楊再興，梁艷，劉東紅，張治宇，仲人前

（1.臺州市第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 臺州 318020；2.上海長征醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)診斷科，上海 200003；3.上海長征醫(yī)院 貴賓科，上海 200003）

丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基通過活化Toll樣受體4影響單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子

楊再興1，梁艷2，劉東紅1，張治宇3，仲人前2

（1.臺州市第一人民醫(yī)院 檢驗(yàn)科，浙江 臺州 318020；2.上海長征醫(yī)院 實(shí)驗(yàn)診斷科，上海 200003；3.上海長征醫(yī)院 貴賓科，上海 200003）

目的：探討丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基（PDC-E2）是否可以活化Toll樣受體4（TLR4）-NF-κB通路，并通過該通路誘導(dǎo)單核細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白介素12（IL-12）和可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（sTRAIL）。方法：培養(yǎng)單核細(xì)胞株U937，分為空白對照組、PDC-E2組、PDC-E2+HTA125組和PDCE2+PDTC組?？瞻讓φ战M不予任何刺激；PDC-E2組予2、10和50 μg/mL的PDC-E2刺激；PDC-E2+HTA125組予10 μg/mL的TLR4功能抑制抗體HTA125孵育4 h后，再加入50 μg/mL的PDC-E2；PDC-E2+PDTC組加入100 nmol/mL的NF-κB抑制劑PDTC 0.5 h后，再加入50 μg/mL的PDC-E2。通過流式細(xì)胞術(shù)檢測TLR4表達(dá)，EMSA實(shí)驗(yàn)檢測NF-κB活化情況，ELISA法檢測培養(yǎng)上清TNF-α、IL-12和sTRAIL濃度。結(jié)果：2、10和50 μg/mL濃度PDC-E2刺激U937細(xì)胞24 h，TLR4表達(dá)均明顯增加，但無濃度依賴性。濃度為50 μg/mL的PDC-E2刺激U937細(xì)胞1 h，NF-κB即顯著活化；至2 h，活化逐漸減少；至4 h，已明顯減少。加入HTA125后，NF-κB活性較阻斷前顯著降低。濃度為50 μg/mL的PDC-E2刺激U937細(xì)胞24 h，培養(yǎng)上清TNF-α和sTRAIL的濃度顯著高于空白對照組（P＜0.05），IL-12與空白對照組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義；至48 h和72 h，TNF-α、IL-12和sTRAIL的濃度均顯著高于空白對照組（P＜0.05）。加入HTA125或PDTC后，各時間點(diǎn)3種細(xì)胞因子的濃度均較阻斷前顯著降低（P＜0.05）。結(jié)論：PDC-E2可以活化TLR4-NF-κB通路，并通過該通路刺激單核細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α、IL-12和sTRAIL。

丙酮酸脫氫酶復(fù)合體；Toll樣受體4；核因子；細(xì)胞因子；原發(fā)性膽汁性膽管炎

Abstract: Objective:To explore whether pyruvate dehydrogenase complex E2 subunit (PDC-E2) may activate Toll-like receptor 4 (TLR4)-NF-κB pathway and induce secretion of tumor necrosis factor-α (TNF-α),interleukin-12 (IL-12) and TNF-related apoptosis-inducing ligand (sTRAIL).Methods:PDC-E2 was used to stimulate monocyte line U937, combined with HTA125 (an inhibitory antibody of TLR4) and PDTC (an inhibitor of NF-κB). The study groups included control group, PDC-E2 group, PDC-E2+HTA125 group and PDCE2+PDTC group. TLR4 on U937 was detected by flow cytometry, activity of NF-κB was determined by EMSA,TNF-α, IL-12 and sTRAIL were measured by ELISA.Results:At 24 h after stimulation by 2, 10 and 50 μg/mL of PDC-E2, TLR4 expression on U937 cell was significantly increased. At 1 h after stimulation by 50 μg/mL of PDC-E2, NF-κB was markedly activated, while at 2 h, the activation of NF-κB was gradually decreased and at 4 h, the decrease was very significant. NF-κB activity was significantly decreased after HTA125 addition compared with that before. At 24 h after stimulation by 50 μg/mL of PDC-E2, supernant TNF-α and sTRAIL levels were significantly higher than that of control, while IL-12 level was of no significant difference. At 24 h and 48 h, the levels of TNF-α, IL-12 and sTRAIL were all significantly higher than that of control. The three cytokines were significantly lower after addition of HTA125 or PDTC than before.Conclusion:PDC-E2 can activate TLR4-NF-κB pathway, by which PDC-E2 stimulates the secretion of TNF-α, IL-12 and sTRAIL by monocyte.

