申 輝，張清安,張馨允，史芳芳,范學輝

(1.陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，西安710119；2.華南理工大學 食品科學與工程學院，廣州510641)

綜合利用

苦杏仁多酚氧化酶的分離純化及部分特性分析

申 輝1,2，張清安1,張馨允1，史芳芳1,范學輝1

(1.陜西師范大學 食品工程與營養(yǎng)科學學院，西安710119；2.華南理工大學 食品科學與工程學院，廣州510641)

以苦杏仁為原料，采用(NH4)2SO4分級沉淀法對苦杏仁多酚氧化酶進行初步分離后經(jīng)Sephadex G-75凝膠柱層析進一步純化，冷凍干燥后即得苦杏仁多酚氧化酶純品；通過凝膠電泳和熱分析試驗測定多酚氧化酶的相對分子質量和變性溫度。結果表明：經(jīng)分離純化后苦杏仁多酚氧化酶的純化倍數(shù)為49.03倍，該酶可能存在同工酶且相對分子質量分別約為21.9 kD和23.2 kD；苦杏仁多酚氧化酶變性溫度為60.03.℃。為苦杏仁加工過程中的酶促褐變控制提供部分理論參數(shù)。

苦杏仁；多酚氧化酶；分離；酶活；褐變

Abstract：With apricot kernels as raw material,the (NH4)2SO4fractional precipitation and Sephadex G-75 gel chromatography were employed to precipitate and purify the polyphenol oxidase from apricot kernel respectively,and the pure polyphenol oxidase was obtained after freeze drying.In addition,the relative molecular weight and denatured temperature of the purified polyphenol oxidase were also determined by the electrophoresis experiment and thermal analysis.The results showed that the purification fold of the polyphenol oxidase was 49.03 times after isolation and purification,and the relative molecular weights of its isozyme were about 21.9 kD and 23.2 kD respectively,and its denatured temperature was 60.03.℃.The research results could provide some theoretical parameters for the control of enzymatic browning in the processing of apricot kernel.

Keywords：apricot kernel; polyphenol oxidase; isolation; enzyme activity; browning

杏(ArmeniacavulgarisLam.)，薔薇科杏屬植物，落葉喬木，地生，主要分布于我國北方地區(qū)。杏仁是杏的種子，含有豐富的蛋白質、油脂、糖、苦杏仁苷、維生素和微量元素等多種成分[1]，按照苦杏仁苷含量的不同可分為甜杏仁和苦杏仁。甜杏仁常作為食品加工業(yè)的原輔料或者直接食用。苦杏仁中含有豐富的不飽和脂肪酸、人體必需氨基酸和苦杏仁苷，可作為良好的營養(yǎng)保健食品和藥用植物資源進行開發(fā)利用。近幾年，圍繞杏仁蛋白[2]、杏仁油[3]、苦杏仁苷[4]、杏仁皮[5-6]等方面的研究呈上升趨勢，這對于提高苦杏仁附加值、促進杏仁產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。然而，在苦杏仁的加工過程中，由于其成分復雜及加工貯藏工藝的限制，常會發(fā)生復雜的化學變化導致品質下降，從而降低了苦杏仁制品的商業(yè)價值。這是因為在加工過程中苦杏仁組織結構遭到破壞與氧氣接觸，酚酶催化氧化酚類物質生成醌，而后醌類物質通過聚合作用生成有色物質，從而導致苦杏仁品質下降，即酶促褐變反應是引起苦杏仁加工品質降低的重要原因，其主要酶則是多酚氧化酶(PPO)。因此，了解苦杏仁PPO的相關理化性質對于有效控制苦杏仁酶促褐變具有重要意義，但目前有關這方面的研究較少。

本文結合酶分離純化常用的(NH4)2SO4分級沉淀法和凝膠柱層析法[7-9]對苦杏仁PPO進行分離和純化，并測定其相對分子質量和變性溫度，以期為基于酶活性進行苦杏仁酶促褐變控制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 原料與試劑

苦杏仁，購于西北藥材市場，挑選形態(tài)飽滿、無破損、無病蟲害的苦杏仁備用；無水乙醇、丙酮、(NH4)2SO4、KH2PO4、NaOH、聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)等試劑或藥品均為分析純；牛血清蛋白，上海伯奧生物科技有限公司；考馬斯亮藍G-250，國藥集團化學試劑有限公司；Sephadex G-75，Pharmacia公司。

1.1.2 儀器與設備

PHS-3C型pH計；JA2003N型電子天平；2-16PK臺式高速冷凍離心機，Sigma公司；UV-1700紫外可見分光光度計；Alphal-4型真空冷凍干燥機，德國Marin Christ公司；KQ3200B超聲波清洗器；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵；MDF-U5410超低溫冰箱，日本Sanyo公司；Q1000DSC+LNCS+FACS Q600SDT熱分析系統(tǒng)，美國TA公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品的制備

