李志英 周 軍 閆廷贊 周 倜 葉 姍

(常州市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 常州 213000)

過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子21對(duì)肺癌細(xì)胞裸鼠成瘤的影響

李志英 周 軍 閆廷贊 周 倜 葉 姍

(常州市第一人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，江蘇 常州 213000)

目的探討轉(zhuǎn)錄因子(TCF)21對(duì)肺癌細(xì)胞裸鼠成瘤的影響。方法選取人肺癌細(xì)胞SPC-A1，細(xì)胞轉(zhuǎn)染TCF21過(guò)表達(dá)載體(過(guò)表達(dá)組)和空載體(空載體組)，設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組中只加入轉(zhuǎn)染試劑，培養(yǎng)48 h，Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中TCF21的表達(dá)水平。將過(guò)表達(dá)TCF21的肺癌細(xì)胞接種到裸鼠皮下，分別在5、10、15、20 d測(cè)量腫瘤的長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算腫瘤體積并繪制腫瘤生長(zhǎng)曲線。在20 d時(shí)，取出腫瘤，稱量腫瘤重量，并計(jì)算瘤重抑瘤率，同時(shí)Western印跡檢測(cè)腫瘤組織中B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3、TCF21表達(dá)水平。結(jié)果過(guò)表達(dá)組肺癌細(xì)胞中TCF21水平明顯高于對(duì)照組(P<0.01)。過(guò)表達(dá)組腫瘤生長(zhǎng)與對(duì)照組相比明顯受到抑制(P<0.01)?？蛰d體組和過(guò)表達(dá)組的抑瘤率分別為(7.52±0.07)% 和(72.24±0.61)%，且過(guò)表達(dá)組腫瘤重量明顯低于對(duì)照組(P<0.01)。過(guò)表達(dá)組腫瘤組織中Cleaved Caspase-3、TCF21表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組，而Bcl-2水平明顯低于對(duì)照組(均P<0.01)。結(jié)論TCF21能夠抑制肺癌細(xì)胞的裸鼠成瘤能力。

肺癌；裸鼠成瘤；轉(zhuǎn)錄因子21；腫瘤生長(zhǎng)曲線

肺癌發(fā)病早期沒有明顯的癥狀，有超過(guò)60%的患者在就診時(shí)已處于晚期，另外肺癌具有易轉(zhuǎn)移、生長(zhǎng)速度快、預(yù)后差等特點(diǎn)〔1〕。轉(zhuǎn)錄因子(TCF)21是一種抑癌基因，在乳腺癌、結(jié)直腸癌、黑色素瘤、卵巢癌等組織中均發(fā)現(xiàn)TCF21表達(dá)下調(diào)甚至缺失〔2〕。TCF21能夠抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的生長(zhǎng)并對(duì)結(jié)直腸癌裸鼠成瘤能力具有抑制作用〔3〕。本研究探討TCF21對(duì)肺癌細(xì)胞裸鼠成瘤能力的作用。

1 材料與方法

1.1材料 細(xì)胞：人肺癌細(xì)胞SPC-A1購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。3～5周齡,體重18～22 g的雄性Balb/c裸鼠21只由江蘇醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供。主要儀器及試劑：胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco；RPMI1640培養(yǎng)基、胰蛋白酶、硝酸纖維素膜均購(gòu)自美國(guó)Sigma；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司；CO2培養(yǎng)箱購(gòu)自上海精密儀器儀表有限公司；B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2(Bcl-2)單克隆抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase)-3單克隆抗體、TCF21單克隆抗體、β 肌動(dòng)蛋白(β-actin)單克隆抗體均購(gòu)自無(wú)錫安迪生物工程有限公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 取保存于液氮罐中的人肺癌細(xì)胞SPC-A1，放到37℃中融化1 min，觀察細(xì)胞完全融合后，轉(zhuǎn)移至離心管中，1 000 r/min離心10 min，棄上清液，用含有10% 胎牛血清的RPMI1640細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。觀察細(xì)胞密度達(dá)到85%時(shí)，倒掉細(xì)胞培養(yǎng)液，加入0.25%的胰蛋白酶，放在37℃消化2 min，加入細(xì)胞培養(yǎng)液，離心后，加入適量的細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，接種到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SPC-A1細(xì)胞，以每孔4×105個(gè)細(xì)胞接種到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，觀察細(xì)胞融合度達(dá)到80%時(shí)，轉(zhuǎn)染開始。轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞培養(yǎng)液更換為不含胎牛血清的不完全培養(yǎng)液。取244 μl的不含胎牛血清的不完全培養(yǎng)液與6 μl的 Lipofectamine 2000混合后放在室溫下靜置5 min記為A液；將246 μl的不含胎牛血清的不完全培養(yǎng)液與4 μl的pIRES2-ZsGreen-TCF21質(zhì)粒載體(過(guò)表達(dá)組)、空載體質(zhì)粒載體(空載體組)混合后記為B液。取A液與B液在室溫下混合靜置20 min，加入到6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，放在37℃，5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 h，更換為含有胎牛血清的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用G418法篩選能夠穩(wěn)定表達(dá)質(zhì)?；虻募?xì)胞株進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。同時(shí)設(shè)置對(duì)照組，對(duì)照組中只加入轉(zhuǎn)染試劑。

