李浩洋，楊芳，劉瓊瑜，張憲臣（中山出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東中山528400）

“砍傷法”所結(jié)人工沉香的質(zhì)量評價(jià)Δ

李浩洋＊，楊芳，劉瓊瑜，張憲臣#（中山出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，廣東中山528400）

目的：對“砍傷法”所結(jié)人工沉香進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，為其科學(xué)種植與采摘提供參考。方法：采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法和高效液相色譜法，對3批“砍傷法”所結(jié)人工沉香（編號為1、2、3號，分別結(jié)香5、10、20年）的揮發(fā)性成分、液相特征圖譜、沉香四醇和醇溶性浸出物含量進(jìn)行檢測。結(jié)果：3批人工沉香的揮發(fā)性成分主要為芳香族類化合物、倍半萜類化合物、脂肪酸類化合物和色酮類化合物；2、3號樣品的液相特征圖譜與沉香對照品基本一致；3批樣品的沉香四醇含量為0.078%～0.254%，醇溶性浸出物含量為12.4%～20.8%。1號樣品的液相特征圖譜與沉香四醇含量不符合2015年版《中國藥典》（一部）相關(guān)規(guī)定。結(jié)論：“砍傷法”所結(jié)人工沉香與天然沉香具有相似的揮發(fā)性化學(xué)成分，結(jié)香10年以上的人工沉香質(zhì)量符合2015年版《中國藥典》（一部）中“沉香”項(xiàng)下的規(guī)定，可以代替天然沉香入藥。

砍傷法；人工沉香；質(zhì)量評價(jià)；氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法；高效液相色譜法

國產(chǎn)沉香為瑞香科植物白木香[Aquilaria sinensis（Lour.）Gilg]含樹脂的木材，主產(chǎn)于我國海南、廣東等地，是我國傳統(tǒng)的名貴藥材和天然香料，具行氣止痛、溫中止嘔、納氣平喘之功效[1]。長期以來由于對沉香資源的過度采伐，白木香植物資源日漸枯竭，現(xiàn)被列為國家二級保護(hù)野生植物，并載入《世界自然保護(hù)聯(lián)盟瀕危物種紅色名錄》[2]。

在自然界中，只有當(dāng)白木香受到刺激或損傷時(shí)，才會產(chǎn)生沉香，結(jié)香過程往往需要幾十年甚至上百年時(shí)間，遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足臨床用藥需求，因此人工結(jié)香技術(shù)得到迅速發(fā)展。根據(jù)結(jié)香誘導(dǎo)物質(zhì)的不同，人工結(jié)香技術(shù)主要分為三大類：物理法（砍傷法、打釘法和鑿洞法）、生物法和化學(xué)法，其中砍傷法作為最古老的人工結(jié)香技術(shù)，自古以來就得到廣泛應(yīng)用，并成為現(xiàn)今主要的人工結(jié)香技術(shù)之一[3-4]。

評價(jià)沉香質(zhì)量的主要參數(shù)為揮發(fā)性成分、液相特征圖譜、特征組分沉香四醇和醇溶性浸出物含量。2015年版《中國藥典》（一部）對沉香的液相特征圖譜、特征組分沉香四醇、醇溶性浸出物含量作了相關(guān)的規(guī)定[1]，同時(shí)揮發(fā)性成分作為沉香發(fā)揮藥效的主要成分，其組成和相對含量與沉香藥材的質(zhì)量直接相關(guān)[5]，而目前關(guān)于利用揮發(fā)性成分、液相特征圖譜和沉香四醇含量評價(jià)“砍傷法”所結(jié)人工沉香質(zhì)量的研究尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。因此，本研究擬通過測定“砍傷法”所結(jié)人工沉香的揮發(fā)性成分、液相特征圖譜、沉香四醇和醇溶性浸出物含量，對其質(zhì)量進(jìn)行評價(jià)，以期為砍傷法所結(jié)人工沉香的科學(xué)種植與采摘提供參考。

1 材料

1.1 儀器

TSQ Quantum XLS系列氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用儀及其工作站（美國賽默飛世爾科技有限公司）；1200高效液相色譜（HPLC）儀，包括二極管陣列（DAD）檢測器（美國Agilent公司）。

1.2 試劑

沉香對照品（批號：121222-201203，供鑒定用）、沉香四醇對照品（批號：111980-201501，純度：96.8%）均購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純，其余試劑均為分析純，水為超純水。

