任梁， 艾世偉， 劉白林， 張迎梅

(蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅省環(huán)境生物監(jiān)測與修復(fù)重點實驗室，蘭州730000)

弱堿性農(nóng)田土壤重金屬污染對粉正蚓種群密度和生物量的影響研究

任梁， 艾世偉， 劉白林， 張迎梅*

(蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，甘肅省環(huán)境生物監(jiān)測與修復(fù)重點實驗室，蘭州730000)

為了探討弱堿性農(nóng)田土壤重金屬污染對粉正蚓Lumbricusrubellus種群密度和生物量的影響，本研究于2016年5—8月，選取以重金屬Cd、Pb、Zn、Cu污染為主的甘肅省白銀市四龍鎮(zhèn)梁莊村和雙合村的玉米農(nóng)田作為實驗樣地，同時以自然條件相近但相對無污染的永靖縣尤塬村的玉米農(nóng)田作為參照樣地。本研究對比檢測了實驗樣地與參照樣地的重金屬污染水平，粉正蚓種群密度、抗氧化酶活力(SOD、CAT和GSH-PX)、金屬硫蛋白濃度和溶酶體膜損傷程度等指標。結(jié)果顯示，2個實驗樣地粉正蚓抗氧化酶活力與參照樣地的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，但金屬硫蛋白濃度極顯著高于參照樣地(P<0.01)，表明粉正蚓在受到重金屬污染脅迫后產(chǎn)生了明顯的應(yīng)激反應(yīng)；與參照樣地相比，實驗樣地粉正蚓體腔細胞內(nèi)中性紅保留時間極顯著縮短(P<0.01)，表明土壤重金屬污染已導(dǎo)致粉正蚓溶酶體膜受損；實驗樣地粉正蚓的種群密度和生物量與參照樣地相比，總體上顯著(P<0.05)甚至極顯著(P<0.01)下降。研究結(jié)果表明，弱堿性農(nóng)田土壤中粉正蚓種群密度與生物量顯著低于相對無污染地區(qū)，這可能與長期重金屬污染導(dǎo)致粉正蚓溶酶體膜損傷、抗氧化酶活力不穩(wěn)定以及對環(huán)境脅迫應(yīng)激反應(yīng)增強等有關(guān)。

重金屬污染； 粉正蚓； 種群密度； 生物量； 抗氧化酶； 金屬硫蛋白； 中性紅保留時間

Abstract： To investigate the toxic effect of heavy metal on the population density and biomass ofLumbricusrubellusfrom weak alkaline farmlands， in this study， the maize farmlands of Liangzhuang and Shuanghe villages in Baiyin city (Gansu province)， which were mainly contaminated by Cd， Pb， Zn， and Cu for a long time， were selected as the study sites， and the maize farmlands of Youyuan village in Yongjing county which had similar natural conditions but with relatively unpolluted area was selected as the control site. The heavy metal contamination levels between the polluted and the control sites， the population density and biomass， antioxidant enzyme activities (SOD， CAT， GSH-PX)， metallothionein (MT) concentration and lysosomal membrane damage degree ofL.rubelluswere comparatively studied. The results showed that there were no significant differences in the antioxidase activities ofL.rubellusbetween the polluted and control sites， while extreme significantly higher MT concentration was found in the polluted sites (P<0.01)， indicating thatL.rubellusfrom the polluted sites might be involved in stress responses； the test of neutral red retention time showed an extremely significant shortening in the coelomic cells ofL.rubellusfrom the polluted sites (P<0.01)， this suggested that the lysosomal membrane was damaged； furthermore， the population density and biomass ofL.rubelluswere significantly (P<0.05) or extremely declined (P<0.01). According to the results of this study， we concluded that the significant decreased population density and biomass ofL.rubellusfrom weakly alkaline sites might be related to the long-term heavy metal pollution which lead to the damage of lysosomal membrane， change of antioxidase activities and increased responses to the environmental stress.

