王昱

(隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅成縣742500)

油橄欖葉提取物對大鼠酒精性脂肪肝的保護(hù)作用

王昱

(隴南師范高等?？茖W(xué)校農(nóng)林技術(shù)學(xué)院，隴南特色農(nóng)業(yè)生物資源研究開發(fā)中心，甘肅成縣742500)

目的觀察油橄欖葉提取物(OLE)對酒精性肝損傷的保護(hù)作用及機制。方法用遞增法灌胃乙醇24周建立大鼠肝損傷模型，造模同時用OLE(250 mg·kg-1、500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1)進(jìn)行灌胃治療。利用生物顯微技術(shù)觀察肝臟組織結(jié)構(gòu)的變化，檢測血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)、甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)水平，用放射免疫法檢測肝臟腫瘤壞死因子α(TNF-α)、白細(xì)胞介素1(IL-1β)的含量，用比色法檢測肝臟超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)活性及丙二醛(MDA)含量，用免疫組織化學(xué)法檢測固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(SREBP-1c)的表達(dá)情況。結(jié)果與模型組比較，OLE治療后，血清ALT、AST、TG、TC水平降低；肝臟TNF-α、IL-1β、MDA含量及SREBP-1c表達(dá)呈降低趨勢；SOD、CAT、GR水平均顯著升高；肝臟損傷程度明顯減輕。結(jié)論OLE對酒精性肝損傷有一定的保護(hù)作用，可能與其減少自由基損傷、減輕炎癥反應(yīng)、抑制SREBP-1c表達(dá)有關(guān)。

油橄欖葉提取物； 酒精； 炎癥因子； 固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c； 抗氧化能力

Abstract：ObjectiveExplore the protective role of olive leaf extract (OLE) on alcohol hepatic injury.MethodsA hepatic injury model of rat was established by using edible alcohol with increasing dosages for 24 weeks. And then the rats were given OLE at the doses of 250 mg·kg-1， 500 mg·kg-1or 1 000 mg·kg-1by intragastric administration. The changes of liver histological structure were observed by bio-microscopy. The levels of alanine aminotransferase (ALT)， aspartate aminotransferase (AST)， triglyceride (TG)， and total cholesterol (TC) in serum were tested. The contents of tumor necrosis factor-α (TNF-α) and interleukin-1β (IL-1β) were detected by radioimmunoassay and the activities of superoxide dismutase (SOD)， catalase (CAT)， glutathione reductase (GR) and malondialdehyde (MDA) content in liver were determined by spectrophotometry， and the expression of sterol regulatory element-binding protein 1c (SREBP-1c) in liver were analyzed by immunohistochemistry.ResultsCompared with the model group， the treatments of OLE could significantly decrease the levels of TG， TC， ALT， AST， TNF-α， IL-1β， MDA and SREBP-1c expression， while the activities of SOD， CAT and GR were significantly increased. Furthermore， the liver injury was alleviated along with the treatment of OLE.ConclusionOLE has a protective effect on alcohol hepatic injury， and this may be due to the reduced free radical lesion， relieved inflammatory response and inhibited SREBP-1c expression.

Keywords： olive leaf extract； alcohol； inflammatory factors； SREBP-1c； antioxidant capacity

脂肪變性是酒精性肝病最早和最常出現(xiàn)的損傷形式，長期酗酒者約90%以上可發(fā)展成脂肪肝，若不加重視，可在短期內(nèi)發(fā)展為不可逆的肝損傷。研究表明，發(fā)生酒精性脂肪肝后，肝細(xì)胞腫大壓迫肝血竇造成竇間隙變窄，使肝細(xì)胞缺氧，長時間就會導(dǎo)致肝細(xì)胞變性和壞死，并促進(jìn)肝纖維化的發(fā)生(祁瑞瑞，2012)。然而，由于酒精性脂肪肝的發(fā)病機制尚未完全明確，目前針對酒精性脂肪肝仍缺少有效的靶向治療方法。

油橄欖葉提取物(olive leaf extract，OLE)是從油橄欖葉中提取，主要成分為黃酮類和萜類內(nèi)酯化合物，有降血糖、抗高血壓及抗微生物作用，還有促進(jìn)骨骼鈣化、防治骨質(zhì)疏松、預(yù)防鈣質(zhì)流失等作用(Goulasetal.，2010；Kontogianni & Gerothanassis，2012；Turkezetal.，2012；王昱，2014)。近年來，藥理研究發(fā)現(xiàn)其具有很好的抗氧化、降血脂、排鉛等作用(Esmaeili-Mahanietal.，2010；Kaeidietal.，2011；王昱，2013；Wangetal.，2013)。然而，油橄欖葉提取物抑制酒精性肝損傷的作用尚未有報道。因此，本研究擬以乙醇誘導(dǎo)大鼠建立肝損傷模型，從抗氧化能力、炎癥反應(yīng)、脂代謝調(diào)控因子變化等方面，探討油橄欖葉提取物對酒精性肝損傷大鼠的保護(hù)作用及作用機制。

