郭 璇，閆杏杏，蔣彩虹，程立銳，楊愛國，馮全福，王元英*

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雪茄煙Beinhart1000-1對黑脛病0號生理小種的抗性遺傳分析

郭 璇1,3，閆杏杏2，蔣彩虹3，程立銳3，楊愛國3，馮全福3，王元英3*

（1.青島農(nóng)業(yè)大學，青島 266109；2.江西省撫州市煙草公司金溪分公司，江西金溪344800；3.中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所，煙草基因資源利用重點實驗室，青島 266101）

以煙草黑脛病重要抗源Beinhart1000-1、優(yōu)質(zhì)烤煙品種小黃金1025和香料煙Samsun NN及其配置的2個抗、感雜交組合為試驗材料，進行成株期黑脛病菌0號小種人工接種鑒定，選用四世代數(shù)量性狀“主基因+多基因”的混合遺傳模型對抗源Beinhart1000-1進行遺傳分析。結果表明，Beinhart1000-1在與Samsun NN配置的雜交組合1中，最優(yōu)遺傳模型是兩對加性-顯性主基因+加性-顯性多基因模型（E2），主基因遺傳率為99.14%，多基因遺傳率為0.48%；在與小黃金1025配置的雜交組合2中，最優(yōu)遺傳模型是兩對加性-顯性-上位性主基因模型（B1），主基因遺傳率為99.52%。表明Beinhart1000-1黑脛病的抗性遺傳以主基因效應為主，適合在早代進行選擇。

煙草；黑脛??；遺傳分析；主基因+多基因

煙草黑脛?。ǎ┦菬煵葑钪饕母坎『χ?，俗稱“烏頭病”、“黑稈瘋”，多數(shù)發(fā)生在成株期，少數(shù)發(fā)生在苗床期，高溫高濕時迅速流行[1-4]。黑脛病是我國煙草主要病害，平均每年因黑脛病造成的經(jīng)濟損失高達一億元以上，其影響僅次于煙草病毒病[5]。目前，在國內(nèi)外共發(fā)現(xiàn)4個煙草黑脛病菌的生理小種，分別是0號、1號和2號、3號[6]。據(jù)報道[7-13]從1985年至2011年，我國存在1號及0號生理小種，同時另有一個尚未鑒定出的生理小種。對比各種防治方法，選育抗病品種是防治煙草黑脛病最有效可行的措施。國內(nèi)外通過對煙草品種進行抗性篩選已鑒定出了一些抗源。目前，我國煙草黑脛病抗性來源主要是Florida301，它不僅對黑脛病菌的0號及1號生理小種有抵抗作用，而且還是數(shù)量遺傳的水平抗性。但同時Beinhart1000-1、L8、NC2326也是抗黑脛病品種，其中Beinhart1000-1的抗性表現(xiàn)最好，其抗性明顯高于抗源Florida301，而且對煙草黑脛病的所有生理小種都表現(xiàn)為高抗，同時，它對黑脛病的抗性跟Florida301一樣，也是數(shù)量遺傳的水平抗性，被認為是非常重要的黑脛病抗源[14]。因此，開展新抗源Beinhart1000-1的抗病遺傳機制研究對黑脛病抗性育種和有效防治煙草黑脛病都意義重大。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1份抗病品種美國雪茄煙Beinhart1000-1及2份感病品種小黃金1025（烤煙類型）、Samsun NN（香料煙類型）。材料均由國家農(nóng)作物種質(zhì)資源平臺煙草種質(zhì)資源子平臺提供。

利用上述3個品種配置2個雜交組合，即組合1（Beinhart1000-1×Samsun NN）和組合2（Beinhart1000-1×小黃金1025），分別獲得各自的P1、P2和F1、F2這4個世代群體（表1），并播種于中國農(nóng)科院煙草研究所青島實驗基地。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料準備 試驗材料種子播種于中國農(nóng)業(yè)科學院煙草研究所青島試驗基地溫室，托盤育苗，待煙苗長至6葉1心后，移栽于基地黑脛病病圃，進行正常栽培管理至成株期。

1.2.2 菌谷制備 首先在燕麥培養(yǎng)基上接種煙草黑脛病菌0號生理小種，并將其放在恒溫培養(yǎng)箱中28 ℃下黑暗培養(yǎng)4~6 d，至菌絲長滿培養(yǎng)基。將谷子加適量清水煮開，當谷粒煮開至半開花狀態(tài)時停止加熱，撈出谷粒瀝干水，冷卻后分裝入500 mL錐形瓶中，然后將錐形瓶放入高壓滅菌鍋中高溫高壓滅菌后冷卻備用[15]。把燕麥培養(yǎng)基用接種針平均劃分4到8份，并取其中1份培養(yǎng)基放入裝有谷子的錐形瓶，28 ℃黑暗培養(yǎng)12~14 d待菌絲基本長滿錐形瓶把菌谷從錐形瓶中倒出，攪拌均勻，作為接種源備用。

