張 宇, 黃國弟, 黃 強(qiáng), 莫永龍, 覃 旭, 郭麗梅(廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001)

芒果CDDP分子標(biāo)記正交優(yōu)化設(shè)計(jì)及引物篩選

張 宇, 黃國弟, 黃 強(qiáng), 莫永龍, 覃 旭, 郭麗梅
(廣西壯族自治區(qū)亞熱帶作物研究所，廣西 南寧 530001)

以芒果基因組DNA為模板，選擇正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對控制DNA保守序列多態(tài)性——聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(CDDP-PCR)的4個(gè)因素(模板DNA濃度、dNTPs濃度、引物濃度、Mg2+DNA聚合酶用量)進(jìn)行正交試驗(yàn)，構(gòu)建了較佳的芒果CDDP-PCR反應(yīng)體系，含0.50 U Mg2+DNA聚合酶、0.40 mmol·L-1dNTPs、1.00 μmol·L-1引物、0.50 ng·μL-1模板DNA，加雙蒸水使得總體積達(dá)20.00 μL.對比四因子對PCR反應(yīng)的影響，影響最強(qiáng)的因素是含Mg2+的DNA聚合酶，影響最弱的因素是模板DNA.利用供試的20個(gè)芒果品種驗(yàn)證了該體系的穩(wěn)定性和可行性，21條CDDP引物均可擴(kuò)增出明晰整齊的條帶.

芒果; CDDP; 反應(yīng)體系; 引物篩選; 優(yōu)化

Abstract: To optimize the conserved DNA sequence polymorphism polymerase chain reaction (CDDP-PCR) for mango, orthogonal experiment, including 4 factors of template DNA concentration, dNTPs concentration, primer concentration, Mg2+DNA polymeras at 4 levels was designed, with mango genome DNA as template. The optimized CDDP-PCR system contained 0.50 U Mg2+DNA polymerase, 0.40 mmol·L-1dNTPs, 1 mol·L-1primer template DNA and 0.50 ng·μL-1DNA template, with double distilled water added to a total volume of 20 μL. The results showed that Mg2+DNA polymerase played the most important role in the PCR reaction, with DNA being the weakest factor. All 21 primers produced clear and neat bands for 20 mango species with the optimized condition.

Keywords: mango； CDDP； reaction system； primers screening； optimization

芒果(MangiferaindicaL.)屬于芒果屬(MangiferaL.)漆樹科(Anacardicaeae)常綠藥食兩用型經(jīng)濟(jì)樹種.芒果果色豐富、果型多樣，主要分布在南北回歸線之間的亞熱帶、熱帶地區(qū)以及干熱河谷地形區(qū)域，栽培歷史超過1 500 a，中國為其主要的分布區(qū)域，是栽培芒果的發(fā)源地之一[1-2].在長期的栽培馴化中，受種子高度雜合、市場種苗流通雜亂等因素的制約，芒果品種一直存在同名異物、異物同名等現(xiàn)象，通過實(shí)生變異、人工雜交、輻射誘變等途徑已培育出許多優(yōu)質(zhì)的芒果品種.然而，芒果存在高度異花授粉，這給親本選擇和品種區(qū)分帶來嚴(yán)重阻礙[3-4].因此，研發(fā)芒果品種鑒別技術(shù)具有很好的應(yīng)用價(jià)值.

單一遵從植物學(xué)性狀鑒定芒果種質(zhì)不能避免外界環(huán)境因素的影響，且鑒定時(shí)間較長，鑒定結(jié)果有偏差.采用分子標(biāo)記技術(shù)可有效規(guī)避以上因素的干擾.謝江輝等[5]利用RAPD分析了39份芒果屬種質(zhì)的胚性特征；He et al[6]利用ISSR明確了23份芒果栽培種之間的親緣關(guān)系；姚全勝等[7-8]應(yīng)用SSR標(biāo)記技術(shù)分別對11份芒果核心種質(zhì)資源進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建，對116份核心種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳分析；雷新濤等[9]對世界芒果主產(chǎn)區(qū)栽培的31個(gè)主流品種進(jìn)行了AFLP分析，研究芒果種內(nèi)的遺傳關(guān)系.然而，這些傳統(tǒng)上的隨機(jī)DNA分子標(biāo)記，往往得不到與目標(biāo)性狀基因相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記位點(diǎn)，其品種鑒別效率相對較低.隨著新的DNA標(biāo)記技術(shù)的不斷開發(fā)，SRAP[10-11]、TRAP[12]和SCoT[13]等新型目標(biāo)分子標(biāo)記技術(shù)也逐漸被應(yīng)用于芒果種質(zhì)資源的研究.

