劉青，劉波，丁曉彥*

(1.山東省中醫(yī)藥研究院,山東 濟(jì)南 250014; 2.山東省千佛山醫(yī)院,山東 濟(jì)南 250014)

十全大補(bǔ)膏中芍藥苷的含量測定

劉青1，劉波2，丁曉彥1*

(1.山東省中醫(yī)藥研究院,山東 濟(jì)南 250014; 2.山東省千佛山醫(yī)院,山東 濟(jì)南 250014)

建立了高效液相色譜法測定十全大補(bǔ)膏中芍藥苷含量的方法。采用Kromasil C18色譜柱(4.6 mm×250 mm, 5 μm)，以乙腈-水(17∶83,V/V)為流動(dòng)相，柱溫30 ℃, 進(jìn)樣量10 μL，檢測波長230 nm，流速 1.0 mL/min。結(jié)果表明，芍藥苷在0.083 6～0.627 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r= 0.999 8)，加樣回收率為98.98%～100.47%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.65%(n=6)。本方法專屬性強(qiáng)、靈敏度高、重現(xiàn)性好、操作簡便，適用于十全大補(bǔ)膏的質(zhì)量控制。

十全大補(bǔ)膏；芍藥苷；高效液相色譜法；含量測定

LIU Qing1, LIU Bo2，DING Xiao-yan1*

Abstract∶A HPLC method for the determination of paeoniflorin in tonic semifluid extract of ten ingredients was established. The HPLC analysis was performed on Kromasil C18column (4.6 mm×250 mm, 5 μm), acetonitrile-water (17∶83,V/V) as the mobile phase, and the column temperature was 30 ℃, injection volume was 10 μL, the detective wavelength was at 230 nm, at a flow rate of 1.0 mL/min. Results revealed that paeoniflorin at the content of 0.083 6～0.627 0 μg showed good linearity(r= 0.999 8)，the recovery rate was 98.98%～100.47%, RSD was 0.65% (n=6). This method is highly specific, sensitive, reproducible, and simple, which can be used for the quality control of this preparation.

Key words∶tonic semifluid extract of ten ingredients; paeoniflorin; HPLC; content determination

膏滋是采用中藥飲片經(jīng)過加水浸泡、煎煮、濃縮，再加冰糖或蜂蜜制成的一種稠厚半流體狀或凍狀制劑，民間俗稱膏方或補(bǔ)膏，是傳統(tǒng)中醫(yī)藥的主要?jiǎng)┬椭?，具有補(bǔ)虛扶弱、防病治病、糾正亞健康、抗衰延年等功效。本研究選取的十全大補(bǔ)膏臨床較為常用，具有溫補(bǔ)氣血的功效。處方主要由黨參、炒白術(shù) 、酒白芍等10種中藥組成[1]。 臨床用于久病體虛、氣短心悸、面色萎黃、氣血兩虛、頭暈自汗、精神倦怠、體倦乏力、四肢不溫、瘡瘍不斂、月經(jīng)量多等[2]。白芍為方中君藥，含芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、羥基芍藥苷、蛋白質(zhì)及三萜類成分，具有解熱痙攣、擴(kuò)張血管、鎮(zhèn)痛鎮(zhèn)靜、抗炎抗?jié)?、利尿的作用[3]。

目前文獻(xiàn)有十全大補(bǔ)丸、十全大補(bǔ)顆粒、十全大補(bǔ)酒中芍藥苷含量測定的報(bào)道,但采用高效液相色譜法測定十全大補(bǔ)膏中芍藥苷含量的文獻(xiàn)尚不多見。由于劑型不同，十全大補(bǔ)膏中除組方藥材外還含有阿膠和糖類，所以供試品的制備和測定方法都有所不同。為了有效控制十全大補(bǔ)膏的質(zhì)量，使其在臨床使用中更加安全有效，本文采用高效液相色譜法測定十全大補(bǔ)膏中芍藥苷的含量，為控制該制劑的質(zhì)量提供參考依據(jù)。

1 儀器、試劑與試藥

1.1儀器

高效液相色譜儀(包括e2695四元梯度泵、2996PDA檢測器、Empower3色譜工作站，美國Waters)；BP211D電子天平(德國Sartorius)；KQ-100醫(yī)用超聲波清洗器(江蘇昆山市超聲儀器有限公司);MILLI-Q超純水系統(tǒng)(德國Merck Millipore)。

1.2試劑

乙腈為色譜純(上海星可高純?nèi)軇┯邢薰?；乙醇、正丁醇為分析純；水為超純水。

1.3試藥

芍藥苷對照品(純度96.4%,批號(hào):110736-201438,中國食品藥品檢定研究院)；十全大補(bǔ)膏及陰性樣品(自制)；處方藥材(博康中藥飲片有限公司)。

2 方法與結(jié)果

2.1色譜條件

以Kromasil C18為色譜柱(250 mm× 4.6 mm,5 μm)；柱溫：30 ℃；流動(dòng)相：乙腈-水(17∶83，V/V);進(jìn)樣量：10 μL;檢測波長：230 nm；流速：1.0 mL/min。按上述色譜條件，理論板數(shù)按芍藥苷峰計(jì)算為4 227，芍藥苷色譜峰與其他雜質(zhì)峰分離良好，R>1.5。

2.2對照品溶液制備

精密稱取對照品10.47 mg，置50 mL具塞量瓶中，加稀乙醇溶解并定容，搖勻，作為對照品儲(chǔ)備液(質(zhì)量濃度為209 μg/ mL)，精密量取5 mL，置25 mL具塞量瓶中，加稀乙醇稀釋至刻度,搖勻，即得(質(zhì)量濃度為41.80 μg/ mL)。