Keywords： heavy metal pollution；Lumbricusrubellus； population density； biomass； antioxidase； metallothionein； neutral red retention time

重金屬污染導(dǎo)致耕作土壤質(zhì)量下降的同時，對棲息在其中的土壤動物多樣性和種群密度也會產(chǎn)生影響。污染土壤中重金屬的種類、形態(tài)與生物自身對重金屬的富集等密切相關(guān)(Lietal.，2010)。

蚯蚓屬于大型土壤動物，在溫帶和熱帶的土壤動物群落結(jié)構(gòu)中占據(jù)了主要的生物量，對改善土壤有機質(zhì)組成以及疏松土壤起重要作用(Satchell，1983)，同時，由于蚯蚓直接攝食土壤以及表皮通透性較高等，重金屬元素也更易在蚯蚓體內(nèi)富集(Nahmanietal.，2007)?；诖耍球境蔀檠芯恐亟饘傥廴就寥赖氖走x指示生物。有研究者發(fā)現(xiàn)，蚯蚓在受到重金屬污染脅迫時不僅其生物量、種群密度和物種豐富度顯著下降(Vandecasteeleetal.，2004)，且會出現(xiàn)體腔細胞溶酶體膜的損傷、乙酰膽堿酯酶活力下降等情況(Calisietal.，2013)。但是，弱堿性農(nóng)田土壤重金屬污染條件下，蚯蚓種群密度以及相關(guān)生理生化指標會發(fā)生怎樣的變化，尚未見相關(guān)研究報道。

本文選擇甘肅省白銀地區(qū)長期污灌農(nóng)田為研究地點，選擇相對無污染的甘肅省永靖縣尤塬村為參照地，調(diào)查統(tǒng)計兩地農(nóng)田土壤中分布的唯一大型土壤動物粉正蚓Lumbricusrubellus的生物量與種群多樣性，并分析其與粉正蚓抗氧化能力、金屬硫蛋白水平以及體腔細胞中性紅保留時間等的相關(guān)性，旨在研究重金屬污染對農(nóng)田土壤中粉正蚓的毒性效應(yīng)，為今后開展污染土壤生物監(jiān)測與修復(fù)提供參考。

1 材料和方法

1.1研究樣地

研究地點位于甘肅省白銀市四龍鎮(zhèn)和臨夏回族自治州永靖縣，兩地相距110 km。白銀市年均氣溫9 ℃，年均降水量250 mm，永靖縣年均氣溫9.5 ℃，年均降水量260 mm，兩地氣候相似。本研究選取污染較嚴重的白銀市四龍鎮(zhèn)梁莊村(104°39′02″E，36°44′10″N)和雙合村(104°36′58″E，36°46′69″N)的2塊玉米農(nóng)田作為實驗樣地，相對無污染的永靖縣尤塬村(103°26′78″E，35°95′07″N)的玉米農(nóng)田作為參照樣地，每個樣地面積均為500 m2。

1.2土樣采集及分析

2016年5—8月，每個樣地隨機選3處采集表層土壤(0～20 cm)并混合。土樣帶回實驗室，用烘干法和電位法分別測定其含水量和pH值，剩余的土壤樣風干后磨碎過20目篩。用重鉻酸鉀容量法和土壤粒度快速測定法檢測土壤樣品中的有機碳含量及土壤粒度分布。

1.3土壤重金屬濃度測定

將0.5 g風干過2 mm篩后的土樣置于50 mL的坩堝中，水潤濕土樣后加10 mL鹽酸，低溫開蓋加熱至內(nèi)溶液為3 mL左右取下冷卻。后依次加入8 mL硝酸、8 mL氫氟酸和6 mL高氯酸，約30 min后開蓋繼續(xù)加熱至內(nèi)容物呈粘稠狀。取下坩堝稍冷卻后加入1 mL硝酸，并稀釋定容至25 mL，采用原子吸收光譜儀(FAAS，ZEEnit700P，Analytik Jena，Germany)進行重金屬含量測定。