Collard et al[14]基于DNA保守序列特性，開發(fā)出CDDP(comserved DNA-derived polymorphism)分子標(biāo)記.它是根據(jù)植物DNA中具有重要遺傳信息表達(dá)功能的保守序列設(shè)計(jì)而來的單引物，且植物中DNA保守序列在不同物種間通用[15-18].在水稻(Oryzasativa)[14]、歐白英(Solanumdulcamara)[19]、菊花(Compositae)[20]、牡丹(Paeoniasuffruticosa)[21-22]、大豆(Soybean)[23]等植物材料上的應(yīng)用研究表明，CDDP分子標(biāo)記具有易操作、低費(fèi)用、強(qiáng)多態(tài)等特點(diǎn)，可有效產(chǎn)生與目標(biāo)性狀有關(guān)的標(biāo)記，是對RAPD、ISSR、TRAP、SCoT等隨機(jī)標(biāo)記方法缺陷的有效彌補(bǔ)，具有廣闊的應(yīng)用前景.然而，目前尚未發(fā)現(xiàn)CDDP分子標(biāo)記在芒果種質(zhì)資源上應(yīng)用的研究報(bào)道[18-23].

本研究以芒果為供試材料，建立其穩(wěn)定的CDDP反應(yīng)體系并進(jìn)行優(yōu)化，再篩選引物，為開展芒果遺傳親緣關(guān)系分析、品種鑒定、分子生物育種等工作奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

以廣西亞熱帶作物研究所資源圃內(nèi)20份芒果種質(zhì)(表1)的無病蟲害和機(jī)械外傷的嫩葉為供試材料.采摘后立刻裝入盛有冰塊的泡沫盒內(nèi)，帶回實(shí)驗(yàn)室保存于-30 ℃的冰箱內(nèi)[1].通過已知植物基因家族片段設(shè)計(jì)CDDP引物，引物共計(jì)21條(表2).

表1 供試芒果種質(zhì)材料Table 1 Mango materials used in this study

表2 CDDP引物序列及其基本信息Table 2 Basic information of CDDP primers

1.2 DNA模板的提取與檢測

參考張宇等[1]的方法，通過測定D230 nm、D260 nm、D280 nm檢測DNA純度；利用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA濃度，并于-30 ℃冰箱內(nèi)保存DNA模板，備用.

1.3 CDDP反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化

參照文獻(xiàn)[24-25]的方法，將模板DNA濃度、含Mg2+DNA聚合酶用量、dNTPs濃度、引物濃度4個(gè)因子設(shè)置4個(gè)梯度水平，采用L16(44)正交設(shè)計(jì)(表3)對芒果CDDP-PCR進(jìn)行體系優(yōu)化，3次重復(fù)，每個(gè)處理總體積均為20 μL.

表3 芒果CDDP-PCR反應(yīng)的L16(44)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 3 Factors and levels of L16(44) orthogonal design for mango CDDP-PCR reaction

1.4 CDDP-PCR擴(kuò)增程序及穩(wěn)定性驗(yàn)證

PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，退火50 s，72 ℃延伸2 min，循環(huán)40個(gè)；72 ℃后延伸8 min，10 ℃保溫.用于PCR體系優(yōu)化的引物為Myb1(5′-GGCAAGGGCTGCCGC-3′).PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取8 μL擴(kuò)增產(chǎn)物，加入1.5 μL 上樣緩沖液，將1.8%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))瓊脂糖凝膠(含熒光核酸燃料)放入Tris硼酸電泳緩沖液中電泳.電泳后，用凝膠成像儀拍照，觀察電泳結(jié)果.選取引物(表2)，按上述擴(kuò)增程序反復(fù)篩選引物.

2 結(jié)果與分析

2.1 芒果CDDP反應(yīng)體系的正交優(yōu)化分析

由芒果CDDP-PCR正交優(yōu)化設(shè)計(jì)電泳凝膠結(jié)果(圖1)可知，不同水平處理中各因素組合的不同，導(dǎo)致其擴(kuò)增結(jié)果差異較大.其中，處理9、12無擴(kuò)增條帶；處理1擴(kuò)增條帶微弱、模糊；處理13、16擴(kuò)增條帶較少；其余處理均可擴(kuò)增出符合后續(xù)試驗(yàn)要求的條帶，其中處理7、10擴(kuò)增條帶多且整齊、清晰.

