陳大福, 王鴻權, 李汶東, 熊翠玲, 鄭燕珍, 付中民, 徐細建, 黃枳腱, 郭 睿(福建農林大學蜂學學院，福建 福州 350002)

脅迫中華蜜蜂幼蟲腸道的球囊菌及其體外培養(yǎng)的高表達基因分析

陳大福, 王鴻權, 李汶東, 熊翠玲, 鄭燕珍, 付中民, 徐細建, 黃枳腱, 郭 睿
(福建農林大學蜂學學院，福建 福州 350002)

利用RNA-seq技術對脅迫中華蜜蜂(簡稱中蜂)6日齡幼蟲腸道的球囊菌及其體外培養(yǎng)進行深度測序，根據基因的FPKM值篩選得到高表達基因(HEGs)，進而對HEGs進行GO及KEGG代謝通路(pathway)富集分析.Illumina測序數據經質控和過濾得到100814558條有效讀段(clean reads)，平均Q30均在93.81%以上.GO富集分析結果顯示處理組(AacT)的HEGs富集于39個GO term，基因富集數最多的是細胞(1872 unigene)、細胞組件(1872 unigene)和細胞進程(1748 unigenes)；對照組(AaCK)的HEGs富集于37個GO term，基因富集數最多的是細胞(785 unigenes)，其次是細胞組件 (785 unigenes)和代謝進程(776 unigenes).KEGG pathway富集分析顯示，AacT的HEGs富集在119個代謝通路上，基因富集數最多的是核糖體 (176 unigenes)、碳代謝(147 unigenes)及氨基酸的生物合成(134 unigenes)；AaCK的HEGs富集在110個代謝通路上，基因富集數最多的是核糖體(179 unigenes)、氨基酸的生物合成(70 unigenes)以及碳代謝(62 unigenes).深入分析發(fā)現，對于富集在MAPK信號通路上的高表達基因數量，脅迫中蜂幼蟲腸道的球囊菌遠多于體外培養(yǎng)的球囊菌，說明病原的該通路在脅迫后期被顯著激活.

中華蜜蜂; RNA-seq; 球囊菌; 高表達基因

Abstract: In this study,Ascosphaeraapisspores (AacT), from the gut of 6-day-oldApisceranaceranalarvae, andA.c.ceranawere sequenced utilizing RNA-seq technology. PureA.apisspore was used as the control (AaCK). A total of 100 814 558 clean reads with a mean Q30 of 93.81% were obtained after quality control and filtration. GO enrichment analysis suggested that the highly expressed genes (HEGs) in AacT were involved in 39 terms, which was mostly enriched in cell (1872 unigenes), followed by cellular component (1872 unigenes) and cellular process (1748 unigenes). And the HEGs in AaCK were engaged in 37 terms, with the largest group in cell (785 unigenes), followed by cellular component (785 unigenes) and metabolic process (776 unigenes). KEGG enrichment analysis showed that the HEGs in AacT were enriched in 119 pathways, dominating in ribosme (176 unigenes), followed by carbon metabolism (147 unigenes) and biosynthesis of amino acids (134 unigenes). While the HEGs in AaCK were involved in 119 pathways, and the largest groups were ribosome (179 unigenes), biosynthesis of amino acids (70 unigenes) and carbon metabolism (62 unigenes).

Keywords:Apisceranacerana; RNA-seq;Ascosphaeraapis; highly expressed genes

白堊病是蜜蜂幼蟲的致死性真菌病[1]，該病病原為蜜蜂球囊菌(Ascosphaeraapis).白堊病能導致蜜蜂群勢急劇下降，嚴重影響蜂產品的產量[2].據報道，該病可造成蜂蜜產量下降5%-37%[3].我國養(yǎng)蜂生產的常用蜂種是意大利蜜蜂(Apismelliferaligustica，簡稱意蜂)與中華蜜蜂(Apisceranacerana，簡稱中蜂).前者極易被球囊菌侵染而罹患白堊病，但后者幾乎不受白堊病的影響.通常認為中蜂較意蜂具有更強的群體防御能力[4]，如清理行為可將被球囊菌侵染的幼蟲及時清理出蜂群[5].