1 材料與方法

1.1材料

OLE由隴南田園油橄欖科技開發(fā)有限公司提供；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化氫酶(catalase，CAT)、谷胱甘肽還原酶(glutathione reductase，GR)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)試劑盒(南京建成生物工程研究所)；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白細(xì)胞介素1(interleukin-1β，IL-1β)試劑盒(武漢博士德生物工程研究所)。U-1800型UV-VIS全自動分光光度計(日本Tokyo)，SpectraMax M5型酶標(biāo)儀(Molecular Devices，美國)，BS-300型全自動生化分析儀(深圳邁瑞)；FX-35WA型Olympus顯微鏡(Japan)；TGL-16M型高速臺式冷凍離心機(Beckman美國)；兔抗鼠固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白-1c(sterol regulatory element-binding protein 1c，SREBP-1c)多克隆抗體、免疫組織化學(xué)試劑盒和DAB(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；50只健康雄性SD大鼠，SPF級，購于蘭州大學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK(甘)2005-0007，體質(zhì)量200～250 g。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立與給藥50只大鼠隨機分為5組，即正常組、模型組、OLE低劑量組(Ⅰ組)、OLE中劑量組(Ⅱ組)和OLE高劑量組(Ⅲ組)，每組10只。參照文獻(xiàn)(趙趕等，2015)，除正常組外，其他各組采用劑量遞增法灌胃乙醇：1～4周5.0 g·kg-1，5～8周7.0 g·kg-1，9～12周9.0 g·kg-1，13～24周9.5 g·kg-1，每日1次。造模同時，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組分別灌胃250 mg·kg-1、500 mg·kg-1、1 000 mg·kg-1OLE，每日1次，連續(xù)24周。

1.2.2血生化指標(biāo)測定各組大鼠均乙醚麻醉，摘眼球采血，以3 000 r·min-1離心10 min，分離血清，用全自動生化分析儀測定谷丙轉(zhuǎn)氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(aspartate aminotransferase，AST)水平，用甘油三酯試劑盒提供的磷酸甘油氧化酶-PAP酶法測定甘油三酯(triglyceride， TG)活性，用總膽固醇試劑盒提供的膽固醇氧化酶-PAP酶法測定總膽固醇(total cholesterol， TC)活性。

1.2.3酶活性測定末次給藥后，取大鼠肝臟，用預(yù)冷的生理鹽水洗凈血液，濾紙吸干，精確稱量、勻漿、3 000 r·min-1離心10 min，按試劑盒的操作要求測定肝臟SOD、CAT、GR的活性及MDA含量。

1.2.4炎癥因子檢測末次給藥后，迅速取肝，洗凈、冰浴勻漿，3 000 r·min-1離心15 min，取上清液，采用放射免疫法中的液相競爭法和平衡法測定肝組織TNF-α、IL-1β含量，按照檢測試劑盒說明書操作。

1.2.5免疫組織化學(xué)免疫組化SP法(鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)法)。末次給藥后，取大鼠肝臟數(shù)塊置于4%多聚甲醛固定，經(jīng)脫水、石蠟包埋后冠狀位切片，厚6 μm。脫蠟、抗原修復(fù)后，用3%H2O2室溫孵育10 min，正常兔血清室溫封閉30 min，然后用兔抗鼠SREBP-1c多克隆抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜；次日取出切片以PBS沖洗后，再依次滴加生物素化羊抗兔IgG孵育30 min，SABC工作液孵育30 min，最后DAB顯色，蘇木素復(fù)染，空白對照以PBS代替一抗。常規(guī)乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.6組織學(xué)觀察在肝左葉同部位取小塊肝組織，用預(yù)冷的生理鹽水沖洗干凈，迅速投入15%的中性福爾馬林溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片(6 μm)，蘇木精-伊紅染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1OLE對大鼠血清ALT、AST、TG、TC水平的影響

與正常組相比，模型組大鼠血清ALT、AST、TG、TC水平升高(P<0.05，P<0.01)，而OLE治療后，大鼠血清ALT、AST、TG、TC水平明顯降低(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴性，即OLE濃度越高，抑制作用越明顯(圖1)。

圖1 OLE 對大鼠血清ALT、AST、TG、TC水平的影響Fig. 1 Effect of OLE on the levels of ALT， AST， TG and TC in the serum of rats

模型組與正常組比較comparison between the model group and control group， a.P<0.05， b.P<0.01； 治療組與模型組比較comparison between the OLE treated groups and model group， c.P<0.05， d.P<0.01； 下同， the same below.