1.2.3 接種方法 用小刀在每株成株期煙苗的莖基部輕輕劃傷，傷口保持大小一致，然后在根部劃傷部位接種3~5 g菌谷，立即覆土，并灌水保濕。接種后1周左右，調(diào)查每株在田間的發(fā)病情況，計算病情指數(shù)。革新三號作為抗病對照，小黃金1025作為感病對照。

1.2.4 單株病情劃分具體標準 0級（免疫）：全株無??；l級（高抗）：1/3以下的莖部出現(xiàn)病斑，或1/3的葉片枯萎；3級（中抗）：1/3至1/2的莖部出現(xiàn)病斑，或全株葉片的1/3至1/2枯萎，或少數(shù)下部葉片出現(xiàn)病斑；5級（中感）：1/2的莖部出現(xiàn)病斑，但莖部未全部圍繞，或全株葉片的1/2至2/3枯萎；7級（高感）：全部莖部出現(xiàn)病斑，或全株葉片的2/3以上枯萎；9級（高感）：病株基本枯死。

1.3 遺傳分析

利用章元明等[16-17]、蓋鈞鎰等[18]、胡中立等[19]研究植物數(shù)量性狀常用方法來進行遺傳分析，即主基因+多基因混合遺傳模型的多世代聯(lián)合分離分析方法。假定數(shù)量性狀分別由1對主基因（A）、2對主基因（B）、多基因（C）和1對主基因+多基因（D）、2對主基因+多基因控制（E），構建5類，即A-E，共24種遺傳模型。利用最大似然法和IECM（Iterated expectation and conditional maximization）估算各世代和各成分分布的參數(shù)，再依據(jù)AIC（Akaike's information criterion）值的最小原則選擇出最佳模型，同時，依據(jù)5種適合性檢驗（包括12、22、32、2、檢驗），選擇最優(yōu)遺傳模型。為研究各組的遺傳效應，依據(jù)最優(yōu)遺傳模型的相應數(shù)據(jù)，利用最小二乘法來估算各基因的效應值。根據(jù)親本和F1同質(zhì)群體所顯現(xiàn)的環(huán)境誤差方差的無偏估計，計算誤差方差2，成分分布方差2f和群體表型方差2p。主基因、多基因的遺傳方差（2mg、2pg）及遺傳率（2mg、2pg）采用下列公式計算，用軟件SEA-G4F2進行數(shù)據(jù)分析：

2mg=2p－2f；2mg=2mg/2p

2pg=2f－2；2pg=2pg/2p

2 結 果

2.1 黑脛病抗源Beinhart1000-1的遺傳分析

2.1.1 兩組合4代黑脛病病級個數(shù)分布 兩組合各世代所用材料數(shù)見表1。兩組合各世代黑脛病病級個數(shù)的調(diào)查結果見圖1和圖2。如圖所示，Beinhart1000-1對黑脛病表現(xiàn)為抗性，與感病品種Samsun NN和小黃金1025表現(xiàn)有顯著差異（<0.001）。兩世代F1群體的病級與P1接近，由此推測Beinhart1000-1是顯性的抗病基因。組合1和組合2的F2群體均呈現(xiàn)較鮮明的偏態(tài)分布，主基因特征的抗性遺傳顯現(xiàn)出來，這表明由主基因控制抗黑脛病的遺傳。

2.2.2 主基因+多基因的遺傳性分析 2個組合的4個世代的黑脛病級數(shù)值的遺傳分析見表2。依據(jù)AIC準則（表2），將組合Beinhart1000-1×Samsun NN中E2、E3、B2、B5這4個AIC數(shù)值小的模型選為備選遺傳模型。共20個檢驗數(shù)值，利用適合性檢驗（表3），發(fā)現(xiàn)E3模型數(shù)值達到顯著水平的有15個，E2、B2、B5模型數(shù)值達到顯著水平的均有10個，其中AIC值最小的是E2，故將E2作為Beinhart1000-1抗黑脛病最優(yōu)遺傳模型，是兩對加性-顯性主基因+加性-顯性多基因模型。

表1 兩組合各世代材料數(shù)

圖1 P1(Beinhart1000-1)×P2(Samsun NN)組合四世代抗性級值個數(shù)分布圖

Fig. 1 Distribution of the number of plants with different resistance grades in 4 populations of the combination Beinhart1000-1×SNN