近20年來，國內外學者對球囊菌開展了大量研究，主要涉及培養(yǎng)方法[6-7]、形態(tài)學[8-9]、流行病學[10-11]、增殖方式[12-13]、病理學[14-15]、免疫防御[16-17]以及疾病防治[18-20]等方面.本課題組也在球囊菌的生理、病理和檢測方面開展了較多研究[21].基因組信息的缺失嚴重制約球囊菌的分子研究.直到2006年，Qin et al[22]測序公布了球囊菌ARSEF7406菌株的基因組序列信息，為在分子水平上研究球囊菌奠定了基礎，但作者當時并沒有公布球囊菌的基因位置和功能注釋信息，導致近10年來球囊菌的分子研究進展緩慢.Cornman等利用Roche 454焦磷酸測序技術對來自培養(yǎng)基的球囊菌菌絲和來自西方蜜蜂(Apismellifera)幼蟲感染組織的球囊菌菌絲進行了轉錄組測序，功能分析表明球囊菌的差異表達基因(DEGs)參與了球囊菌交配類型、細胞內信號轉導以及應激反應[23].

球囊菌侵染的相關研究多集中在西方蜜蜂幼蟲，有關球囊菌侵染東方蜜蜂幼蟲(Apiscerana)的研究報道極其有限.前期研究中，我們從中蜂白堊狀幼蟲尸體中分離培養(yǎng)出真菌病原，經形態(tài)學和分子生物學鑒定該病原即為球囊菌(未發(fā)表數據).目前，有關球囊菌對中蜂幼蟲的致病機理的研究未見報道.本研究利用RNA-seq技術對體外培養(yǎng)及脅迫中蜂6日齡幼蟲腸道的球囊菌進行轉錄組學分析，篩選得到對照組和處理組球囊菌的高表達基因(differentially expressed genes, HEGs)，進一步通過GO(Gene Ontology)及KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代謝通路(pathway)富集分析對HEGs進行深入挖掘，研究結果可為球囊菌致病的分子機理提供參考信息，也為白堊病的治療奠定初步基礎.

1 材料與方法

1.1 生物材料

本研究中使用的中蜂幼蟲取自福建農林大學蜂學學院教學蜂場，球囊菌菌株由福建農林大學蜂學學院蜜蜂保護學實驗室保存.

1.2 主要實驗試劑及儀器

DNaseI和Oligotex mRNA Kits Midi試劑盒購自德國Qiagen公司，Dynal M280磁珠購自Invitrogen公司，DNA ligase購自美國Thermo公司，RNA Reagent抽提試劑盒、Ex Taq polymerase及Superscript Ⅱ reverse transcriptase均購自日本TaKaRa公司.純化cDNA的Ampure beads為美國Agencourt產品，cDNA文庫構建試劑盒TruSeqTMDNA Sample Prep Kit-Set A為美國Illumina公司產品.其它試劑為國產分析純.

恒溫恒濕氣候箱購自中國寧波江南儀器廠，倒置顯微鏡為中國上海光學儀器五廠產品，超凈工作臺為中國蘇州安泰空氣技術有限公司產品，PCR儀為美國Bio Rad公司產品，凝膠成像系統(tǒng)為中國上海培清科技有限公司產品，超低溫冰箱為中科美菱低溫科技股份有限公司產品.

1.3 試驗方法

1.3.1 中蜂幼蟲的人工飼養(yǎng)及球囊菌孢子純化 中蜂幼蟲的飼料參照王倩等的配方[24]配制并進行改良.預試驗結果顯示中蜂幼蟲7日齡成活率達到70%以上.選擇20群健康蜂群(無白堊病癥狀且PCR檢測為陰性)作為供試蜜蜂.將2日齡幼蟲移入預置飼料的24孔細胞培養(yǎng)板(1只·孔-1)， 35 ℃，70% RH條件下培養(yǎng).每隔24 h更換飼料.3日齡幼蟲飼喂含球囊菌孢子的人工飼料(孢子終濃度為1×107孢子·mL-1) ，適宜條件飼養(yǎng)幼蟲至6日齡.本試驗設3個生物學重復.

1.3.2 測序樣品準備及Illumina測序 按照Jesen et al[25]的方法純化球囊菌孢子(AaCK)，純化孢子經液氮速凍后轉移至-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?同時，剖取6日幼蟲腸道(AacT)，立即投入液氮速凍，再轉移至-80 ℃保存?zhèn)溆?利用RNAiso Reagent試劑盒抽提上述3個球囊菌孢子樣品(AaCK-1、AaCK-2、AaCK-3)與3個幼蟲腸道樣品(AacT-1、AacT-2、AacT-3)的總RNA，然后用RNase-free DNaseI去除基因組DNA殘留.RNA的質量通過瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ND-1000(NanoDrop, Wilmington, DE, USA)進行檢測.cDNA文庫的構建參照張曌楠等[26]的方法進行.

委托廣州基迪奧生物科技有限公司對上述6個樣品進行深度測序，測序平臺為Illumina Hiseq 2500.測序數據已上傳NCBI SRA數據庫，SRA號：SRA454366.