Key words:pyruvate dehydrogenase complex; Toll-like receptor 4; nuclear factor; cytokine; primary biliary cholangitis

原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis，PBC）是一種以肝內(nèi)門管區(qū)中小膽管炎癥性損傷為主要表現(xiàn)的慢性自身免疫性肝病，其病因和發(fā)病機(jī)制未明。該疾病的特征性標(biāo)志是血清抗線粒體抗體陽性，該抗體的靶抗原主要是丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基（pyruvate dehydrogenase complex E2 subunit，PDC-E2）。研究發(fā)現(xiàn)，PDC-E2抗原特異性T淋巴細(xì)胞可能在PBC的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[1]。PDC-E2抗原通過抗原遞呈細(xì)胞如樹突狀細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞等遞呈給T細(xì)胞，引起后者活化，而發(fā)揮作用。研究證實(shí)，在PBC的肝組織門管區(qū)存在大量單核巨噬細(xì)胞的浸潤[2-4]，但PDC-E2對單核巨噬細(xì)胞本身有何生物學(xué)作用目前尚不明確。因此，本研究探討PDC-E2對單核細(xì)胞Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）的表達(dá)，轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化，TNF-α、IL-12、可溶性腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（soluble tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand，sTRAIL）分泌的影響，以及TLR4通路及NF-κB對PDC-E2上述生物學(xué)功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料和方法

1.1 主要試劑 PE-Cy5標(biāo)記鼠抗人TLR4單抗和抗TLR4功能阻斷性單抗HTA125（eBioscience，美國）；NF-κB抑制劑吡咯烷二硫氨基甲酸（pyrrolidine dithiocarbamate，PDTC）（Sigma，美國）；TNF-α和IL-12 ELISA檢測試劑盒（Bender，美國）；sTRAIL ELISA檢測試劑盒（Diaclone，法國）；NF-κB活性檢測試劑盒（Active Motif，美國）；胎牛血清、RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco，美國）；75 mL細(xì)胞培養(yǎng)瓶、6或24孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Corning，美國）；細(xì)胞核蛋白抽提試劑盒（Pierce，美國）；電泳遷移率阻滯試驗(yàn)（electrophoretic mobility shift assay，EMSA）探針標(biāo)記試劑盒（Roche，德國）。PDC-E2為上海富純中南生物技術(shù)公司（現(xiàn)更名為上海科新生物技術(shù)股份有限公司）惠贈，并且已應(yīng)用ThermoSCIENTIFIC Pierce公司的Detoxi-GelTM Endotoxin Removing Gel去除了其中的內(nèi)毒素（含量低于10 pg/mL）；U937細(xì)胞為上海長征醫(yī)院耿紅蓮博士惠贈。

1.2 主要儀器 流式細(xì)胞儀（美國Beckman Coulter公司）；KUBOTA 5420臺式高速離心機(jī)（日本Kubota公司）；550型酶聯(lián)免疫檢測儀和水平電泳儀（美國Bio-Rad公司）；721型紫外分光光度儀（美國Beckman Coulter公司）。

1.3 方法

1.3.1 U937細(xì)胞培養(yǎng)及PDC-E2刺激：U937細(xì)胞株培養(yǎng)在含10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 IU/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液中，置于37 ℃、5%的CO2孵箱中培養(yǎng)傳代。選取第3代細(xì)胞，以每孔5×105的濃度，接種至24孔板，待細(xì)胞同步化后，進(jìn)行下述實(shí)驗(yàn)：①分別加入2、10和50 μg/mL的PDC-E2，相同條件設(shè)3復(fù)孔，并以培養(yǎng)基為對照。24 h后，收集細(xì)胞，檢測細(xì)胞TLR4的表達(dá)。②加入10 μg/mL的HTA125，孵育4 h后，再加入50 μg/mL的PDC-E2，分別于24、48和72 h后收集培養(yǎng)上清用于細(xì)胞因子濃度檢測。③加入10 μg/mL的HTA125，孵育4 h后，再加入50 μg/mL的PDC-E2，分別于1、2和4 h后，收集細(xì)胞，抽提核蛋白，EMSA法檢測NF-κB活性。④加入100 nmol/mL的PDTC，0.5 h后，加入50 μg/mL的PDC-E2，分別于24、48和72 h后收集培養(yǎng)上清用于細(xì)胞因子濃度檢測。