圖2 P1(Beinhart1000-1)×P2(小黃金1025)組合四世代抗性級值次數(shù)分布圖

依據(jù)AIC準則（表2），將組合Beinhart1000-1×小黃金1025中B1、B2、E1、E2這4個AIC數(shù)值小的模型選為備選遺傳模型。共20個檢驗數(shù)值，利用適合性檢驗（表3、4），發(fā)現(xiàn)B1模型數(shù)值達到顯著水平的有12個，B2、E1、E2模型數(shù)值達到顯著水平的均有12個，其中AIC最小的是B1，故將B1作為其最優(yōu)遺傳模型，是兩對加性-顯性-上位性主基因模型。

2.3 遺傳效應分析

在組合Beinhart1000-1×Samsun NN中黑脛病抗性表明2對加性-顯性主基因加多基因控制，即E2模型，并且2對主基因之間無互作關系。第1對主基因的加性效應和顯性效應分別是-2.95和-2.95，第2對主基因的加性效應和顯性效應分別是-1.63和-1.33，F(xiàn)2世代的主基因遺傳率和多基因遺傳率分別是99.14%和0.48%（表5）。

表2 兩組合遺傳模型的AIC值

表3 Beinhart1000-1×Samsun NN遺傳模型的適合性檢驗

注：12、22、32，均勻性檢驗；2，Smirnov檢驗；，Kolmogorov檢驗。*表示差異顯著（<0.05），下同。

表4 Beinhart1000-1×小黃金1025遺傳模型的適合性檢驗

注：122232，均勻性檢驗；2，Smirnov檢驗；，Kolmogorov檢驗。

表5 兩組合遺傳參數(shù)估計

注：a-第1主基因的加性效應；b-第2主基因的加性效應；[]-多基因加性效應值；[]-多基因顯性效應值。2p-表型方差；2f-成分分布方差；2e-環(huán)境方差；2mg-主基因方差；2pg-多基因方差；2mg-主基因遺傳率；2pg-多基因遺傳率。

在組合Beinhart1000-1×小黃金1025中黑脛病抗性表明2對加性-顯性-上位性主基因控制，即B1模型，其中，第1對主基因的加性效應是-3.95，顯性效應是-1.45；第2對主基因的加性效應是-0.45，顯性效應是-2.45。這表明加性效應是第1對主基因的主要影響因素，顯性效應是第2對主基因的主要影響因素。在上位性效應中，加性效應和顯性效應之間的互作效應較大，分別為2.45和-2.05。主基因的遺傳率是99.52%，抗性主要由遺傳因素控制。

3 討 論

煙草黑脛病作為煙草的主要病害，綜合多方面因素，培育抗病品種是最可行的辦法。但長期使用單一抗源導致其抗病性下降，發(fā)生抗病品種抗性丟失的危險，所以對新抗源的開發(fā)利用十分必要[14]。因此在本試驗中，對黑脛病重要的新抗源Beinhart1000-1進行了抗性遺傳分析。

3.1 不同抗源黑脛病抗性的遺傳規(guī)律比較分析

采用主基因+多基因混合遺傳模型，根據(jù)表型就能判定遺傳模型，這可為之后的基因定位提供依據(jù)，同時對育種親本選擇也有一定理論意義。目前利用該方法研究煙草葉數(shù)、株高、赤星病抗性等重要農(nóng)藝性狀遺傳已經(jīng)有所報道[20-24]，但是，在黑脛病抗源Beinhart1000-1的抗性遺傳研究中利用較少。根據(jù)煙草黑脛病抗性遺傳之前的報道，由于所選材料和方法的不同導致研究結果存在一定差異。黃文昌等[25]用Griffing 雙列雜交法，對具有黑脛病抗感差異的6個煙草品種設計36個雜交組合，結果表明，顯性效應是煙草黑脛病遺傳的主要效應，加性效應也影響較多，同時受環(huán)境影響。蔡長春等[26]利用白肋煙的抗黑脛病品種Burley37(P1)和感黑脛病品種Burley67(P2)配制F1代，通過花藥培養(yǎng)得到DH群體，根據(jù)植物數(shù)量性狀混合遺傳模型主基因+多基因多世代聯(lián)合分析法，其結果表明，主要由2對主基因和多基因來控制白肋煙的黑脛病抗性。李治國等[27]利用經(jīng)典遺傳分析法，使用兩個抗黑脛病品種Florida301和Coker371-Gold分別與感黑脛病品種紅花大金元和大白筋599配對雜交，結果表明，對黑脛病抗性，F(xiàn)lorida301表現(xiàn)可能是不完全隱性，主要由1對隱性基因控制；Coker371-Gold表現(xiàn)可能是不完全顯性，抗性由1對或2對顯性基因控制。與前人研究結果比較可知，黑脛病抗性遺傳機制復雜，不同抗源間遺傳規(guī)律不同，既受單基因控制，也受多基因控制。因此，在今后的研究中從分子水平上進一步發(fā)掘抗性基因對闡明黑脛病抗性遺傳規(guī)律具有重要意義。