稱取適量苦杏仁，按質量比100∶1加入聚乙烯吡咯烷酮(PVPK30)作為酚類物質的去除劑，充分粉碎后快速取出，加入經(jīng)-28.℃預冷的丙酮至完全浸沒，在4.℃條件下靜置2 h，然后用預冷過的丙酮反復抽濾除油，直至成為白色粉末，即得經(jīng)丙酮去油后的苦杏仁粉樣品(丙酮粉)，置于低溫下保存[10-12]。

1.2.2 (NH4)2SO4分級沉淀

磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L pH 6.50)的制備：稱取KH2PO46.80 g，加入0.10 mol/L的NaOH溶液152 mL，然后用蒸餾水定容至1 000 mL，經(jīng)pH計校準后即得磷酸鹽緩沖液。

稱取一定量丙酮粉，與磷酸鹽緩沖液按料液比1∶5混勻，5 000 r/min離心10 min。取上清液并加入(NH4)2SO4鹽析，按質量體積比區(qū)間0～1∶15、1∶15～2∶15、2∶15～3∶15、3∶15～4∶15、4∶15～5∶15、5∶15～6∶15進行分級沉淀，每個樣品均置于4.℃下鹽析2 h。經(jīng)9 000 r/min離心10 min后收集沉淀，在-28.℃下冷凍后置于真空冷凍干燥機中干燥24 h，收集凍干品即得苦杏仁PPO粗提物。通過測定酶活性，找出苦杏仁PPO沉淀最集中的區(qū)間，以提高(NH4)2SO4鹽析的效果。由于不同飽和度下的(NH4)2SO4分級沉淀法操作相對煩瑣，故在此轉化為質量體積比區(qū)間進行鹽析沉淀。

1.2.3 酶活性和蛋白質質量濃度的測定

將上述凍干的苦杏仁PPO粉末用磷酸鹽緩沖液制備成溶液，在25.℃條件下向比色皿中加入濃度為0.2 mol/L的鄰苯二酚溶液2 mL，然后加適當濃度的苦杏仁PPO溶液1 mL，立即搖勻后于410 nm波長下開始測量[10]，每隔6 s記錄一次吸光度，連續(xù)測定3 min，以最初近似直線的部分計算酶活性。由于沉淀中不僅存在雜蛋白，也可能存在非蛋白質類雜質，均影響著酶的純度。在此，引入比活力和酶活力的定義[13]，通過計算后比較各個區(qū)間內沉淀的比活力和酶活力，以選擇PPO純度最高的比例區(qū)間。

比活力定義為：在試驗條件下，每毫克蛋白質1 min 內引起吸光度隨時間增加0.01為一個比活力單位。

酶活力定義為：在試驗條件下，每毫克沉淀1 min 內引起吸光度隨時間增加0.01為一個酶活力單位。

比活力可以反應單位質量蛋白質中PPO的占比，比活力越大說明雜蛋白越少，PPO純度越高；酶活力反應單位沉淀內的PPO含量，酶活力越大說明沉淀中雜蛋白和非蛋白類雜質越少，PPO純度越高。通過計算，找出比活力和酶活力均較高的區(qū)間，以此作為(NH4)2SO4分離純化苦杏仁PPO的依據(jù)。

以牛血清蛋白為標準蛋白，采用考馬斯亮藍G-250 比色法測定可溶性蛋白含量。以0、200、400、600、800、1 000 μg/mL牛血清蛋白質量濃度為橫坐標，410 nm波長下的吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，得線性方程：y=0.000 4x-0.001 1(R2=0.999 2)，通過此方程計算樣品溶液的蛋白質質量濃度。

1.2.4 Sephadex G-75凝膠柱層析

經(jīng)(NH4)2SO4分級沉淀后，找出最佳的質量體積比區(qū)間，收集該區(qū)間內的沉淀，經(jīng)冷凍干燥后配制成質量濃度為30 mg/mL的苦杏仁PPO溶液，取2 mL 上樣于經(jīng)磷酸鹽緩沖液(0.05 mol/L pH 6.50)平衡的Sephadex G-75凝膠柱(1.5 cm×75 cm)進行柱層析分離純化，用0.4 mL/min的磷酸鹽緩沖液洗脫，每管收集3 mL。柱層析結束后測定每管洗脫液酶活性及280 nm下的吸光度(A280)，收集蛋白質吸收峰與酶活性峰重疊的洗脫液。