1.3 藥材

“砍傷法”所結(jié)人工沉香樣品3批，由中山市元一沉香產(chǎn)業(yè)投資有限公司利用“砍傷法”生產(chǎn)，并由中山市國林沉香科學(xué)研究所所長張小花工程師鑒定，其沉香原植物均為瑞香科沉香屬白木香[Aquilaria sinensis（Lour．）Gilg]。將樣品編號為1～3號，其結(jié)香時(shí)間分別為5、10、20年。

2 方法與結(jié)果

2.1 揮發(fā)性成分的分析

2.1.1 GC-MS條件 色譜條件為色譜柱：HP-5MS毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣；進(jìn)樣口溫度：250℃；載氣：99.999%He；柱流量：1.2 mL/min；柱溫：程序升溫（初始溫度40℃，保持1 min；以10℃/min升至190℃，保持1 min；再以2℃/min升至220℃，保持1 min；再以5℃/min升至290℃，保持3 min）；進(jìn)樣量：1 μL。MS條件為離子源溫度：250 ℃；電離模式：電子轟擊電離；質(zhì)譜傳輸線溫度：280℃；溶劑延遲時(shí)間：3.0 min；掃描方式：全掃描監(jiān)測掃描（SCAN）；掃描范圍：m/z 30～m/z 500。

2.1.2 揮發(fā)性成分的提取 將人工沉香樣品用超純水洗凈、晾干，粉碎后過三號篩，精密稱取0.5 g，置于具塞錐形瓶中，加入甲醇10 mL，冷浸過夜，超聲（功率：300 W，頻率：40 kHz）50 min，放冷，過濾。濾液置80℃水浴蒸至無醇味，用甲醇溶解并定容至1 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.1.3 揮發(fā)性成分的分析 將“2.1.2”項(xiàng)下提取的揮發(fā)性成分，按照“2.1.1”項(xiàng)下條件進(jìn)樣測定。通過Thermo Xcalib化學(xué)工作站數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)，由峰面積歸一化法計(jì)算各成分相對含量。以Nist Ms Search 2.0系統(tǒng)進(jìn)行檢索，并進(jìn)行人工譜圖解析。沉香樣品主要揮發(fā)性成分及相對含量見表1。

表1 3批樣品的揮發(fā)性成分及其相對含量（%%）Tab 1 Volatile ingredients and relative contents of 3 batches of samples（%%）

由表1可知，1號樣品共鑒定出27個(gè)化合物，其中芳香族類化合物2個(gè)，相對含量0.55%；倍半萜類化合物6個(gè)，相對含量16.72%；脂肪酸類化合物6個(gè)，相對含量20.47%；色酮類化合物12個(gè)，相對含量26.76%。2號樣品共鑒定出29個(gè)化合物，其中芳香族類化合物2個(gè)，相對含量0.69%；倍半萜類化合物6個(gè)，相對含量17.43%；脂肪酸類化合物7個(gè)，相對含量14.51%；色酮類化合物13個(gè)，相對含量38.90%。3號樣品共鑒定出36個(gè)化合物，其中芳香族類化合物5個(gè)，相對含量3.16%；倍半萜類化合物6個(gè)，相對含量20.37%；脂肪酸類化合物7個(gè)，相對含量12.78%；色酮類化合物16個(gè)，相對含量39.83%。

2.2 特征圖譜的測定

參照2015年版《中國藥典》（一部）“沉香”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，15%～20%A；10～19 min，20%～23%A；19～21 min，23%～33%A；21～39 min，33%A；39～40 min，33%～35%A；40～45 min，35%A；45～50 min，95%A；50～60 min，15%A）；流速：0.7 mL/min；檢測波長：252 nm；柱溫：30 ℃，進(jìn)樣量：10 μL。2.2.2 對照品溶液的制備 稱取沉香對照品（過三號篩）約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入乙醇10 mL，稱定質(zhì)量，浸泡30 min，超聲（功率：250 W，頻率：40 kHz）1 h，放冷，用乙醇補(bǔ)足損失的質(zhì)量，搖勻，靜置，取上層清液過濾，取濾液，即得。

2.2.3 樣品溶液的制備 稱取3批人工沉香樣品，其余操作同“2.2.2”項(xiàng)下，制得樣品溶液。

2.2.4 樣品的測定 分別精密吸取“2.2.2”“2.2.3”項(xiàng)下溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄其特征圖譜，結(jié)果見圖1。