1.3.2 TLR4表達(dá)檢測：以PE-Cy5標(biāo)記鼠抗人TLR4單抗，采用流式細(xì)胞儀檢測U937細(xì)胞TLR4表達(dá)水平。操作按流式細(xì)胞儀檢測流程進(jìn)行。

1.3.3 NF-κB活性檢測：抽提核蛋白，EMSA法檢測核蛋白NF-κB活性，操作按試劑盒說明進(jìn)行，其中標(biāo)記的探針序列如下：正義序列5’-AGTTGAGGGGACT TTCCCAGGC-3’，反義序列5’-GCCTGGGAAAGTCCCCTCA ACT-3’，以地高辛標(biāo)記。

1.3.4 細(xì)胞因子濃度檢測：采用ELISA法檢測細(xì)胞因子TNF-α、IL-12和sTRAIL的濃度，操作按試劑盒說明進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理方法 所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0進(jìn)行統(tǒng)計。計量資料以 ±s表示，多組間比較采用兩因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PDC-E2對U937細(xì)胞TLR4表達(dá)的調(diào)節(jié)作用 單核細(xì)胞系U937細(xì)胞在無任何刺激的情況下即表達(dá)TLR4，其陽性表達(dá)率為33.99%±0.33%。濃度為2 μg/mL的PDC-E2刺激24 h，TLR4陽性表達(dá)率有顯著增高（為44.89%±3.43%）（P＜0.05），PDC-E2濃度增加至10 μg/mL和50 μg/mL時，TLR4陽性表達(dá)率分別為44.28%±0.43%和46.24%±1.65%，與2 μg/mL刺激相比無明顯增加（P＞0.05），見圖1。對熒光強(qiáng)度進(jìn)行分析顯示，在無任何刺激的情況下，TLR4平均熒光強(qiáng)度為1.61±0.05，濃度為2、10、50 μg/mL的PDC-E2刺激24 h后，TLR4平均熒光強(qiáng)度分別為1.74±0.01、1.77±0.02和1.85±0.10，均較刺激前明顯增加，但3種濃度之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義（F=2.491，P＞0.05）。

圖1 不同濃度PDC-E2對U937細(xì)胞TLR4陽性表達(dá)的影響

2.2 HTA125阻斷TLR4活性對NF-κB活性的影響

EMSA檢測結(jié)果顯示，在無任何刺激情況下，U937細(xì)胞核內(nèi)未檢測到具有結(jié)合DNA活性的NF-κB；濃度為50 μg/mL的PDC-E2刺激U937細(xì)胞1 h，細(xì)胞核內(nèi)具有結(jié)合DNA活性的NF-κB即顯著增加；至2 h，又逐漸減少；至4 h，已明顯減少。應(yīng)用HTA125抑制TLR4功能后，再以濃度為50 μg/mL的PDC-E2刺激U937細(xì)胞1、2和4 h，細(xì)胞核內(nèi)具有結(jié)合DNA活性的NF-κB較阻斷前顯著減少，尤其是刺激4 h時，細(xì)胞核內(nèi)已基本檢測不出具有結(jié)合DNA活性的NF-κB。見圖2。

圖2 EMSA法檢測不同時間點(diǎn)不同干預(yù)措施下細(xì)胞核內(nèi)NF-κB結(jié)合DNA活性

2.3 應(yīng)用HTA125抑制TLR4功能或PDTC抑制NF-κB活性前后，PDC-E2對U937細(xì)胞分泌細(xì)胞因子TNF-α、IL-12和sTRAIL的調(diào)節(jié)作用 濃度為50 μg/mL的PDC-E2刺激U937細(xì)胞24 h，培養(yǎng)上清中TNF-α和sTRAIL的濃度顯著高于空白對照組（P＜0.05），IL-12與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；至48 h，TNF-α、IL-12和sTRAIL的濃度均較24 h和空白對照組顯著增加（P＜0.05）；至72 h，TNF-α和sTRAIL濃度與48 h時無顯著變化（P＞0.05），IL-12濃度較48 h顯著增加（P＜0.05），TNF-α、IL-12和sTRAIL較空白對照組顯著增加（P＜0.05）。

應(yīng)用HTA125抑制TLR4功能后，各時間點(diǎn)3種細(xì)胞因子的濃度均較阻斷前顯著降低（P＜0.05）。與此相似，應(yīng)用PDTC抑制NF-κB活性后，各時間點(diǎn)3種細(xì)胞因子的濃度均較阻斷前顯著降低（P＜0.05）。見表1。