1.2.5 電泳法測定苦杏仁PPO的相對分子質量

經(jīng)1.2.4收集蛋白質吸收峰與PPO活性峰重疊的洗脫液后，向洗脫液中加入適量的(NH4)2SO4沉淀PPO，收集沉淀經(jīng)冷凍干燥后即得PPO粉末，然后進行SDS-PAGE垂直板電泳試驗。采用5%的濃縮膠和12%的分離膠，上樣質量濃度為2 mg/mL，每孔上樣量15 μL，樣品在濃縮膠和分離膠中遷移時的電壓分別為100 V和120 V，以檢測苦杏仁PPO的分離純化效果并測定其相對分子質量。

1.2.6 熱分析法測定苦杏仁PPO的有關特性

取適量1.2.5中制得的PPO粉末進行差示掃描量熱(DSC)試驗和熱重分析(TGA)試驗，以測定苦杏仁PPO的有關熱力學特性。

2 結果與討論

2.1 (NH4)2SO4分級沉淀結果

(NH4)2SO4分級沉淀結果見表1。

表1 (NH4)2SO4分級沉淀結果

由表1可知，蛋白質的析出主要集中于1∶15～4∶15區(qū)間內；比活力較高的沉淀主要集中于0～3∶15 區(qū)間內；而在0～1∶15 區(qū)間內，雖然比活力較高，但酶活力較低，說明沉淀中非蛋白質類物質含量較高，蛋白質純度低；在3∶15～4∶15區(qū)間內，沉淀最多，沉淀中蛋白質含量也最高，但比活力和酶活力均較低。綜合考慮上述結果，收集1∶15～3∶15區(qū)間內的沉淀進行柱層析試驗，對苦杏仁PPO進一步分離純化。

基于上述結論，稱取30 g丙酮粉，加入150 mL磷酸鹽緩沖液浸泡，置于4.℃下靜置2 h后，5 000 r/min 離心10 min，收集上清液。把上清液分為第一、二組，分別按質量體積比1∶15、6∶15加入(NH4)2SO4，攪勻后置于4.℃下鹽析2 h，9 000 r/min 離心10 min，收集沉淀。取第一組上清液15 mL，加2 g(NH4)2SO4進一步鹽析，4.℃下靜置2 h后9 000 r/min離心即得所需沉淀。沉淀于-28.℃下冷凍后置于冷凍干燥機中干燥24 h，得凍干品即粗酶粉。通過測定每組樣品的蛋白質含量和酶活性，可計算得(NH4)2SO4分級沉淀法對苦杏仁PPO的初步分離純化效果，結果如表2所示。

表2 (NH4)2SO4分級沉淀法對苦杏仁PPO的初步分離純化結果

由表2可知，1∶15～3∶15區(qū)間內集中了91.14%的PPO，因此收集該區(qū)間內的沉淀進行Sephadex G-75 凝膠柱層析分離試驗；通過(NH4)2SO4分級沉淀，可對雜蛋白進行初步分離，使苦杏仁PPO的純化倍數(shù)達到10.30倍。

2.2 凝膠柱層析試驗結果

以洗脫管數(shù)為橫坐標，以280 nm(蛋白質吸收峰)下的吸光度A280及酶活力為縱坐標，繪制洗脫圖，結果如圖1所示。

圖1 苦杏仁PPO的Sephadex G-75洗脫曲線

由圖1可以看出，第一個蛋白質吸收峰對應有較高的酶活，第二個蛋白質吸收峰無酶活，說明第一個吸收峰(蛋白質峰與酶活性峰重疊部分)為苦杏仁PPO的洗脫峰。收集第4～10號管內洗脫液，經(jīng)(NH4)2SO4鹽析，冷凍干燥后即得苦杏仁PPO純品，測定其比活力為288.27，計算得純化倍數(shù)高達49.03倍，說明用此方法分離純化苦杏仁PPO是可行的。

2.3 苦杏仁PPO相對分子質量的測定

采用SDS-PAGE凝膠電泳試驗測定苦杏仁PPO的相對分子質量，結果如圖2所示。

由圖2可以看出，經(jīng)Sephadex G-75凝膠柱層析后一部分雜蛋白被分離，且試驗結果顯示存在2條明顯的酶帶，推測可能存在苦杏仁PPO同工酶，計算得其相對分子質量約為21.9 kD和23.2 kD。這與朱繼英等[9]報道的雙孢蘑菇PPO相對分子質量約為25.5 kD和胡婉峰等[14]報道的蓮藕PPO相對分子質量約為21.0 kD接近。

注：編號1、2、3、4、5分別表示0～6∶15區(qū)間內的沉淀、1∶15～3∶15區(qū)間內的沉淀、1∶15～3∶15區(qū)間內的沉淀(重復試驗)、柱層析后的PPO、柱層析后的PPO(重復試驗)。標準蛋白及相對分子質量分別為：a為兔磷酸化酶B，97.4 kD；b為牛血清白蛋白，66.2 kD；c為兔肌動蛋白，43.0 kD；d為牛碳酸酐酶，31.0 kD；e為胰蛋白酶抑制劑，20.1 kD。