1.4蚯蚓種群密度統(tǒng)計

在每個樣地按梅花布點法選取5個樣方，每個樣方挖掘80 cm×80 cm×20 cm的耕層土壤，以手撿法收集其中所有蚯蚓。經(jīng)鑒定，研究地只分布粉正蚓這一種寡毛綱Oligochaeta動物。將所采集到的粉正蚓進行統(tǒng)計、稱量，并根據(jù)生殖環(huán)帶鑒別其是否性成熟。

1.5抗氧化酶活性測定

抗氧化酶活性采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒利用分光光度法進行測定(梁海燕等，2007)。實驗用蚯蚓為采自3個樣地的成年粉正蚓，每個樣地隨機收集10條成年粉正蚓并帶回實驗室，稱量，平均體質(zhì)量0.45 g左右。加入相當于蚯蚓體質(zhì)量9倍的生理鹽水，快速將蚯蚓剪成數(shù)段，移入勻漿器勻漿，將勻漿液轉(zhuǎn)入5 mL的離心管，3 000 r·min-1離心10 min后，提取上清液用于蛋白定量和抗氧化酶活性測定。

1.6金屬硫蛋白濃度測定

金屬硫蛋白(metallothionein，MT)濃度的測定采用上海酶聯(lián)生物有限公司生產(chǎn)的蚯蚓金屬硫蛋白ELISA試劑盒。將提取的組織勻漿上清液用酶聯(lián)免疫法進行MT測定。

1.7溶酶體膜穩(wěn)定性測定

參照Weeks和Svendsen(1996)的方法，用纖維針法提取蚯蚓體液，將提取到的20 μL體腔液與林格氏液混合后滴到載玻片上，細胞懸液在載玻片表面停留1 min后加上80 μg·mL-1的中性紅工作液并封片，即刻置于400倍顯微鏡下觀察，每8～10 min觀察1次，不觀察時放置于人工氣候箱中。觀察到視野中有超過50%的細胞被染成粉紅色，停止計時，這段時間稱為中性紅保留時間(neutral red retention time，NRRT)，用來評價蚯蚓溶酶體膜的損傷程度。

1.8數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22.0進行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)測定3次平行，結(jié)果以平均值±標準差(Mean±SD)表示。使用單因素方差分析和Duncan檢驗法，顯著性水平設(shè)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1研究樣地土壤理化性質(zhì)與土壤重金屬積累濃度

3個研究樣地的土壤pH、有機碳、含水量、土壤粒度等基本理化性質(zhì)和土壤重金屬濃度見表1。3個研究樣地均屬于粉質(zhì)和弱堿性土壤，土壤含水量總體差異無統(tǒng)計學(xué)意義，梁莊村5—8月土壤有機碳含量極顯著高于尤塬村(P<0.01)，雙合村5月和7月土壤有機碳含量極顯著高于尤塬村(P<0.01)，且2個實驗樣地的Cu、Zn、Pb、Cd濃度均極顯著高于參照樣地(P<0.01)。

2.2土壤重金屬污染對粉正蚓種群密度、生物量和質(zhì)量的影響

粉正蚓種群密度統(tǒng)計結(jié)果見表2。在污染相對嚴重的雙合村，5月未見粉正蚓分布，6—8月雖采集到粉正蚓，但其種群密度和生物量均極顯著低于尤塬村(P<0.01)；土壤污染次之的梁莊村，5月和7月粉正蚓的種群密度顯著低于尤塬村(P<0.05)，其生物量在各月則極顯著低于尤塬村(P<0.01)；雙合村和梁莊村農(nóng)田土壤的成蚓體質(zhì)量顯著或極顯著低于尤塬村(P<0.05或P<0.01)；2個實驗樣地的同期幼蚓比例均高于參照樣地。

2.3土壤重金屬污染對粉正蚓抗氧化酶活性的影響

對粉正蚓SOD、CAT和GSH-PX酶活性的檢測結(jié)果顯示，各組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖1)。

表1 研究樣地土壤理化性質(zhì)與重金屬濃度Table 1 Physical and chemical properties of soil and heavy metal content

注Notes：**P<0.01； 下同the same below.

