李 奎，李曉旭，劉 成，段奇佳，郭永峰*

?

普通煙草RLP類受體蛋白家族成員的鑒定與進(jìn)化、表達(dá)分析

李 奎1,2，李曉旭1,2，劉 成1,3，段奇佳1，郭永峰1*

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院煙草研究所，青島 266101；2.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081；3. 云南省煙草公司曲靖市公司，云南曲靖 655000）

類受體蛋白（receptor-like proteins, RLPs）作為一類細(xì)胞表面受體，廣泛存在于高等植物中，參與調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆等過(guò)程。本研究以普通煙草（）TN90數(shù)據(jù)庫(kù)為基礎(chǔ)，構(gòu)建隱馬爾科夫模型進(jìn)行檢索，鑒定了普通煙草RLP家族成員；采用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析；利用GSDS對(duì)RLP家族成員的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行了分析；利用普通煙草TN90轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分析基因家族成員的表達(dá)情況；最后對(duì)普通煙草RLP家族成員進(jìn)行GO注釋分析。結(jié)果表明，在普通煙草中共鑒定出70個(gè)RLP家族成員，各成員的氨基酸序列長(zhǎng)度和等電點(diǎn)差異較大；系統(tǒng)進(jìn)化與基因結(jié)構(gòu)分析表明，普通煙草家族成員劃分為6個(gè)亞家族，基因結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單；轉(zhuǎn)錄組分析結(jié)果顯示，基因家族成員在不同組織和發(fā)育時(shí)期的表達(dá)有較大差異，個(gè)別成員在葉片衰老時(shí)期表達(dá)量較高；GO注釋結(jié)果表明，RLPs在植物的生長(zhǎng)發(fā)育、逆境響應(yīng)等過(guò)程中發(fā)揮作用。本研究結(jié)果將為普通煙草基因功能分析和利用奠定基礎(chǔ)。

普通煙草；基因家族；生物信息學(xué)分析

植物細(xì)胞表面受體以一種復(fù)雜的方式轉(zhuǎn)導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)外各種信號(hào)。植物類受體蛋白（receptor-like proteins, RLPs）是一類重要的細(xì)胞表面受體[1]，從結(jié)構(gòu)來(lái)看，RLPs由一個(gè)單向跨膜域、兩個(gè)eLRR域以及一個(gè)短尾細(xì)胞質(zhì)域組成，eLRR域中通常含有許多潛在的糖基化位點(diǎn)，表明RLPs可能是錨定于細(xì)胞膜上的糖蛋白受體[2]。

RLP蛋白在植物的生長(zhǎng)與發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[3]。擬南芥鑒定出57個(gè)基因[4]，楊樹(shù)鑒定出80個(gè)基因[5]，擬南芥CLV2和其玉米中的功能同源蛋白FEA2調(diào)控著分生組織的維持與分化以及相關(guān)器官的發(fā)育[6-7]。TMM是調(diào)控?cái)M南芥氣孔發(fā)育的關(guān)鍵因子[8]。RLP類受體蛋白也參與植物激素的信號(hào)傳導(dǎo)，如AtRLP41調(diào)控?cái)M南芥葉片對(duì)ABA的敏感性[4]，AtRLP44參與激活油菜素內(nèi)酯信號(hào)途徑[9]。

前期研究表明，多數(shù)RLP蛋白參與植物抗病過(guò)程[10]。包括蘋果抗黑星病菌蛋白HcrVf2[11]、番茄抗葉霉菌Cf類蛋白[12]、番茄抗黑白輪枝菌Ve類受體蛋白[13]、油菜莖基潰瘍病菌小種特異性抗性蛋白LepR3[14]等。在擬南芥中也發(fā)現(xiàn)了抗病蛋白，如AtRLP01能夠識(shí)別來(lái)自黃單胞菌的PAMP信號(hào)ReMAX，參與抗病反應(yīng)[15]； AtRLP52參與調(diào)控?cái)M南芥對(duì)二孢白粉菌的防衛(wèi)響應(yīng)[16]；AtRLP51參與NPR1介導(dǎo)的植物免疫反應(yīng)[17]；AtRLP42能夠識(shí)別真菌PAMP信號(hào)多聚半乳糖醛酸酶（PG）信號(hào)[18]。