M.DNA Marker DL2000 bp;1～16.組合編號見表4.圖1 芒果CDDP-PCR正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L16(44)電泳結(jié)果(引物mby1)Fig.1 Electrophoresis analysis of CDDP-PCR product for mango with primer mby1

將影響CDDP-PCR的4個(gè)因素分別設(shè)置4個(gè)梯度水平(表3)，采用L16(44)正交設(shè)計(jì)對芒果CDDP-PCR反應(yīng)體系進(jìn)行組合優(yōu)化.利用擴(kuò)增條帶數(shù)目、整齊度、層次感及底色等指標(biāo)進(jìn)行直觀分析，3次評分取均值[26]；求出同一水平下的每個(gè)因素的均值，再求出最大均值與最小均值之差，最終求級差R.R值越小表明該因素的影響越弱.從表4可知，在所設(shè)計(jì)的組合試驗(yàn)中，含Mg2+DNA聚合酶用量對CDDP擴(kuò)增反應(yīng)體系結(jié)果影響最大，dNTP濃度次之，模板DNA濃度的影響最小.方差分析結(jié)果(表5)也顯示，除DNA用量之外，其他因素對試驗(yàn)結(jié)果的影響都達(dá)到了顯著水平.

表4 芒果CDDP-PCR反應(yīng)正交試驗(yàn)L16(44)結(jié)果均值1)Table 4 Result of orthogonal test for mango CDDP-PCR reaction

1)k1～k4:各因素各水平下的得分?jǐn)?shù)據(jù)平均值.

表5 芒果CDDP-PCR反應(yīng)體系正交設(shè)計(jì)方差分析1)Table 5 Variance analysis of orthogonal design of mango CDDP-PCR

1)*表示差異達(dá)0.05顯著水平.

2.2 CDDP-PCR擴(kuò)增效果驗(yàn)證及引物的篩選

應(yīng)用優(yōu)化后的反應(yīng)體系(表3)和Myb1引物對20份芒果種質(zhì)(表1)進(jìn)行CDDP-PCR擴(kuò)增.20個(gè)芒果品種均可擴(kuò)增出明晰且穩(wěn)定的條帶(圖2).擴(kuò)增圖譜既顯示了芒果種內(nèi)的穩(wěn)定遺傳特性，又顯示了品種間的遺傳多樣性，表明該優(yōu)化體系適用于芒果CDDP-PCR分析.利用20份芒果種質(zhì)(表1)對21條CDDP引物進(jìn)行多態(tài)性篩選(圖3).從圖3可知，21條CDDP引物均適用于芒果CDDP-PCR擴(kuò)增.

M.DNA Marker DL2000;1～20.分別對應(yīng)表1中各品種.圖2 引物mby1對20個(gè)芒果品種的CDDP-PCR擴(kuò)增Fig.2 Electrophoresis analysis of CDDP-PCR product for 20 mango germplasms with primer mby1

M.DNA Marker DL2000;1～21.分別對應(yīng)表2中各引物.圖3 21條CDDP引物對湯米的PCR擴(kuò)增Fig.3 Electrophoresis analysis of CDDP-PCR product for Tommy with 21 CDDP primers

3 討論

與已報(bào)道的其他DNA標(biāo)記技術(shù)相比較，CDDP標(biāo)記可以更全面更細(xì)致地反映物種間的遺傳關(guān)系[27]，這得益于CDDP-PCR反應(yīng)體系各因素最佳的優(yōu)化組合.單因素多水平逐級優(yōu)化法只是針對研究PCR反應(yīng)體系中一個(gè)因素遵守某些規(guī)律變化時(shí)對反應(yīng)結(jié)果的影響，卻忽略了最重要的反應(yīng)體系各因素之間的相互影響.這對推測反應(yīng)體系最佳組合有很大的片面性，因此并不能確定單一因素的最佳濃度就是最佳濃度組合反應(yīng)體系，更無法反映多因素對反應(yīng)體系的相互影響[28].與單因素PCR優(yōu)化設(shè)計(jì)相比，正交優(yōu)化設(shè)計(jì)法能夠在較短的時(shí)間內(nèi)獲得理想的試驗(yàn)結(jié)果，同時(shí)考慮了各因素間的綜合效應(yīng)，也減輕了工作強(qiáng)度.應(yīng)東山等[29]利用正交設(shè)計(jì)優(yōu)化了適合芒果SRAP-PCR的較佳反應(yīng)體系[30-31].本研究利用正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)對芒果CDDP-PCR的反應(yīng)體系進(jìn)行了優(yōu)化及篩選引物，各因素不同水平組合(表3、圖1)形成的反應(yīng)體系擴(kuò)增結(jié)果差異性大.處理9、12肉眼無法觀察到擴(kuò)增條帶，其他組合均有擴(kuò)增條帶出現(xiàn)，處理1 擴(kuò)增條帶微弱，處理13、16擴(kuò)增條帶較少.綜合考慮擴(kuò)增條帶數(shù)量、特異性、亮度、整齊度和底色等因素，對CDDP-PCR擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行綜合評價(jià)，處理7和處理10擴(kuò)增條帶數(shù)量多、清晰度高、特異性強(qiáng).

