孫曉春，黃文靜，李 鉑，任 飛，唐志書

(陜西中醫(yī)藥大學(xué) 陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心/陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽(yáng) 712083)

桔梗(Platycodongrandiflorum)為桔?？?Campanulaceae)桔梗屬植物桔梗的干燥根，具有宣肺利咽、祛痰排膿之功效[1]。桔梗中主要含有皂苷、黃酮、多糖等有效成分[2]。研究表明黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等作用[3,4]。王曉林等[5]采用單因素試驗(yàn)及正交實(shí)驗(yàn)方法研究了桔梗莖總黃酮的純化工藝和體外抗氧化性。膜分離方法主要是依據(jù)不同分子量進(jìn)行分離，從而達(dá)到純化濃縮的目的[6]。本研究采用膜分離方法對(duì)桔?？傸S酮進(jìn)行純化，并對(duì)純化所得桔?？傸S酮進(jìn)行體外抗氧化性檢測(cè)，以期為膜分離方法的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)，為天然抗氧化劑的開發(fā)提供理論數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

桔梗(批號(hào)20141001，陜西興盛德藥業(yè)有限責(zé)任公司)，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)王繼濤高級(jí)實(shí)驗(yàn)師鑒定為桔?？浦参?Platycodon grandiflorum)的干燥根。

乙醇(成都科龍?jiān)噭?，DPPH (笛醫(yī)生物科技有限公司)，總抗氧化能力試劑盒 (批號(hào)20180306，南京建成生物工程研究所)。

KQ3200超聲波清洗儀(昆山市超聲儀器有限公司)，F(xiàn)A2004B電子天平(上海佑科儀器儀表有限公司)，LNG-CM-101膜分離設(shè)備(上海朗極膜分離設(shè)備工程有限公司)，UV-2600紫外分光光度計(jì)(日本島津)，1510全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀(賽默飛世爾科技公司)。

1.2 桔?？傸S酮的制備

稱取桔梗粉末150 g，加入料液比為1：20的80%乙醇超聲提取30 min ，過(guò)濾、濃縮、冷凍干燥得桔梗總黃酮粗提物，以F表示。將桔?？傸S酮粗提物加入適量蒸餾水，配置成質(zhì)量濃度為8 mg·mL-1溶液，取1L 溶液用膜分離設(shè)備進(jìn)行分離。第一種方法：依次過(guò)0.8 μm、0.2 μm、0.05 μm孔徑的膜，收集濾液；第二種方法：過(guò)0.8 μm孔徑的膜，收集濾液。第三種方法：過(guò)0.2 μm孔徑的膜，收集濾液；第四種方法：過(guò)0.05 μm的膜，收集濾液。將濾液濃縮、冷凍干燥成粉末，分別以F1、F2、F3、F4表示，稱重。

1.3 桔梗總黃酮含量檢測(cè)

總黃酮含量的測(cè)定采用 NaNO2-A1(NO3)3法[7]?？傸S酮含量(%)=桔梗總黃酮質(zhì)量/桔?？傸S酮粉末質(zhì)量×100。

1.4 體外抗氧化性檢測(cè)

清除DPPH·活性測(cè)定方法，參照吳小燕等[8]的清除DPPH·活性測(cè)定方法。清除·OH活性測(cè)定方法，參照汪荔等[9]的清除·OH活性測(cè)定方法?？偪寡趸芰y(cè)定按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)利用Excel 2013進(jìn)行分析和制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 桔?？傸S酮含量檢測(cè)結(jié)果

桔?？傸S酮含量檢測(cè)結(jié)果如表1所示，桔?？傸S酮粗提物F中總黃酮含量為50.10%，依次過(guò)0.8 μm、0.2 μm、0.05 μm孔徑的膜分離后得到的桔梗總黃酮F1中總黃酮含量為52.35%，F(xiàn)1粉末質(zhì)量為3.0015g，這可能是因?yàn)榻?jīng)過(guò)3種孔徑的膜微濾后損失較大。F2、F3和F4中桔梗總黃酮含量分別為61.14%、66.58%和60.25%，F(xiàn)3中桔?？傸S酮含量最大，表明經(jīng)過(guò)0.2 μm孔徑膜微濾后除雜效果較好。

表1 桔?？傸S酮含量檢測(cè)結(jié)果

2.2 體外抗氧化性檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 清除·OH活性測(cè)定結(jié)果 桔?？傸S酮清除·OH活性測(cè)定結(jié)果如圖1所示，桔?？傸S酮F3對(duì)·OH清除能力最高，，濃度為1.0 mg·mL-1時(shí)，清除率為68.42%，濃度為2.0 mg·mL-1時(shí)，清除率達(dá)到79.16%；其次是F2和F4，濃度為2.0 mg·mL-1時(shí)，對(duì)·OH清除率分別為73.01%和74.87%；F1和F對(duì)·OH清除能力較低，濃度為2.0 mg·mL-1時(shí)，對(duì)·OH清除率分別為66.03%和62.52%。圖1結(jié)果與表1中桔梗總黃酮含量檢測(cè)結(jié)果相一致，F(xiàn)3中桔梗總黃酮含量最高，對(duì)·OH清除能力亦最高。

圖1 桔?？傸S酮對(duì)·OH清除結(jié)果

2.2.2 清除DPPH·活性測(cè)定結(jié)果 桔?？傸S酮清除DPPH·活性測(cè)定結(jié)果如圖2所示，隨著桔?？傸S酮濃度的增加，對(duì)DPPH·的清除能力隨之增加，呈量效關(guān)系。對(duì)DPPH·的清除能力結(jié)果為F3>F2>F4>F>F1，與表1結(jié)果基本一致，即總黃酮含量越高，對(duì)DPPH·的清除能力越強(qiáng)。F3濃度為1.0 mg·mL-1時(shí)，對(duì)DPPH·清除率為90.50%.

圖2 桔?？傸S酮對(duì)DPPH·清除結(jié)果

2.2.3 總抗氧化能力測(cè)定結(jié)果 總抗氧化能力以達(dá)到同樣A值所需的FeSO4的濃度(mmol·L-1)表示，所需FeSO4的量越大，表明總抗氧化能力越高。結(jié)果如圖3所示，表明F3總抗氧化能力最高，其次為F2，而F、F1和F4三種桔?？傸S酮的總抗氧化能力無(wú)明顯差異。

圖3 桔?？傸S酮總抗氧化能力檢測(cè)結(jié)果

3 結(jié)論

桔?？傸S酮粗提物經(jīng)不同孔徑膜純化后，得到4種桔?？傸S酮。結(jié)果表明，經(jīng)0.2 μm孔徑膜微濾除雜效果較好，F(xiàn)3中桔?？傸S酮含量最高為66.58%，對(duì)·OH、DPPH·的清除作用以及總抗氧化能力均最高。F3濃度為1.0 mg·mL-1時(shí)，對(duì)·OH和 DPPH·的清除率分別為68.42%和90.50%。