RLP蛋白生物學(xué)功能研究主要集中在擬南芥，如CLV2、TMM[19]等，以及其他諸如蘋果HcrVf2蛋白、番茄Cf和Ve蛋白及小麥TaRLP1.1蛋白[20]，而煙草RLP蛋白的研究還未見(jiàn)報(bào)道。研究普通煙草基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)模式及其所編碼蛋白的理化性質(zhì)，有利于進(jìn)一步研究其在煙草生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的功能。本研究采用生物信息學(xué)方法從普通煙草基因組中鑒定了70個(gè)基因，并分析了家族成員的進(jìn)化關(guān)系、基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)情況等，用Blast2GO進(jìn)行GO注釋，對(duì)其生物學(xué)功能進(jìn)行預(yù)測(cè)，為開(kāi)展普通煙草基因的功能研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 普通煙草RLP家族成員的鑒定及序列分析

根據(jù)關(guān)于AtRLPs的文獻(xiàn)[4]，從TAIR數(shù)據(jù)庫(kù)（http://www.arabidopsis.org/）下載了擬南芥RLP家族蛋白全長(zhǎng)序列。在茄科植物數(shù)據(jù)庫(kù)（http://solgenomics.net/）下載普通煙草TN90蛋白序列。用構(gòu)建的隱馬爾科夫模型檢索普通煙草TN90蛋白序列數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得RLP候選序列，然后用InterPro（http://www.ebi.ac.uk/interpro/）工具剔除不含LRR的蛋白，得到普通煙草的RLP。利用ExPASy Proteomics Server（http://web.expasy.org/protparam/）工具對(duì)RLP家族成員的氨基酸長(zhǎng)度、分子量大小、蛋白質(zhì)疏水性、理論等電點(diǎn)等進(jìn)行分析。

1.2 普通煙草RLP家族系統(tǒng)發(fā)育分析

參照文獻(xiàn)[21]中方法，將預(yù)測(cè)的普通煙草RLP與擬南芥RLP蛋白全長(zhǎng)序列進(jìn)行比對(duì)。根據(jù)比對(duì)結(jié)果，用MGEA5重建鄰接發(fā)育樹(shù)。

1.3 普通煙草基因結(jié)構(gòu)分析

在茄科植物數(shù)據(jù)庫(kù)（https://solgenomics.net/），下載普通煙草TN90全基因組數(shù)據(jù)，用Perl程序分析所提取的基因的結(jié)構(gòu)信息，最后使用GSDS（http://gsds.cbi. pku.edu.cn/）工具對(duì)普通煙草基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化展示。

1.4 普通煙草基因表達(dá)分析及GO注釋分析

在NCBI SRA（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra）下載普通煙草TN90轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）數(shù)據(jù)，將表達(dá)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后用R語(yǔ)言pheatmap程序繪制熱圖（heatmap），將其表達(dá)數(shù)據(jù)可視化。用Blast2GO對(duì)普通煙草RLP蛋白序列進(jìn)行GO（Gene Ontology）注釋分析，利用WEGO工具對(duì)注釋結(jié)果進(jìn)行進(jìn)行可視化展示。

2 結(jié) 果

2.1 普通煙草RLP家族成員鑒定及其理化性質(zhì)分析

基于WANG等[4]對(duì)擬南芥RLP家族成員的分析，在普通煙草全基因組中鑒定出70個(gè)家族基因，將其命名（表1）。對(duì)普通煙草RLP家族成員進(jìn)行蛋白序列和理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，RLP家族成員間氨基酸的長(zhǎng)度差異較大，介于119aa（NtRLP63）~1136aa（NtRLP53），蛋白分子量則介于13.40 kD~83.55 kD。NtRLP家族成員蛋白的理論等電點(diǎn)從4.49（NtRLP67）到9.26（NtRLP38）不等，變化范圍較大，其中第II亞組中除了NtRLP51理論等電點(diǎn)（PI=8.56）大于7.0在堿性范圍內(nèi)，其他成員的理論等電點(diǎn)小于7.0（PI<7.0），均在酸性范圍內(nèi)，說(shuō)明這些成員富含酸性氨基酸；第III亞組中，NtRLP19（PI=7.82）富含堿性氨基酸，其余成員的理論等電點(diǎn)小于7.0（PI<7.0），表明其富含酸性氨基酸；第VI亞組除了NtRLP07（PI=7.18）富含堿性氨基酸外，其他成員富含酸性氨基酸（PI<7.0），說(shuō)明第II、III和VI亞家族絕大部分成員的蛋白由較多的酸性氨基酸組成。NtRLP家族中有26個(gè)成員蛋白疏水性為正值，說(shuō)明其為疏水性蛋白；44個(gè)成員蛋白疏水性為負(fù)值，表明其為親水性蛋白。