2.2OLE對大鼠肝TNF-α、IL-1β含量的影響

與正常組相比，模型組大鼠肝TNF-α、IL-1β含量顯著升高(P<0.05)，而OLE治療后大鼠肝TNF-α、IL-1β含量極顯著降低(P<0.01)，且呈劑量依賴性(圖2)。

圖2 OLE對大鼠肝TNF-α、IL-1β含量的影響Fig. 2 Effect of OLE on the contents of liver TNF-α and IL-1β in rats

2.3OLE對大鼠肝組織抗氧化指標(biāo)的影響

與正常組相比，模型組大鼠肝組織SOD、CAT、GR活性顯著降低(P<0.01)，MDA含量極顯著增高(P<0.01)，而OLE治療后肝組織SOD、CAT、GR活性顯著升高(P<0.05，P<0.01)，MDA含量顯著降低(P<0.05，P<0.01)，且呈劑量依賴性(圖3)。

2.4OLE對大鼠肝臟SREBP-1c表達(dá)的影響

圖3 OLE對大鼠肝組織SOD、CAT、GR活性及MDA含量的影響Fig. 3 Effect of OLE on the liver SOD， CAT， GR activities and MDA content in rats

圖4 SREBP-1c在大鼠肝臟的表達(dá)Fig. 4 SREBP-1c expression in rats liver

A.正常組， B. 模型組， C. Ⅰ組， D. Ⅱ組， E. Ⅲ組， F. 陰性對照。

A. control group， B. model group， C. group Ⅰ， D. group Ⅱ， E. group Ⅲ， F. negative comparison.

圖5 各組大鼠肝臟SREBP-1c表達(dá)的比較Fig. 5 Comparison of SREBP-1c expression in rats liver among the groups

2.5OLE對大鼠肝臟組織結(jié)構(gòu)的影響

正常組大鼠肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)正常，無脂質(zhì)空泡。模型組大鼠肝組織中出現(xiàn)彌漫性的脂質(zhì)空泡，肝細(xì)胞腫大、排列紊亂，胞漿內(nèi)擠滿了小脂泡，肝小葉不清。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ治療組大鼠肝組織脂變情況均有一定程度的減輕，且呈明顯的劑量依賴性(圖6)。

3 討論

酒精性肝損傷是由于長期過度飲酒，使肝細(xì)胞反復(fù)發(fā)生脂肪變性、壞死和再生所引起的一種疾病(趙趕等，2015)，具有可逆性，這為臨床及時治療提供了重要依據(jù)。關(guān)于酒精性肝損傷的發(fā)病機制，近年來的研究表明，細(xì)胞因子、自由基損害等在酒精性肝損傷發(fā)病機制中起重要作用。目前，在治療方面以戒酒、營養(yǎng)支持為主，其他試用藥物均不理想，且大多有副作用，故本研究采用OLE來探討其對酒精性肝損傷的保護(hù)作用。