1.4Western印跡檢測(cè)細(xì)胞中TCF21水平 取轉(zhuǎn)染后的SPC-A1細(xì)胞，用細(xì)胞刮刀收集細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，放在冰上裂解反應(yīng)15 min后，4℃，15 000 r/min離心30 min。吸取上清液，用二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量檢測(cè)試劑盒對(duì)蛋白樣品定量后，與加樣緩沖液按照4∶1的比例混合均勻，放在100℃的沸水中煮沸5 min，每孔加入40 μl至蛋白凝膠(5%濃縮膠，10%分離膠)上樣孔中，蛋白沒有進(jìn)入分離膠之前用60 V電壓電泳，進(jìn)入分離膠后用100 V電壓電泳。將蛋白凝膠在4℃，250 mA恒流下轉(zhuǎn)印90 min至硝酸纖維素膜上，放在5%脫脂奶粉中在37℃封閉60 min。依次放在一抗(600倍稀釋，4℃過(guò)夜)、二抗(37℃，90 min)結(jié)合后，加入化學(xué)增強(qiáng)發(fā)光法(ECL)顯色液，以β-actin為內(nèi)參，用Quantity one分析目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5裸鼠成瘤 21只雄性Balb/c裸鼠隨機(jī)分為三組，每組7只，取培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的對(duì)照組、空載體組、過(guò)表達(dá)組的細(xì)胞，配制成4×105個(gè)/ml濃度的細(xì)胞懸浮液，每組每只裸鼠取200 μl的細(xì)胞懸浮液接種到裸鼠的前肢背部的皮下。觀察腫瘤出現(xiàn)后，分別在5、10、15、20 d用游標(biāo)卡尺測(cè)量長(zhǎng)徑和短徑，計(jì)算裸鼠的腫瘤體積。腫瘤的體積=長(zhǎng)徑×短徑2×0.5。在第20天時(shí)，處死各組裸鼠，分離腫瘤，稱量移植瘤的重量，并計(jì)算每組的瘤重抑瘤率。瘤重抑瘤率=100%×(1-轉(zhuǎn)染組腫瘤重量/對(duì)照組腫瘤重量)。

1.6Western印跡檢測(cè)組織中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、TCF21表達(dá)水平 取各組腫瘤組織，提取組織蛋白，按照1.5中Western印跡檢測(cè)組織中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、TCF21表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS22.0軟件行t檢驗(yàn)、單因素方差。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中TCF21表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后，培養(yǎng)48 h，過(guò)表達(dá)組細(xì)胞中TCF21表達(dá)水平(1.22±0.6)明顯高于對(duì)照組(0.56±0.05)(P<0.01)?？蛰d體組(0.57±0.04)與對(duì)照組相比沒有明顯差異(P>0.05)。見圖1。

圖1 Western印跡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中TCF21表達(dá)水平

2.2腫瘤生長(zhǎng)曲線及抑瘤率 如圖2所示，第5天開始，對(duì)照組和空載體組腫瘤的生長(zhǎng)明顯高于過(guò)表達(dá)組(P<0.01)?？蛰d體組和過(guò)表達(dá)組的抑瘤率分別為(7.52±0.07)% 和(72.24±0.61)%；過(guò)表達(dá)組腫瘤的重量〔(165.43±14.54)mg〕明顯低于對(duì)照組〔(596.36±15.67)mg〕(P<0.01)，空載體組〔(551.61±16.98)mg〕與對(duì)照組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

圖2 腫瘤生長(zhǎng)曲線

2.3組織中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、TCF21表達(dá)水平檢測(cè)結(jié)果 過(guò)表達(dá)組中Cleaved Caspase-3、TCF21水平均明顯高于對(duì)照組，Bcl-2水平明顯低于對(duì)照組(均P<0.01)?？蛰d體組和對(duì)照組中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、TCF21表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見表1，圖3。

圖3 Western印跡檢測(cè)腫瘤組織中Bcl-2、Cleaved Caspase-3、TCF21表達(dá)水平

組別CleavedCaspase-3Bcl-2TCF21對(duì)照組0.64±0.040.62±0.060.46±0.06空載體組0.64±0.050.62±0.080.46±0.07過(guò)表達(dá)組1.05±0.081)0.11±0.031)0.78±0.131)