表 1 普通煙草RLP家族成員理化性質(zhì)分析

2.2 普通煙草RLP家族系統(tǒng)進(jìn)化與基因結(jié)構(gòu)分析

以擬南芥RLP家族為參考，根據(jù)序列比對(duì)的結(jié)果，利用MEGA重構(gòu)了鄰接樹(shù)（圖1）。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，普通煙草70個(gè)RLP家族成員可劃分為6個(gè)亞家族，第I~VI亞家族的成員個(gè)數(shù)分別為20、10、9、7、17、7。在6個(gè)亞家族中，第VI亞家族較其他5個(gè)亞家族親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，是一個(gè)較為獨(dú)立的分支，而又與該家族其他成員的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，是比較特殊的一個(gè)。

利用GSDS構(gòu)建普通煙草基因內(nèi)含子-外顯子結(jié)構(gòu)圖（圖2）?；蚪Y(jié)構(gòu)分析顯示，在家族70個(gè)成員中，45個(gè)成員沒(méi)有內(nèi)含子，17個(gè)只有1個(gè)內(nèi)含子，5個(gè)成員有4個(gè)內(nèi)含子，剩余基因所內(nèi)含子數(shù)目不等。第I亞組中，有10個(gè)內(nèi)含子，是家族中最多的；在第III亞家族中，除、外，其余成員均沒(méi)有內(nèi)含子。整體來(lái)看，基因家族成員結(jié)構(gòu)較為簡(jiǎn)單。

2.3 普通煙草基因家族的基因表達(dá)分析

基于TN90轉(zhuǎn)錄組（RNA-seq）數(shù)據(jù)，將普通煙草基因的表達(dá)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后用R語(yǔ)言進(jìn)行可視化展示（圖3）。圖3顯示，普通煙草基因在根、莖、幼葉、成熟葉、衰老葉等5個(gè)組織中都有表達(dá)。其中，、兩個(gè)基因在根、莖、幼葉、成熟葉、衰老葉5個(gè)組織中表達(dá)量都較高，說(shuō)明其可能在整個(gè)發(fā)育過(guò)程中都起作用。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，少數(shù)的基因的表達(dá)具有一定的組織特異性。特別是、、、四個(gè)基因在成熟葉中的表達(dá)量較高，表明它們可能參與調(diào)控營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)向生殖生長(zhǎng)過(guò)程的轉(zhuǎn)換。而僅在根部表達(dá)，可能調(diào)控根部的發(fā)育；、、只在莖部表達(dá)，在其他四個(gè)組織沒(méi)有表達(dá)，表明其與莖部的發(fā)育密切相關(guān)。有些基因的表達(dá)具有一定的規(guī)律性，如、隨著生長(zhǎng)發(fā)育的進(jìn)行表達(dá)量逐漸升高，在衰老葉片中表達(dá)量達(dá)到最高，而、只在衰老葉片中表達(dá)，據(jù)此可以推測(cè)它們可能參與調(diào)控葉片的衰老進(jìn)程。

2.4 普通煙草RLP家族GO注釋分析

我們對(duì)普通煙草RLP蛋白序列從細(xì)胞組成（Cellular Component）、分子功能（Molecular Function）和參與的生物學(xué)過(guò)程（Biological Process）三個(gè)方面進(jìn)行GO注釋（圖4）。Go注釋結(jié)果表明，在細(xì)胞組成和分子功能方面，普通煙草的RLP蛋白在細(xì)胞表面發(fā)揮結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)作用，這與RLP蛋白作為一類細(xì)胞表面受體的功能相吻合。RLP家族成員的生物學(xué)功能呈多樣化，主要參與細(xì)胞物質(zhì)代謝、酶代謝、多細(xì)胞組織形成、生長(zhǎng)發(fā)育等過(guò)程。