脂肪肝最主要的特征是肝細(xì)胞脂肪沉積，肝脂含量是觀察脂肪性肝病發(fā)展的一個重要指標(biāo)，而臨床上脂肪肝患者的血脂異常主要表現(xiàn)為TG、TC水平的升高(Tannapfel & Flott-Rahmel，2011)。長期飲酒會導(dǎo)致肝細(xì)胞發(fā)生損傷，肝細(xì)胞膜通透性增加及線粒體損傷，大量的血清標(biāo)志物酶ALT和AST釋放入血，致使血中ALT和AST水平升高(呂元，2004；彭文鋒，鐘政永，2011)。研究表明，正常肝內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶含量約為血中的100倍，1%的肝特異性細(xì)胞壞死即可使血清酶活性增加1倍(Strangesetal.，2004)。因此，轉(zhuǎn)氨酶是肝細(xì)胞受損的敏感標(biāo)志，對血清酶的檢測有助于判斷脂肪肝是否已并發(fā)脂肪性肝炎(中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會脂肪肝和酒精性肝病學(xué)組，2010)。SOD廣泛存在于機體細(xì)胞中，可以使自由基經(jīng)過歧化而被清除，使機體免受自由基的損傷。CAT存在于紅細(xì)胞及某些組織細(xì)胞的微體中，催化H2O2轉(zhuǎn)化為H2O和O2，H2O2不能在膜外與Fe2+或Cu2+反應(yīng)生成OH-自由基，使其失去活性氧的作用，保護(hù)機體。GR的作用是將氧化型的谷胱甘肽還原成還原型的谷胱甘肽，參與自由基和脂類過氧化物損傷的防護(hù)。MDA是超氧化物陰離子自由基作用于生物膜磷脂結(jié)構(gòu)不飽和脂肪酸所形成的終產(chǎn)物之一，機體組織MDA含量可間接反映機體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度(Rumpetal.，2010；Nassir & Ibdah，2014)。酒精等異物打破肝臟氧化與抗氧化平衡，引起氧化應(yīng)激反應(yīng)，促使肝細(xì)胞中的氧化劑耗盡或失活，最終導(dǎo)致細(xì)胞壞死或凋亡。除了氧化損傷，細(xì)胞因子的代謝異常也是酒精性肝病的一大特點，如致炎癥因子TNF-α、IL-1β等的大量表達(dá)(Nerietal.，2010)。

圖6 OLE對大鼠肝組織病理學(xué)影響Fig. 6 Effect of OLE on the hepatic histopathology in rats

A.正常組， B. 模型組， C. Ⅰ組， D. Ⅱ組， E. Ⅲ組。

A. control group， B. model group， C. group Ⅰ， D. group Ⅱ， E. group Ⅲ.

SREBP是一種重要的脂代謝調(diào)控因子，該蛋白屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋-亮氨酸鏈轉(zhuǎn)錄因子，有3種異構(gòu)體，分別為SREBP-1a、SREBP-1c及SREBP-2，其中SREBP-1c在人和鼠組織表達(dá)部位相近，尤其在肝臟中有高水平的表達(dá)，在脂肪肝的形成中起重要作用(祁瑞瑞，2012)。研究表明，乙醇可上調(diào)SREBP-1c的過度表達(dá)，促進(jìn)脂肪酸的合成，從而加重甘油三酯在肝臟內(nèi)的蓄積(蒲鵬，2016)。

本實驗觀察到，模型組大鼠肝組織TNF-α、IL-1β、MDA、SREBP-1c及血清ALT、AST、TG和TC水平顯著增加，SOD、CAT、GR水平降低。經(jīng)OLE治療后，肝組織TNF-α、IL-1β、MDA、SREBP-1c及血清ALT、AST、TG和TC水平顯著降低，SOD、CAT、GR水平顯著升高。這提示OLE能改善肝功能，清除肝損傷大鼠體內(nèi)氧自由基，下調(diào)肝組織中的炎癥介質(zhì)TNF-α、IL-1β的表達(dá)，抑制SREBP-1c水平，減輕肝組織脂肪變性程度，從而起到保護(hù)肝的作用。

實施國家基本藥物制度對我國基層醫(yī)療衛(wèi)生機構(gòu)激素類藥物使用率影響的Meta分析 …………………… 田 燕等（2）：254

綜上所述，OLE能有效減輕肝組織的病理損傷，對慢性酒精性肝損傷有顯著的保護(hù)作用，其機制可能與提高肝組織的抗氧化能力、緩解炎癥因子反應(yīng)及抑制SREBP-1c表達(dá)有關(guān)。本研究初步證實，OLE作為一種天然產(chǎn)物，可作為預(yù)防和治療肝損傷、肝纖維化的一種有潛在價值的藥物，值得更進(jìn)一步的開發(fā)研究。

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ProtectiveEffectsofOliveLeafExtractonAlcoholHepaticinRats

WANG Yu

(Center for Research & Development of Longnan Characteristic Agro-bioresources， College of Agriculture and Forestry， Longnan Teachers College， Chengxian， Gansu Province 742500， China)

2017-02-07接受日期2017-04-10

甘肅省高等學(xué)?？蒲匈Y助項目(1128B-01)； 甘肅省隴南市科技計劃項目(2016-11)

王昱(1973—)， 男， 碩士， 教授， 研究方向：天然產(chǎn)物藥理、細(xì)胞與發(fā)育生物學(xué)， E-mail：gswangyu@126.com

10.11984/j.issn.1000-7083.20170034

Q959.8； Q55

A

1000-7083(2017)05-0557-06