與對(duì)照組比較：1)P<0.01

3 討 論

肺癌的發(fā)病率在男性惡性腫瘤中位居首位，在女性惡性腫瘤中位居第3位〔4〕。目前治療肺癌的主要方法為手術(shù)治療、放化療輔助治療，但由于肺癌具有易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，5年內(nèi)的生存率只有20%左右〔5〕。

TCF21基因定位于6號(hào)染色體的6q32-24，TCF21是堿性螺旋-環(huán)-螺旋家族的成員之一，其在肺組織、腸道組織、腎組織、性腺等組織中均有表達(dá)〔6〕。研究表明，TCF21與腫瘤的發(fā)生有關(guān)，在乳腺癌、淋巴瘤、結(jié)直腸癌、卵巢癌等組織中均發(fā)現(xiàn)TCF21基因表達(dá)異常下調(diào)或缺失〔7〕。激活TCF21基因的表達(dá)后，腫瘤的生長(zhǎng)受到抑制，在頭頸部癌癥、腎癌等癌癥中均得以證實(shí)〔8〕。有研究表明，促進(jìn)肺癌細(xì)胞中TCF21表達(dá)后，肺癌細(xì)胞的生長(zhǎng)受到抑制，凋亡增多〔9〕。本研究結(jié)果說(shuō)明，TCF21能夠在體內(nèi)抑制腫瘤的生長(zhǎng)，能夠抑制肺癌細(xì)胞裸鼠成瘤。

Bcl-2是目前公認(rèn)的與腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡有關(guān)的蛋白，能夠抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡，是一種抑凋亡蛋白〔10〕。Caspase-3是Caspase蛋白家族成員之一，在Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)中發(fā)揮凋亡執(zhí)行作用，Caspase-3活化后能夠促進(jìn)凋亡的發(fā)生〔11〕。本研究結(jié)果提示，TCF21抑制肺癌細(xì)胞裸鼠成瘤可能與促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡有關(guān)。

1Brahmer J,Reckamp KL,Baas P,etal.Nivolumab versus docetaxel in advanced squamous-cell non-small-cell lung cancer〔J〕.N Engl J Med,2015;373(2):123-35.

2Yang Z,Li DM,Xie Q,etal.Protein expression and promoter methylation of the candidate biomarker TCF21 in gastric cancer〔J〕.J Cancer Res Clin Oncol,2015;141(2):211-20.

3Dai Y,Duan H,Duan C,etal.Down-regulation of TCF21 by hypermethylation induces cell proliferation,migration and invasion in colorectal cancer〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2016;469(3):430-6.

4楊大運(yùn),邢亞威,張?jiān)禄?等.老年非小細(xì)胞肺癌中 Raf 激酶抑制蛋白與 p-AKT 的表達(dá)及意義〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2016;36(3):644-5.

5J?nne PA,Yang JC,Kim DW,etal.AZD9291 in EGFR inhibitor-resistant non-small-cell lung cancer〔J〕.N Engl J Med,2015;372(18):1689-99.

6Kim JB,Pjanic M,Sazanova O,etal.TCF21 Regulates coronary artery disease causing aryl-hydrocarbon receptor gene expression and its downstream pathway activation by environmental ligands〔J〕.Circulation,2015;132(3):A17671.

7Arab K,Park YJ,Lindroth AM,etal.Long noncoding RNA TARID directs demethylation and activation of the tumor suppressor TCF21 via GADD45A〔J〕.Mol Cell,2014;55(4):604-14.

8Wang J,Gao X,Wang M,etal.Clinicopathological significance and biological role of TCF21 mRNA in breast cancer〔J〕.Tumor Biol,2015;36(11):8679-83.

9Yoo S,Leung SY,Zhu J.Abstract B22:Integrative analysis of DNA methylation and gene expression data reveals complex regulation of gastric cancer〔J〕.Cancer Res,2016;76(2 Supplement):B22.

10武 曉,劉鳳娟,王鵬飛,等.巴豆生物堿對(duì)肺腺癌細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制研究〔J〕.中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2016;13(1):17-20.

11Dar AA,Pradhan TN,Kulkarni DP,etal.Extracellular 2′ 5′-oligoadenylate synthetase 2 mediates T-cell receptor CD3-ζ chain down-regulation via caspase-3 activation in oral cancer〔J〕.Immunology,2016;147(2):251-64.

〔2017-03-11修回〕

(編輯 袁左鳴/滕欣航)

R739.41

A

1005-9202(2017)19-4760-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.19.030

江蘇省前瞻性研究專項(xiàng)基金項(xiàng)目(No.BE2013629)

周 軍(1969-)，男，碩士，主任醫(yī)師，主要從事肺癌的臨床診療研究。

李志英(1979-)，女，碩士，主治醫(yī)師，主要從事肺癌的基礎(chǔ)與臨床研究。