圖 1 普通煙草RLP家族成員鄰接進(jìn)化樹(shù)

注：T1，根；T2，莖；T3，幼葉；T4，成熟葉；T5，衰老葉。

3 討 論

RLP類受體蛋白廣泛參與植物生長(zhǎng)發(fā)育、逆境脅迫響應(yīng)、植物激素信號(hào)傳導(dǎo)等過(guò)程。擬南芥CLV2與CRN結(jié)合形成傳導(dǎo)CLV3信號(hào)受體復(fù)合體，調(diào)控?cái)M南芥莖頂端分生組織發(fā)育[22],小麥?zhǔn)荏w類蛋白TaRLP1.1參與小麥抗條銹病響應(yīng)過(guò)程[20]。SOBIR1與LerR3、AtRLP30等蛋白相互作用，參與調(diào)控植物抗病過(guò)程[23-24]。

本研究從普通煙草基因組中鑒定出70個(gè)基因。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，普通煙草的家族成員被分成了個(gè)6亞家族。第IV亞組中，只有有內(nèi)含子，其余成員沒(méi)有內(nèi)含子；第VI亞組成員基因結(jié)構(gòu)差異較大。GO注釋表明，RLP在細(xì)胞表面發(fā)揮結(jié)合與轉(zhuǎn)運(yùn)功能，這與其作為受體蛋白相吻合。WANG等[4]的研究表明可能參與調(diào)控?cái)M南芥葉片衰老過(guò)程。我們利用Arabidposis eFP Broswer(http://bbc.botany.utoronto.ca)數(shù)據(jù)庫(kù)分析家族成員表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)、、等在衰老葉片中表達(dá)水平非常高，可能參與擬南芥葉片衰老調(diào)控過(guò)程。普通煙草基因表達(dá)模式分析發(fā)現(xiàn)，與同源的具有類似的衰老組織表達(dá)特異性，隨著葉片落黃其表達(dá)量顯著上調(diào)，衰老葉片中表達(dá)量達(dá)到最高，其可能參與普通煙草葉片衰老的調(diào)控過(guò)程。特別需要指出的是，，兩個(gè)基因只在衰老的葉片中表達(dá)，這表明他們同樣可能參與普通煙草葉片衰老的調(diào)控。本研究對(duì)普通煙草基因家族進(jìn)行了全基因組鑒定、表達(dá)模式分析和功能注釋等分析，但其具體的生物學(xué)功能還有待于利用分子生物學(xué)方法進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Genome-wide Identification and Expression Analysis of theGene Family in

LI Kui1,2, LI Xiaoxu1,2, LIU Cheng1,3, DUAN Qijia1, GUO Yongfeng1*

(1. Tobacco Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Qingdao 266101, China; 2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China; 3. Qujing Tobacco Company of Yunnan, Qujing, Yunnan 655000, China)

Receptor-like proteins (RLPs) as an important class of cell surface receptors, are present in many plant species. RLPs have been implicated in multiple biological processes including plant development and stress responses. In this study, 70 RLP family genes were identified in. Phylogenetic analysis was performed using the neighbor-joining method and the results showed that thesefamily members could be classified into 6 subfamilies. Transcriptome analysis revealed that the expression patterns ofwere distinct in different tissue types and at different developmental stages, with a number of genes being up-regulated in senescing leaves. GO analysis suggested that the RLP family members could be potentially involved in a number of biological processes including developmental regulation and stress responses. The results of this study could be valuable resources for future investigation of the functions ofs in.

;family; bioinformatic analysis

S572.03

1007-5119（2017）02-0063-06

10.13496/j.issn.1007-5119.2017.02.011

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)增量重點(diǎn)項(xiàng)目“煙草葉片衰老的分子調(diào)控機(jī)制研究”（2013ZL024）

李 奎（1989-），男，碩士研究生，研究方向：煙草分子育種，E-mail：lk928346616@126.com。

，E-mail：guoyongfeng@caas.cn

2016-11-17

2017-02-19