圖1 HPLC特征圖譜Fig 1 HPLC chromatogram overlays

由圖1可知，沉香對照品共有6個(gè)特征峰，與2015年版《中國藥典》（一部）中沉香對照特征圖譜整體相似，表明本研究采用的沉香對照品滿足《中國藥典》中的要求。1號樣品僅顯示出1個(gè)特征峰（峰1），不符合《中國藥典》規(guī)定；2、3號樣品的6個(gè)特征峰與沉香對照品一一對應(yīng)，且峰1的保留時(shí)間約為16.4 min，與沉香對照品中峰1的保留時(shí)間基本一致，說明2、3號樣品的特征圖譜符合2015年版《中國藥典》（一部）中“沉香”項(xiàng)的規(guī)定。

2.3 沉香四醇的測定

參照2015年版《中國藥典》（一部）“沉香”項(xiàng)下方法進(jìn)行測定。

2.3.1 對照品溶液的制備 精確稱取沉香四醇對照品，用乙醇配制成質(zhì)量濃度為1 000 mg/L的對照品貯備液，4℃保存?zhèn)溆?。臨用時(shí)用乙醇逐級配制為質(zhì)量濃度分別為20.0、40.0、60.0、100.0、140.0、200.0 mg/L的系列對照品溶液。

2.3.2 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取“2.3.1”項(xiàng)下對照品溶液、“2.2.3”項(xiàng)下樣品溶液各10 μL，按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，沉香四醇峰理論板數(shù)均大于6 000，且峰形良好，保留時(shí)間穩(wěn)定，符合2015年版《中國藥典》（一部）相關(guān)規(guī)定。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 取“2.3.1”項(xiàng)下系列對照品溶液，按“2.2.1”項(xiàng)下方法進(jìn)樣測定，以沉香四醇的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x）、峰面積為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程y＝36.11x－22.20（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，沉香四醇在質(zhì)量濃度為20～200 mg/L內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.4 方法學(xué)考察 按照相關(guān)要求進(jìn)行操作。結(jié)果，精密度試驗(yàn)、穩(wěn)定性試驗(yàn)、重復(fù)性試驗(yàn)中沉香四醇峰面積的RSD均不大于2%（n＝6），加樣回收率在98.6%～104.7%之間（RSD＝10.3%，n＝9），符合方法學(xué)要求。

2.3.5 樣品含量的測定 取人工沉香樣品各3份，按“2.2.3”項(xiàng)方法制備樣品溶液，再按“2.2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果，1、2、3號樣品中沉香四醇的含量分別為0.078%、0.155%、0.254%，RSD分別為1.67%、1.95%、1.34%（n＝3）。其中2、3號樣品符合2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定的沉香四醇含量不低于0.10%的要求。

2.4 醇溶性浸出物含量的測定

按照2015年版《中國藥典》（四部）中“浸出物測定法（醇溶性浸出物）”測定。取人工沉香樣品各3份，每份約3 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，精密加入乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，靜置1 h后，連接回流冷凝管，于80～85℃加熱至沸騰，并保持微沸1 h。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定質(zhì)量，用乙醇補(bǔ)足，搖勻，用干燥濾器濾過。精密量取濾液25 mL，置于已干燥至恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3 h，再置于干燥器中冷卻30 min，迅速稱定質(zhì)量。計(jì)算醇溶性浸出物的含量（干燥品質(zhì)量/人工沉香樣品質(zhì)量×100%）。結(jié)果表明，1、2、3號樣品中醇溶性浸出物的含量分別為12.4%、17.4%、20.8%，RSD分別為1.52%、1.03%、1.21%（n＝3），均符合2015年版《中國藥典》（一部）規(guī)定的醇溶性浸出物含量不低于10.0%的要求。

3 討論

天然沉香的揮發(fā)性成分主要為芳香族類化合物、倍半萜類化合物、脂肪酸類化合物和色酮類化合物等[6-7]，且芳香族類化合物芐基丙酮和倍半萜類化合物白木香醛與沉香的結(jié)香機(jī)制有關(guān)[8-9]，而色酮類化合物沉香四醇是沉香的特征成分[1]。因此，這3個(gè)化合物在沉香真?zhèn)舞b定中具有極其重要的作用。本試驗(yàn)中3批“砍傷法”所結(jié)人工沉香的揮發(fā)性成分主要由芳香族類化合物、倍半萜類化合物、脂肪酸類化合物和色酮類化合物組成，雖然所含各類成分組成和含量存在差異，但均與天然沉香具有相似的揮發(fā)性成分，且均含有芐基丙酮、白木香醛和沉香四醇，并隨著結(jié)香時(shí)間的延長其含量呈增加的趨勢。