表1 各組細(xì)胞不同時間點(diǎn)培養(yǎng)上清TNF-α、IL-12和sTRAIL的濃度（n=3， ±s，pg/mL）

3 討論

研究證實(shí)，在PBC的單核巨噬細(xì)胞中，TLR4存在過表達(dá)和過度活化現(xiàn)象[5-7]，但原因不明。本研究發(fā)現(xiàn)，作為PBC特異性自身抗原，PDC-E2可以上調(diào)U937細(xì)胞TLR4的表達(dá)。U937細(xì)胞是一種具有單核細(xì)胞性質(zhì)的白血病腫瘤細(xì)胞株，已作為單核/巨噬細(xì)胞模型，廣泛應(yīng)用于各種體外研究[8-10]。本研究亦采用U937細(xì)胞作為單核/巨噬細(xì)胞模型。因此，我們有理由推測，PDC-E2可能是PBC單核巨噬細(xì)胞TLR4過表達(dá)和過度活化的一個重要原因。

本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，PDC-E2刺激U937細(xì)胞后，除了可以明顯上調(diào)TLR4的表達(dá)外，還可以誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化，促進(jìn)細(xì)胞因子TNF-α、IL-12和sTRAIL的分泌。而應(yīng)用HTA125以后，NF-κB活化，TNF-α、IL-12和sTRAIL分泌受到明顯抑制，應(yīng)用PDTC以后，TNF-α、IL-12和sTRAIL分泌亦受到明顯抑制。有研究證實(shí)，HTA125具有抑制TLR表達(dá)的作用，PDTC則是NF-κB的抑制劑[11-12]。本研究結(jié)果表明，PDC-E2對單核巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-12和sTRAIL的調(diào)節(jié)作用可能主要是通過活化TLR4通路，并依賴于NF-κB。當(dāng)然，TLR4通路比較復(fù)雜，包括MyD88依賴和非依賴，其下游又涉及NF-κB、MAPK、干擾素調(diào)節(jié)因子等多個信號蛋白或轉(zhuǎn)錄因子[13]，本結(jié)果無法證明究竟是哪一條通路發(fā)揮的主要作用，只能初步提示PDC-E2對單核細(xì)胞的上述作用可能部分是由NF-κB介導(dǎo)的，對這一結(jié)果的解釋需要謹(jǐn)慎對待。已有研究表明，這3種細(xì)胞因子在PBC患者外周血或肝門管區(qū)均顯著增加[14-17]。TNF-α和sTRAIL可以直接誘導(dǎo)膽管細(xì)胞凋亡[18]，IL-12可以調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的活性和功能，有助于特異性殺傷膽管上皮細(xì)胞，IL-12刺激活化的信號通路已被證實(shí)對PBC發(fā)病起重要作用[19]。

綜上所述，PDC-E2不僅可以作為一種自身抗原，指引抗原特異性T細(xì)胞殺傷肝內(nèi)膽管上皮細(xì)胞，造成PBC的炎癥損傷，還可以部分活化TLR4通路，刺激單核巨噬細(xì)胞分泌對PBC發(fā)病具有重要作用的細(xì)胞因子TNF-α、IL-12和sTRAIL，且NF-κB在其中可能發(fā)揮一定的作用。由于技術(shù)的局限性，本研究無法證實(shí)PDC-E2是否可以作為TLR4的一個內(nèi)源性配體與TLR4直接結(jié)合發(fā)揮作用，但正反兩方面功能驗(yàn)證均證實(shí)PDC-E2是可以活化TLR4通路的。

[1] HIRSCHFIELD G M, GERSHWIN M E. The immunobiology and pathophysiology of primary biliary cirrhosis[J]. Annu Rev Pathol, 2013, 8: 303-330.

[2] SASAKI M, KAKUDA Y, MIYAKOSHI M, et al. Infiltration of inflammatory cells expressing mitochondrial proteins around bile ducts and in biliary epithelial layer may be involved in the pathogenesis in primary biliary cirrhosis[J]. J Clin Pathol, 2014, 67(6): 470-476.

[3] LEICESTER K L, OLYNYK J K, BRUNT E M, et al. Differential findings for CD14-positive hepatic monocytes/macrophages in primary biliary cirrhosis, chronic hepatitis C and nonalcoholic steatohepatitis[J]. Liver Int, 2006, 26(5): 559-565.