2.3供試品溶液的制備

精密稱取十全大補(bǔ)膏約1.0 g，置250 mL具塞三角瓶中，加稀乙醇200 mL，密塞，稱定，超聲提取40 min，放冷，用稀乙醇補(bǔ)足失重，搖勻，離心5 min，取上清液100 mL蒸干，加入80 ℃熱水40 mL，使其溶解，放冷，用水飽和正丁醇萃取3次，每次40 mL，合并上清液置于蒸發(fā)皿，水浴揮干，加稀乙醇溶解殘?jiān)?，轉(zhuǎn)移至5 mL容量瓶定容并過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.4空白對照溶液的制備

根據(jù)十全大補(bǔ)膏處方工藝，取除白芍以外其他藥材和輔料，制成不含白芍的陰性樣品，再按2.3項(xiàng)下方法制備，得空白對照溶液。

2.5專屬性考察

取上述對照品溶液、供試品溶液和空白對照溶液，經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，按2.1項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣并測定，結(jié)果供試品溶液在與芍藥苷色譜峰相應(yīng)位置處有相同色譜峰出現(xiàn)，而陰性對照溶液在此位置處無色譜峰出現(xiàn)，說明十全大補(bǔ)膏中其他組分對芍藥苷測定無干擾，表明本實(shí)驗(yàn)方法專屬性良好。結(jié)果見圖1。

圖1 芍藥苷HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of paeoniflorin

2.6方法學(xué)考察

2.6.1 線性關(guān)系考察

分別精密吸取芍藥苷對照品溶液2、5、7、10、15 μL進(jìn)樣，以進(jìn)樣量(μg)對數(shù)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)進(jìn)行回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線Y=23 565X+325.32,r= 0.999 8。結(jié)果顯示,芍藥苷進(jìn)樣量在0.083 6～0.627 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.6.2 精密度實(shí)驗(yàn)

精密吸取已知濃度的芍藥苷對照品溶液，在2.1項(xiàng)色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，測得芍藥苷峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.67%，表明儀器精密度符合要求。

2.6.3 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

取十全大補(bǔ)膏樣品6份(批號(hào)：140122)，每份約1.0 g，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計(jì)算芍藥苷平均含有量為0.448 7 mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.11%，表明本法的重復(fù)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

精密吸取十全大補(bǔ)膏供試品溶液適量，室溫放置，于0、2、4、、8、12、24 h進(jìn)樣10 μL，所測峰面積相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.97%。表明供試品溶液室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6.5 加樣回收實(shí)驗(yàn)

精密稱取十全大補(bǔ)膏樣品(批號(hào)：140122)約0.5 g，平行6份，分別加入一定質(zhì)量的芍藥苷對照品，按2.3項(xiàng)下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣10 μL，測定計(jì)算芍藥苷平均回收率為99.58%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.65%。見表1。

表1 加樣回收率考察結(jié)果(n=6)

2.7樣品含量測定

取十全大補(bǔ)膏5個(gè)批號(hào)的樣品，每批3份，按2.3項(xiàng)下方法制備樣品溶液，再按2.1項(xiàng)色譜條件測定，結(jié)果見表 2。

表2 芍藥苷含量測定結(jié)果

3 討論

本文參考相關(guān)文獻(xiàn)資料[4-6]，對比了甲醇、乙醇、不同比例乙醇-水等溶劑條件下的提取方法對十全大補(bǔ)膏中芍藥苷成分提取效率的影響，發(fā)現(xiàn)采用稀乙醇作為提取溶劑時(shí)芍藥苷含量高，且雜質(zhì)干擾少。故選擇稀乙醇為提取溶劑。

采用Agilent Zorbax C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、大連依利特C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)、Kromasil C18(250 mm×4.6 mm,5 μm)3種不同品牌色譜柱對樣品進(jìn)行測定，流動(dòng)相為乙腈-水(17∶83，V/V)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)后者分離度高且峰型對稱，故選用Kromasil C18色譜柱。

本實(shí)驗(yàn)先后采用乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、甲醇-水為流動(dòng)相進(jìn)行分離，比較之后發(fā)現(xiàn)乙腈-水較其他體系分離時(shí)間短，有機(jī)相用量少，柱壓低，色譜峰峰型對稱，分離度和拖尾因子均符合要求，理論板數(shù)高，故選用乙腈-水溶液系統(tǒng)。對乙腈-水的比例(體積比從10∶90到20∶80)也進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)二者體積比17∶83時(shí)分離效果較好，因此采用該乙腈-水溶液系統(tǒng)為流動(dòng)相[7-10]。

本文通過對提取溶劑、色譜柱、流動(dòng)相組成和流動(dòng)相比例分別進(jìn)行比較，建立了十全大補(bǔ)膏中芍藥苷的含量測定方法，本方法分離度高，重現(xiàn)性好，可用于十全大補(bǔ)膏的質(zhì)量控制，同時(shí)也對其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步完善提供了參考。

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Content determination of paeoniflorin in tonic semifluid extract of ten ingredients

(1.Shandong Academy of Chinese Medicine, Jinan 250014,China;2.Qianfoshan Hospital of Shandong Province, Shandong University, Jinan 250012,China)

R284.1

A

1002-4026(2017)05-0028-04

10.3976/j.issn.1002-4026.2017.05.005

2017-03-13

山東省中醫(yī)藥科技發(fā)展計(jì)劃(2011-168)

劉青(1969—)，女，副研究員，研究方向?yàn)橹兴幏治觥-mail：wangboyavip@163.com

*通信作者，丁曉彥(1983—)，女，助理研究員，研究方向?yàn)橹兴幏治黾爸兴庂|(zhì)量控制。E-mail：kate-66@163.com