Mg2+本身并不參與PCR擴(kuò)增反應(yīng)，但卻是PCR擴(kuò)增反應(yīng)中不可或缺的催化劑，催化DNA聚合酶的活性.Mg2+用量過少或過多時(shí)，可以減弱或增強(qiáng)DNA聚合酶的活性，使得擴(kuò)增條帶變少，或引起非特異性擴(kuò)增.從表3、圖1可知，當(dāng)Mg2+濃度為1.50 U時(shí)，處理9、12肉眼無法觀察到擴(kuò)增條帶；當(dāng)Mg2+用量為1.00 U時(shí)，16個(gè)組合設(shè)計(jì)均可觀察到擴(kuò)增條帶，當(dāng)Mg2+用量為2.00 U時(shí)，擴(kuò)增條帶分離度較差，所以含Mg2+DNA聚合酶用量選擇1.00 U.當(dāng)dNTPs濃度為0.30和0.40 mmol·L-1時(shí)，均可擴(kuò)增出差異性條帶.dNTPs是進(jìn)行PCR擴(kuò)增的原料，是生成特異序列不可或缺的堿基，濃度過低時(shí)擴(kuò)增條帶不夠充分；濃度過高時(shí)，容易形成聚合體，增加錯(cuò)配率，而使得條帶的層次感欠缺，不利于后續(xù)分析.因此當(dāng)dNTPs濃度過低或者過高時(shí)，要么擴(kuò)增條帶微弱稀少，要么擴(kuò)增條帶存在掃把狀.遵循材料最省原則，當(dāng)dNTPs濃度為0.30 mmol·L-1時(shí)擴(kuò)增效果較佳.引物濃度取0.40、0.60、0.80、1.00 μmol·L-14個(gè)水平，引物為0.40 μmol·L-1時(shí)出現(xiàn)的擴(kuò)增條帶少且弱，說明0.4 μmol·L-1引物濃度不能充分完成PCR擴(kuò)增反應(yīng).由于引物量的缺少而不能錨定引物位點(diǎn)，因而許多擴(kuò)增條帶未能得到充分?jǐn)U增、展示.擴(kuò)增效果較好的2個(gè)處理的引物濃度均為1.00 μmol·L-1，遵循擴(kuò)增效果最佳原則，選擇的最佳引物濃度為1.00 μmol·L-1.PCR擴(kuò)增是以適宜的模板DNA濃度為前提的，當(dāng)模板DNA濃度過低或者過高時(shí)，擴(kuò)增結(jié)果會(huì)出現(xiàn)條帶少、弱或者非特異性條帶增多的現(xiàn)象.條帶少、弱是因?yàn)镻CR反應(yīng)中沒有充足的原料，無法充分進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng).非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物增多是因?yàn)橹貜?fù)擴(kuò)增已有條帶，CDDP反應(yīng)體系對模板DNA濃度敏感度低(表4、5)，基于原料最省和效果最佳原則，選取0.50 ng·μL-1為最佳反應(yīng)水平.通過直觀分析法可知，R值的大小表示因素對結(jié)果影響的大小(表4).在正交優(yōu)化試驗(yàn)的4個(gè)因素中，對體系結(jié)果影響大小表現(xiàn)為：含Mg2+DNA聚合酶用量>dNTPs濃度>引物濃度>模板DNA濃度.較佳的芒果CDDP-PCR反應(yīng)體系為：1.00 U含Mg2+DNA聚合酶、0.40 mmol·L-1dNTPs濃度、1.00 μmol·L-1引物濃度、0.50 ng·μL-1模板DNA用量，加雙蒸水使得總體積達(dá)到20.00 μL.本研究結(jié)果表明目前所有CDDP引物均適用于芒果的遺傳多樣性分析.

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(責(zé)任編輯:葉濟(jì)蓉)

OrthogonaloptimizationofCDDP-PCRsystemandprimerscreeningformango

ZHANG Yu, HUANG Guodi, HUANG Qiang, MO Yonglong, QIN Xu, GUO Limei
(Guangxi Subtropical Crops Research Institute, Nanning, Guangxi 530001, China)

S667.7

A

1671-5470(2017)05-0546-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.05.011

2017-03-23

2017-06-15

廣西自然科學(xué)基金(2016GXNSFAA380164)；廣西自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(2015GXNSFBA139085)；農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系廣西創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)建設(shè)專項(xiàng)資助項(xiàng)目(nycytxgxcxtd-06-01).

張宇(1983-)，男，助理研究員，碩士.研究方向：熱帶果樹分子育種.Email:375900554@qq.com.通訊作者黃國弟(1964-)，男，研究員.研究方向：熱帶果樹栽培育種. Email:gxhgd@126.com.