由于沉香在白木香植物中的形成是一個(gè)長期積累、演變的復(fù)雜過程，因此，不同沉香樣品的成分組成及含量都會有所不同。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，隨著結(jié)香時(shí)間的延長，“砍傷法”所結(jié)人工沉香的揮發(fā)性成分愈加豐富，且芳香族類化合物、倍半萜類化合物和色酮類化合物的含量也隨之增長。芳香族類成分芐基丙酮具有止咳作用，沉香螺旋醇等有活性的倍半萜類成分具有中樞抑制性鎮(zhèn)靜催眠作用和健胃作用，色酮類成分則具有一定的抗癌和抗腫瘤作用[10-12]。這說明結(jié)香時(shí)間越長，其所結(jié)沉香的藥效和質(zhì)量越好。而白木香植物成分脂肪酸含量的逐步降低，則說明沉香的結(jié)香過程就是白木香成分逐漸轉(zhuǎn)化為沉香成分的過程。

2015年版《中國藥典》（一部）中規(guī)定，沉香的液相特征圖譜應(yīng)呈現(xiàn)6個(gè)特征峰，并與沉香對照品特征圖譜整體相似，且沉香四醇和醇溶性浸出物含量須大于0.10%和10.0%[1]。本試驗(yàn)3批“砍傷法”所結(jié)人工沉香中，2、3號樣品的液相特征圖譜、沉香四醇和醇溶性浸出物含量均符合2015年版《中國藥典》（一部）的規(guī)定；而1號樣品的醇溶性浸出物含量雖符合規(guī)定，但其液相特征圖譜和沉香四醇達(dá)不到《中國藥典》的要求。由此可知，“砍傷法”所結(jié)人工沉香必須經(jīng)過一定的結(jié)香時(shí)間，才能生產(chǎn)出合格的產(chǎn)品。這也符合沉香在白木香植物中積累時(shí)間越長、品質(zhì)越佳的規(guī)律。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)通過測定3批“砍傷法”所結(jié)人工沉香的揮發(fā)性成分、液相特征圖譜、沉香四醇和醇溶性浸出物含量，對“砍傷法”所結(jié)人工沉香的質(zhì)量進(jìn)行了評價(jià)。研究結(jié)果表明，經(jīng)過適當(dāng)?shù)慕Y(jié)香時(shí)間，“砍傷法”所結(jié)人工沉香與天然沉香具有相似的揮發(fā)性化學(xué)成分，結(jié)香10年以上產(chǎn)品的質(zhì)量符合2015年版《中國藥典》（一部）中“沉香”項(xiàng)下的規(guī)定，可以代替天然沉香入藥。

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Quality Assessment of Artificial Aquilaria sinensis by“Cutting Inducing Technique”

LI Haoyang，YANG Fang，LIU Qiongyu，ZHANG Xianchen（Inspection and Quarantine Technology Center，Zhongshan Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Guangdong Zhongshan 528400，China）

OBJECTIVE：To conduct the quality assessment of artificial Aquilaria sinensis by“cutting inducing technique”，and provide reference for its scientific planting and harvest.METHODS：GC-MC and HPLC were adopted to detect the volatile ingredients，characteristic spectrum，incense tetraol and alcohol-soluble extract contents in 3 batches of artificial A.sinensis（Num.1，2，3，respectively for 5，10，20 years）by“cutting inducing technique”.RESULTS：The volatile ingredients of 3 batches of artificial A.sinensis mainly consisted of aromatic compounds，sesquiterpene compounds，fatty acid compounds and chromone compounds.The characteristic spectrums of samples 2，3 were basically the same with the reference substance of A.sinensis.The incense tetraol contents of 3 batches of samples were 0.078%-0.254%，and alcohol-soluble extract contents were 12.4%-20.8%.The characteristic spectrum and the incense tetraol content of sample 1 were not conformed to the standards in Chinese Pharmacopoeia（2015 edition，part 1）.CONCLUSIONS：Artificial A.sinensis by“cutting inducing technique”shows similar volatile ingredients to natural A.sinensis.The quality of artificial A.sinensis for more than 10 years is conformed to the standards in Chinese Pharmacopoeia（2015 edition，part 1），which can be used as medicine，replacing the natural A.sinensis.

Cutting inducing technique；Artificial Aquilaria sinensis；Quality assessment；GC-MS；HPLC

R282.5

A

1001-0408（2017）28-3996-04

2017-01-20

2017-07-30）

（編輯：劉明偉）

中山市科技計(jì)劃項(xiàng)目（No.2014A2FC241）

＊工程師。研究方向：中藥質(zhì)量控制與評價(jià)。電話：0760-88887380。E-mail：13590719076@139.com

#通信作者：高級工程師。研究方向：中藥質(zhì)量控制與評價(jià)。電話：0760-88887380。E-mail：496758046@qq.com

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2017.28.29