發(fā)射曲線。隨著ct-DNA濃度不斷增大,該發(fā)射峰的熒光強度表現(xiàn)明顯的減弱。當(dāng)[ct-DNA]/[配合物]=1時,配合物在505nm處的最大發(fā)射峰由I=697.419減弱到I=639.351,減色8.3%;當(dāng)[ct-DNA]/[配合物]=10時,I=412.481,總共減色40.9%。配合物與ct-DNA發(fā)生了插入作用從而熒光強度減弱。

        溴化乙錠EB具有共軛芳香平面性結(jié)構(gòu),其本身幾乎沒有熒光,但能平行插入雙鏈DNA的堿基之間使本身熒光強度顯著增強。如果小分子配合物也能與DNA發(fā)生類似的插入作用時,配合物會與EB競爭與DNA的結(jié)合位點,會使EB在DNA的結(jié)合位點部分游離出來,從而使體系的熒光強度減弱。因此,根據(jù)這一體系的熒光強度變化可初步判斷配合物與DNA的結(jié)合模式[4]。GelRed安全無毒的優(yōu)勢使其越來越廣泛地替代可致癌的EB用于生物化學(xué)分析[5]。

        圖6中虛線表示GelRed-ctDNA體系的熒光發(fā)射曲線,實線表示隨著配合物加入的熒光變化曲線。隨著配合物的濃度增大,配合物在504nm附近產(chǎn)生了很強的熒光發(fā)射,它的增強強度要明顯大于GelRed熒光的減弱程度。[配合物]/[GelRed]=0:1時,GelRed在590nm處的最大熒光強度為I0=437.015,[配合物]/[GelRed]=5:1 時,I=198.966,減色54.5%,此時GelRed熒光減色基本趨于飽和。這表明配合物、GelRed與ct-DNA之間存在著一定程度的競爭性鍵合作用,從而證明配合物對ct-DNA的插入作用。

        3 結(jié)語

        結(jié)果表明,配合物[Fe(LA)2Br2]由于配體鵝掌楸堿具有良好的平面型結(jié)構(gòu),能夠以插入鍵合的方式作用于DNA雙鏈的堿基對間。配合物與SDS存在著靜電作用,可以推測配合物與同帶負電荷的DNA可能存在靜電作用。

        [1]Marmur J.,et al.Aprocedure for the isolation of deoxyribonucleic acid frommicroorganisms[J].J.Mol.Biol.,1961,3∶208-218.

        [2]靳蘭,楊頻,李青山.熒光法研究手性金屬配合物與DNA的作用機理[J].高等學(xué)?;瘜W(xué)學(xué)報,1996,17∶1345-1348.

        [3]S.Satyanarayana,J.C.Dabrowiak,J.B.Chaires,et al.Neither Δ- nor Λ-tris(phenanthroline)ruthenium(II) binds to DNAby classical intercalation[J].Biochem.,1992,31(39)∶9319-9324.

        [4]沈景山,孫丹丹,付連春,等.熒光光譜法研究抗癌藥物與DNA的相互作用[J].光譜與光譜分析 ,2005,25(2)∶232-234.

        [5]Barton J K,Goldberg J M,Kumar C V,Turro N J.J.Am.Chem.Soc.,1986,108∶2081-2088.

        圖4 配體和配合物與ct-DNA作用相對粘度變化曲線圖

        圖5 配合物與ct-DNA相互作用的熒光光譜

        圖6 配合物、GelRed與ct-DNA競爭性鍵合的熒光光譜

        陶璐(1986- ),女,湖南醴陵人,講師,碩士研究生,研究方向:無機藥物化學(xué)。

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