[4] TSUNEYAMA K, HARADA K, KONO N, et al. Scavenger cells with gram-positive bacterial lipoteichoic acid infiltrate around the damaged interlobular bile ducts of primary biliary cirrhosis[J]. J Hepatol, 2001, 35(2): 156-163.

[5] WANG A P, MIGITA K, ITO M, et al. Hepatic expression of toll-like receptor 4 in primary biliary cirrhosis[J]. J Autoimmun, 2005, 25(1): 85-91.

[6] MAO T K, LIAN Z X, SELMI C, et al. Altered monocyte responses to defined TLR ligands in patients with primary biliary cirrhosis[J]. Hepatology, 2005, 42(4): 802-808.

[7] ZHAO J, ZHAO S, ZHOU G, et al. Altered biliary epithelial cell and monocyte responses to lipopolysaccharide as a TLR ligand in patients with primary biliary cirrhosis[J]. Scand J Gastroenterol, 2011, 46(4): 485-494.

[8] ZHANG Z, SMITH C, LI W, et al. Characterization of nitric oxide modulatory activities of alkaline-extracted and enzymatic-modified arabinoxylans from corn bran in cultured human monocytes[J]. Agric Food Chem, 2016, 64(43): 8128-8137.

[9] DING J, GUO C, HU P, et al. CSF1 is involved in breast cancer progression through inducing monocyte differentiation and homing[J]. Int J Oncol, 2016, 49(5): 2064-2074.

[10] TSENG H H, VONG C T, KWAN Y W, et al. TRPM2 regulates TXNIP-mediated NLRP3 inflammasome activation via interaction with p47 phox under high glucose in human monocytic cells[J]. Sci Rep, 2016, 6: 35016.

[11] WANG R, STEPHENS J, LACY M J. Characterization of monoclonal antibody HTA125 with specificity for human TLR4[J]. Hybrid Hybridomics, 2003, 22(6): 357-365.

[12] BOYD J H, MATHUR S, WANG Y, et al. Toll-like receptor stimulation in cardiomyoctes decreases contractility and initiates an NF-kappaB dependent inflammatory response[J].Cardiovasc Res, 2006, 72(3): 384-393.

[13] 余國慶, 陳曉明. 多糖免疫受體研究進(jìn)展[J]. 溫州醫(yī)學(xué)院學(xué)報, 2 0 1 2, 4 2(4): 3 9 6-4 0 1.

[14] FLOREANI A, INFANTOLINO D, BIASIN R, et al. Tumour necrosis factor alpha and cellular proliferation in primary biliary cirrhosis[J]. Ital J Gastroenterol Hepatol, 1999, 31(1):56-60.

[15] 閆惠平, 莊輝, 劉燕敏, 等. 原發(fā)性膽汁性肝硬化患者的免疫學(xué)特點(diǎn)分析[J]. 中華肝臟病雜志, 2 0 1 5, 1 3(1): 1 2-1 6.

[16] YANG C Y, MA X, TSUNEYAMA K, et al. IL-12/Th1 and IL-23/Th17 biliary microenvironment in primary biliary cirrhosis: implications for therapy[J]. Hepatology, 2014, 59(5):1944-1953.

[17] LIANG Y, YANG Z, LI C, et al. Characterisation of TNF-related apoptosis-inducing ligand in peripheral blood in patients with primary biliary cirrhosis[J]. Clin Exp Med, 2008,8(1): 1-7.

[18] HARADA K, NAKANUMA Y. Biliary innate immunity:function and modulation[J]. Mediators Inflamm, 2010, 2010(1): 60-68.

[19] ARNDTZ K, HIRSCHFIELD G M. The pathogenesis of autoimmune liver disease[J]. Dig Dis, 2016, 34(4): 327-333.

（本文編輯：丁敏嬌）

Biological effect of pyruvate dehydrogenase complex E2 subunit on monocyte U937 by activating Toll-like receptor 4-NF-κB pathway

YANG Zaixing1, LIANG Yan2, LIU Donghong1, ZHANG Zhiyu3, ZHONG Renqian2.1.Department of Laboratory Medicine, Taizhou First People’s Hospital, Taizhou, 318020; 2.Department of Laboratory Diagnostics, Shanghai Changzheng Hospital, Shanghai, 200003; 3.Department of VIP, Shanghai Changzheng Hospital, Shanghai, 200003

R392.32

A

10.3969/j.issn.2095-9400.2017.09.003

2016-11-23

國家自然科學(xué)基金面上項目（81671594，81571591）。

楊再興（1978-），男，遼寧錦州人，研究員，博士。