1.3.3 基因表達豐度計算與高表達基因的分析 對于測序下機的原始讀段(raw reads)，去除含adapter、N比例大于10%及低質量的reads，得到有效讀段(clean reads)，利用Tophat軟件將clean reads比對至球囊菌的參考轉錄組[26]，表達量的計算使用FPKM(Fragments Per Kilobase of transcript per Million mapped reads)法，其計算公式為：FPKM=(106C×103)/NL.利用在線分析工具OmicsShare(http://www.omicshare.com/tools/index.php/Home/Index/index.html)對AaCK與AacT中FPKM值大于15的HEGs進行GO及KEGG代謝通路富集分析.

2 結果與分析

2.1 RNA-seq測序數據概述

本研究中，各樣品的RNA-seq得到的clean reads數均在4398766條以上，兩端Q20均在97.05%以上，兩端Q30均在92.55%以上(表1).將clean reads映射(mapping)核糖體數據庫和球囊菌參考轉錄組，各樣品mapping率均在87%以上.Pearson相關性分析結果顯示AaCK與AacT的組內各生物學重復之間的相關性均在0.8134以上(0.8134～0.9999)，說明樣本的重復性較好.進一步對AaCK與AacT進行主成分分析(PCA)，結果顯示第1主成分(PC1)與第2主成分(PC2)可分別解釋樣品基因表達總體方差的97.9%和1.5%，AaCK與AacT的基因表達模式差異明顯且各樣品的組內重復聚類良好.上述結果說明本研究中的轉錄組數據質量良好，可用于進一步分析.

表1 RNA-seq數據信息統(tǒng)計表Table 1 Summary of RNA-seq datasets

2.2 HEGs的GO富集分析

GO富集分析結果顯示，AaCK與AacT的HEGs均富集于3個大類，即生物學進程、細胞組分和分子功能.其中，AaCK的HEGs富集于37個GO term，基因富集數最多的是細胞(785 unigenes)、細胞組件(785 unigenes)和細胞進程(776 unigenes)；AacT的HEGs富集于39個GO term，基因富集數最多的是細胞(1872 unigenes)、細胞組件(1872 unigenes)和細胞進程(1748 unigenes).上述結果顯示，AacT的HEGs較之AaCK的多數GO term富集基因數均有較大幅度提高，說明脅迫后期的球囊菌的新陳代謝活躍、生命活動增強.

2.3 HEGs的KEGG代謝通路富集分析

KEGG代謝通路富集分析結果顯示，AaCK的HEGs富集在110個代謝通路，其中基因富集數最多的是核糖體(179 unigenes)，其次是氨基酸的生物合成(70 unigenes)和碳代謝(62 unigenes)(圖1A).AacT的HEGs富集在119個代謝通路，其中基因富集數最多的是核糖體(176 unigenes)，其次是碳代謝(147 unigenes)和氨基酸的生物合成(134 unigenes)(圖1B).

進一步分析結果顯示，AaCK與AacT中均有HEGs富集在MAPK信號通路(圖2)，但AacT中富集在此通路的HEGs數量(27 unigenes)遠多于AaCK(9 unigenes)，說明球囊菌的MAPK信號通路在脅迫后期被顯著激活.

2.4 HEGs的Venn分析

進一步對AaCK和AacT中的HEGs進行Venn分析，結果顯示 AaCK和AacT的共有HEGs為459個，二者的特有HEGs分別為1962和6185個.推測這些共有HEGs對球囊菌的生命活動至關重要，AacT特有HEGs在球囊菌脅迫后期發(fā)揮特殊作用.

A：AaCK中的HEGs；B：AacT中的HEGs.圖1 HEGs的KEGG pathway富集分析Fig.1 KEGG pathway enrichment analysis of HEGs