圖2苦杏仁PPO電泳圖

2.4 熱性質分析

2.4.1 DSC試驗

DSC主要用來研究蛋白質的熱變性，通過測定蛋白質在升溫過程中的能量變化，進而對蛋白質的相關特性進行研究。試驗結果如圖3所示。

圖3 苦杏仁PPO的DSC圖

由圖3可以看出，苦杏仁PPO的熱變性溫度(Td)為60.03.℃，焓變(ΔH)為50.50 J/g。Td值反映PPO的熱穩(wěn)定性，ΔH是指引起PPO變性所需要的熱量。因此，理論上當把溫度升高到60.03.℃以上，同時給予充分的加熱時間，便可使苦杏仁PPO失活，從而抑制苦杏仁酶促褐變的發(fā)生。在實際加工生產(chǎn)中，對苦杏仁原料的烘干溫度是高于60.03.℃的，而在后續(xù)加工過程中仍會發(fā)生酶促褐變，這可能是由于PPO處于苦杏仁未遭到破壞時的復雜體系中，與苦杏仁內的其他成分在結構上發(fā)生交聯(lián)，從而導致酶活難以失去。因此，如何優(yōu)化加工條件，最大限度抑制苦杏仁酶促褐變，還需進一步研究。

2.4.2 TGA試驗

TGA是測量樣品質量隨溫度變化的一種常用的熱分析方法，可以反應樣品的水分含量、水化程度、物質組成、分解溫度等信息[15]。試驗結果如圖4所示。

圖4 苦杏仁PPO的TGA圖

由圖4可以看出，隨著溫度的升高，苦杏仁PPO的質量損失過程可分為3個階段：第一個階段是當溫度升高至200.℃時，自由水分的蒸發(fā)和PPO高級結構遭到破壞的過程；第二個是熱分解階段，在此過程中，苦杏仁PPO中的結合水開始失去，羥基基團遭到破壞；第三個是其他雜質發(fā)生分解的過程。蛋白質的TGA曲線與蛋白質水分含量、分子間作用力及聚集態(tài)有關?？嘈尤蔖PO質量損失的前兩個階段可能與其自身結構的破壞過程有關，首先是第一階段中高級結構的破壞，這個過程伴隨著酶的變性失活與自由水的散失；當溫度升高到400.℃左右時，結合水開始失去，高級結構及化學基團遭到更加嚴重的破壞，同時肽鍵可能發(fā)生斷裂，進而影響酶的一級結構。酶活性究竟與哪些化學基團有關以及存在于酶結構中的哪個部位還需要深入研究探討。

3 結 論

采用(NH4)2SO4分級沉淀法對苦杏仁PPO進行初步分離純化，收集質量體積比1∶15～3∶15區(qū)間內的沉淀凍干，通過測定酶活性可知此步的純化倍數(shù)為10.30倍；然后經(jīng)Sephadex G-75凝膠柱層析試驗，對PPO進一步分離純化，去除雜蛋白，計算得純化倍數(shù)為49.03倍，說明此方法分離純化苦杏仁PPO的效果較好。通過凝膠電泳試驗可知苦杏仁PPO可能存在同工酶，相對分子質量約為21.9 kD和23.2 kD；通過熱分析試驗得苦杏仁PPO的熱變性溫度為60.03.℃，加熱過程中PPO質量的損失可能與其結構破壞的順序有關。

通過對苦杏仁PPO的相關特性進行分析，尋求最佳的褐變控制方法，并對去皮工藝進行改進。因苦杏仁PPO純品的熱變性溫度為60.03.℃，因此可以把去皮、烘干等工序的溫度控制在熱變性溫度以上，以降低酶活；但溫度不宜過高，以避免非酶褐變的發(fā)生。因此，在實際生產(chǎn)中應合理控制加工條件，盡可能在抑制酶促褐變的同時，降低高溫對苦杏仁其他成分的影響，最大限度地保護其原有品質。

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Isolation,purificationandpropertiesofpolyphenoloxidasefromapricotkernel

SHEN Hui1,2,ZHANG Qing’an1,ZHANG Xinyun1,SHI Fangfang1,FAN Xuehui1

(1.College of Food Engineering and Nutritional Science,Shaanxi Normal University,Xi’an 710119,China; 2.School of Food Science and Engineering,South China University of Technology,Guangzhou 510641,China)

TS201.1;TQ646

A

1003-7969(2017)09-0136-05

2016-12-24；

2017-05-20

國家自然科學基金青年科學基金項目(31101324)；陜西省自然科學基金項目(2015JM3097)；中央高校基本科研業(yè)務費專項(GK201602005)

申 輝 (1989)，男，博士研究生，研究方向為食品加工過程控制(E-mail)shsnnu@163.com。

張清安，副教授(E-mail)qinganzhang@snnu.edu.cn。