表2 粉正蚓種群密度、生物量、成蚓質(zhì)量和幼蚓所占比例Table 2 Population density， biomass， adult mass and proportion of Lumbricus rubellus juveniles

注Notes：*P<0.05； — 未檢出not detected.

圖1 重金屬污染對粉正蚓體內(nèi)抗氧化酶活性的影響Fig.1 Effects of soil heavy metal on antioxidase activityof Lumbricus rubellus

SOD活性：U/mgprot； CAT活性：mgprot/mL； GSH-PX活性：μmol·L/(mg·min)。

SOD activity： U/mgprot； CAT activity： mgprot/mL； GSH-PX activity： μmol·L/(mg·min).

2.4土壤重金屬污染對粉正蚓MT濃度的影響

2個實驗樣地農(nóng)田土壤中粉正蚓體內(nèi)MT濃度均極顯著高于參照樣地(P<0.01，圖2)。

2.5土壤重金屬污染對粉正蚓溶酶體膜的影響

2個實驗樣地農(nóng)田土壤中粉正蚓體腔細胞內(nèi)的NRRT均極顯著低于參照樣地(P<0.01，圖3)。

3 討論

3.1土壤重金屬污染對粉正蚓種群密度的影響

以往研究報道發(fā)現(xiàn)，在受重金屬污染的華北代表性農(nóng)田中，蚯蚓物種豐富度和種群密度都顯著下降(袁方曜等，2004)。本研究結(jié)果顯示，土壤重金屬污染不僅顯著影響粉正蚓的種群數(shù)量，而且顯著影響其生長發(fā)育。2個實驗樣地的粉正蚓幼體比例高于參照樣地，可能與實驗樣地土壤有機質(zhì)比參照樣地豐富有關(guān)，但隨著幼蚓的發(fā)育，過量重金屬在其體內(nèi)的蓄積可能通過影響其體內(nèi)消化酶的活力以及相應(yīng)的生理生化功能，進而影響其生長繁殖，表現(xiàn)出實驗樣地成年粉正蚓平均體質(zhì)量及種群生物量下降。王慧等(2008)也發(fā)現(xiàn)土壤Cd和Zn單一及復(fù)合染毒都會使蚯蚓的纖維素酶顯著降低，說明重金屬污染可影響成年粉正蚓的消化，進而導(dǎo)致其體質(zhì)量增長速度減緩。

圖2 重金屬污染土壤對粉正蚓體內(nèi)MT濃度的影響Fig. 2 Effects of soil heavy metal on MT concentrationof Lumbricus rubellus

**P<0.01； 下同the same below.

圖3 重金屬污染土壤對粉正蚓溶酶體膜穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of soil heavy metal on lysosomal membrane stability of Lumbricus rubellus

3.2土壤重金屬污染對粉正蚓抗氧化酶活性的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，3個樣地中粉正蚓的抗氧化酶活性差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。室內(nèi)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，Cu、Zn、Pb和Cd復(fù)合染毒會導(dǎo)致赤子愛勝蚓Eiseniafoetida組織內(nèi)SOD活性發(fā)生“抑制-誘導(dǎo)-抑制-抑制”，CAT活性出現(xiàn)先誘導(dǎo)后抑制的動態(tài)響應(yīng)過程(鄭麗萍等，2015)。Cr、Ag和Cu對赤子愛勝蚓體內(nèi)GSH-PX活力也呈現(xiàn)先誘導(dǎo)后減弱的趨勢，這可能與重金屬元素與GSH-PX的前體結(jié)合，減少了GSH-PX的生成有關(guān)(李超民等，2015)?？傊覂?nèi)研究結(jié)果顯示蚯蚓在重金屬污染脅迫條件下，短時期內(nèi)其抗氧化酶活力主要表現(xiàn)為被抑制現(xiàn)象，而本研究結(jié)果顯示長期處于土壤重金屬污染脅迫條件下的粉正蚓，其體內(nèi)抗氧化酶活性則趨于適應(yīng)性的新平衡狀態(tài)。因此，本研究認為采用傳統(tǒng)的蚯蚓酶活指標指示土壤環(huán)境污染程度的方法有待進一步規(guī)范。