3.2 雪茄煙Beinhart1000-1在黑脛病抗性基因發(fā)掘與分子育種中具有重要價值

本研究顯示，不同遺傳材料組合下同一抗病材料黑脛病抗性遺傳模型有所差異，因為Samsun NN和小黃金1025分別屬于香料煙和烤煙兩種不用類型，遺傳差異較大。黑脛病抗性基因（尤其是效應較小的微效基因）的表達在不同的遺傳背景下有所不同，存在一定的遺傳背景影響。因此，在黑脛病抗性育種過程中，應注意同一黑脛病抗源在不同組合中的抗性表達差異，盡量將受環(huán)境和遺傳背景影響小、效應值大的抗性位點聚合到改良品種中，提高抗黑脛病育種的效率。另一方面，兩個組合的遺傳分析都表明，煙草黑脛病抗源Beinhart1000-1攜帶兩個主效基因。這說明這兩個主效位點受遺傳背景影響較小，具有重要的育種利用價值。主基因加多基因遺傳模型分析和BSA（Bulk Segregation analysis）的聯(lián)合方法，是一種快速定位主效基因的有效策略。利用本研究確定了抗源的遺傳方式和主效基因數(shù)目、效應值等遺傳規(guī)律，在接下來的研究中可以利用BSA方法快速的確定主效位點的位置以及與之連鎖緊密的分子標記，從而可以將其快速利用于分子標記輔助選擇中。

4 結 論

本試驗對煙草重要抗源Beinhart1000-1的黑脛病抗性采用主基因加多基因的遺傳模型分析了其遺傳規(guī)律，結果表明，煙草黑脛病抗性組合1中受兩對加性-顯性主基因+加性-顯性多基因控制（E2），在組合2中受兩對加性-顯性-上位性主基因模型（B1），即煙草黑脛病抗性受兩對主基因控制，同時也受基因和環(huán)境影響。本研究采用主基因+多基因混合遺傳模型，依表型即可判斷遺傳模型，與前人黑脛病抗性QTL定位結果一致，因此遺傳模型的確定可供后續(xù)的基因定位作為參考，同時對煙草黑脛病抗性育種也有一定意義。

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Genetic Analysis of Beinhart1000-1 Resistance to Black Shank in Tobacco

GUO Xuan1,3, YAN Xingxing2, JIANG Caihong3, CHENG Lirui3, YANG Aiguo3, FENG Quanfu3, WANG Yuanying3*

(1. Qingdao Agriculture University, Qingdao 266109, China; 2. Fuzhou Tobacco Company of Jiangxi Province, Jinxi Branch, Jinxi, Sichuan 344800, China; 3. Tobacco Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Key Laboratory for Tobacco Gene Resources, Qingdao 266101, China)

Two resistant × susceptible hybrid combinations were made between the line resistant to black shank (Beinhart1000-1) and two susceptible materials, SNN (Samsun NN) and XHJ (Xiaohuangjin1025). All the three parents and the two crosses were performed black shank artificial inoculation and resistance evaluation at mature stage. The genetic characteristics of Beinhart1000-1 resistance were studied using the major gene plus poly gene model. The results showed that: The black shank resistance genetic model of the cross Beinhart1000-1 × SNN was identified to fit model E2 and the heritability of major genes and poly-genes were estimated to be 99.14% and 0.48%, respectively. For cross Beinhart1000-1 × XHJ1025, it fitted B1 model very well, and the heritability of major genes was estimated to be 99.52%. Because of the higher heritability of the major genes, the selection of black shank resistant plants could be done in early generations. These results could provide information on MAS for improvement of resistance to black shank disease in tobacco.

tobacco; black shank disease; genetic analysis; major gene plus polygene

S572.03

1007-5119（2017）02-0056-07

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.02.010

中國農(nóng)業(yè)科學院科技創(chuàng)新工程（ASTIP-TRIC01）；國家自然科學基金面上項目“一個新的煙草黑脛病主效抗性基因精細定位及克隆”（31571738）

郭 璇（1991-），女，在讀碩士研究生，研究方向：煙草遺傳育種。E-mail：xuanapple0318@163.com。

，E-mail：wangyuanying@caas.cn

2016-10-20

2017-02-30