3 討論與結論

為對球囊菌進行深入的轉錄組學研究，本課題組前期已組裝并注釋球囊菌的參考轉錄組[23]，在此基礎上，本研究對脅迫中蜂6日齡幼蟲腸道的球囊菌及其體外培養(yǎng)進行測序，進而對不同狀態(tài)下的球囊菌進行HEGs分析.在Cornman et al[23]的研究中，測序對象是來自培養(yǎng)基的球囊菌菌絲和來自蜜蜂幼蟲感染組織的球囊菌菌絲，其中后者是感染幼蟲腸道內萌發(fā)的菌絲突破腸壁后繼續(xù)生長最后突破體表的菌絲，而此時的菌絲不再與宿主互作，菌絲的轉錄組變化無法真實反映球囊菌在侵染過程中的基因表達譜.本研究的測序對象是純培養(yǎng)的球囊菌和球囊菌脅迫的中蜂幼蟲腸道，前者尚未與宿主發(fā)生互作，而后者因處于中蜂幼蟲腸道內而與宿主發(fā)生復雜的互作，因此本研究中的轉錄組分析可更真實地反映球囊菌在侵染過程中的基因表達譜.此外，Cornman等人的研究是對人工培養(yǎng)的球囊菌菌絲和幼蟲感染組織的菌絲進行DEGs分析，因此，無法將他們的研究結果與本研究的結果直接對比.在球囊菌侵染中蜂幼蟲的后期，菌絲已大量生長并快速穿透腸壁，技術上無法將宿主和病原完全分離.因此，為得到純凈的球囊菌轉錄組數據，本研究采取的策略是對脅迫腸道進行測序，得到意蜂幼蟲腸道、腸道內球囊菌以及腸道內其它微生物的混合轉錄組數據，首先通過映射意蜂參考基因組去除宿主本身的轉錄組數據，再將球囊菌和腸道內微生物的混合數據映射前期組裝并注釋的球囊菌參考轉錄組，去除比對不上的數據，保留能夠比對上的數據，即為球囊菌本身的轉錄組數據.

本研究中，AacT中有60.74%的HEGs(2098 unigenes)富集在新陳代謝, 包括碳代謝(ko01200)、脂肪酸降解(ko00071)以及甘氨酸、絲氨酸及蘇氨酸代謝(ko00260)等107個物質代謝，還包括氧化磷酸化(ko00190)、氮代謝(ko00910)、硫代謝(ko00920)以及甲烷代謝(ko00680)等4個能量代謝通路.而對照組只有55.18%的HEGs(858 unigenes)富集在代謝進程中，表明球囊菌在脅迫中蜂幼蟲腸道的后期，通過提高自身的物質和能量代謝滿足增殖需求.真菌具有精細而保守的信號通路，可通過調節(jié)黑色素形成、配合、毒力以及形態(tài)發(fā)生等來感知外界環(huán)境并迅速做出應答[23].在真菌的信號通路中，MAPK信號通路至關重要，在真菌致病性及響應環(huán)境脅迫方面發(fā)揮關鍵作用[27].本研究發(fā)現，脅迫后期的球囊菌中有27個HEGs富集在MAPK信號通路，較球囊菌純化孢子有大幅提高，表明該通路在脅迫后期的球囊菌中非常活躍，說明MAPK信號通路在球囊菌侵染宿主的過程中可能發(fā)揮關鍵作用.下一步將人工合成siRNA對富集在此通路上的高表達基因進行RNAi，有望為白堊病的治療提供潛在靶標.

本研究只對脅迫中蜂6日齡幼蟲腸道的球囊菌及其體外培養(yǎng)進行HEGs分析，這是從基因表達量的角度分析球囊菌的基因表達譜，若要全面解析球囊菌致病的分子機理，則需要從基因相對變化倍數的角度進一步挖掘球囊菌在脅迫中蜂幼蟲腸道過程中的轉錄組信息，本課題組目前正在對脅迫中蜂幼蟲腸道的球囊菌進行DEGs分析，接下來將對球囊菌脅迫其它日齡的幼蟲腸道進行轉錄組測序，并通過趨勢分析或基因權重共表達分析(WGCNA)從全局水平進行深入研究.

本研究利用RNA-seq技術對脅迫中蜂幼蟲腸道的球囊菌及其體外培養(yǎng)進行深度測序，篩選并深入分析各樣品的HEGs，研究結果可為解析球囊菌致病的分子機理提供重要信息，為關鍵致病基因的功能驗證奠定基礎，有望為白堊病治療提供潛在分子靶標.

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(責任編輯:吳顯達)

AnalysisofhighlyexpressedgenesofAscosphaeraapisinfectingthegutofApisceranaceranalarvaeanditsinvitroculture

CHEN Dafu, WANG Hongquan, LI Wendong, XIONG Cuiling, ZHENG Yanzhen, FU Zhongmin, XU Xijian, HUANG Zhijian, GUO Rui
(College of Bee Science, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

S895.1

A

1671-5470(2017)05-0562-07

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.05.014

2017-03-14

2017-05-02

現代農業(yè)產業(yè)技術體系建設專項資金(CARS-44-KXJ7)；福建省中青年教師教育科研項目(JAT17018)；福建農林大學科技發(fā)展基金(KF2015123)；國家級大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目(201610389016).

陳大福(1973-),男,副教授,博士.研究方向:蜜蜂保護學.Email:dfchen826@fafu.edu.cn.通訊作者郭睿(1987-),男,講師,博士.研究方向:蜜蜂分子生物學.Email:ruiguo@fafu.edu.cn.