3.3土壤重金屬污染對粉正蚓MT濃度的影響

污染地區(qū)粉正蚓體內(nèi)的MT濃度顯著高于未污染地區(qū)，說明粉正蚓在受到重金屬污染脅迫時體內(nèi)發(fā)生了應(yīng)激反應(yīng)，誘導(dǎo)體內(nèi)產(chǎn)生MT，將重金屬離子螯合，清除體內(nèi)自由基，對機體起到解毒作用。有研究發(fā)現(xiàn)，在室內(nèi)條件下將蚯蚓暴露于不同濃度Pb或Zn的土壤中，28 d后蚯蚓體內(nèi)的MT水平顯著升高(Maityetal.，2011)。本研究結(jié)果與Calisi等(2013)對采自野外重金屬污染條件下的陸正蚓L.terrestris的MT研究結(jié)果完全一致。說明MT濃度指標作為土壤重金屬污染程度的標志物較為可靠。

3.4土壤重金屬污染對粉正蚓溶酶體膜的影響

對粉正蚓的體腔細胞進行中性紅染色時，細胞內(nèi)的溶酶體能很快吸收中性紅染料，在光學(xué)顯微鏡下觀察到的體腔細胞為透明橢圓形。如果中性紅從溶酶體中滲漏出來，在光學(xué)顯微鏡下觀察到的體腔細胞為粉紅色。因此，NRRT縮短程度與溶酶體膜損傷程度一致，NRRT常被作為溶酶體膜損傷程度的指示物。蚯蚓的體腔細胞主要分為組織黃細胞、嗜中性細胞、嗜酸性細胞和嗜堿性細胞，而這4類細胞均是蚯蚓細胞免疫的重要組成細胞。有報道發(fā)現(xiàn)Pb染毒后，赤子愛勝蚓的NRRT顯著縮短，且NRRT與Pb濃度呈顯著正相關(guān)性(王秋麗等，2007)。本研究中，實驗樣地粉正蚓的NRRT縮短，這一結(jié)果與Gestel等(2009)對受污染的洪泛平原環(huán)境中蚯蚓的NRRT情況一致。說明重金屬污染可導(dǎo)致蚯蚓體腔細胞溶酶體膜受損，影響其免疫系統(tǒng)與機體正常的代謝活動，進而導(dǎo)致它們的生長和繁殖速率下降。

4 結(jié)論

在白銀地區(qū)梁莊村和雙合村農(nóng)田土壤重金屬Cd、Pb、Zn、Cu為主要污染的條件下，粉正蚓種群密度、生物量、成年粉正蚓的平均體質(zhì)量均顯著低于相對無污染地區(qū)，這可能與重金屬污染致蚯蚓溶酶體膜損傷以及應(yīng)激反應(yīng)增強，粉正蚓體質(zhì)狀況下降、繁殖能力減弱有關(guān)，更為直接的原因及機理有待進一步研究。

致謝：感謝郭蕊同學(xué)在野外樣方統(tǒng)計與采樣過程中的幫助；感謝韓江媛同學(xué)在酶活測定與體腔細胞提取實驗過程中提供的幫助。

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EffectsofHeavyMetalPollutiononthePopulationDensityandBiomassofLumbricusrubellusfromWeakAlkalineFarmlands

REN Liang， AI Shiwei， LIU Bailin， ZHANG Yingmei*

(Gansu Key Laboratory of Biomonitoring and Bioremediation for Environmental Pollution， School of Life Sciences， Lanzhou University， Lanzhou 730000， China)

2017-04-08接受日期2017-05-19

國家自然科學(xué)基金項目(41171391)

任梁(1991—)， 男， 碩士研究生， 研究方向：環(huán)境動物學(xué)， E-mail：renl2014@lzu.edu.cn

*通信作者Corresponding author， 女， 博士， 教授， E-mail：ymzhang@lzu.edu.cn

10.11984/j.issn.1000-7083.20170113

Q958.113； Q959.19

A

1000-7083(2017)05-0507-06