劉麗婭，陸桂麗，王 杰，沈辰峰，馬曉菁，薛 晶，葉 鋒，易新萍，王金泉，鐘 旗

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2. 新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所（動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心），新疆烏魯木齊 830000）

布魯氏菌種熒光定量PCR快速檢測(cè)方法的建立

劉麗婭1，2，陸桂麗2，王 杰2，沈辰峰2，馬曉菁2，薛 晶2，葉 鋒2，易新萍2，王金泉1，鐘 旗2

（1. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆烏魯木齊 830052；2. 新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所（動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心），新疆烏魯木齊 830000）

根據(jù)熒光定量PCR原理和技術(shù)，通過(guò)與GeneBank數(shù)據(jù)庫(kù)中布魯氏菌基因組進(jìn)行序列比對(duì)，選擇不同種屬布魯氏菌的特異性位點(diǎn)，設(shè)計(jì)3對(duì)引物和Taqman熒光探針。將3對(duì)引物進(jìn)行獨(dú)立的種特異熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)優(yōu)化，最終實(shí)現(xiàn)在1次熒光定量PCR反應(yīng)中完成對(duì)牛種、羊種、豬種布魯氏菌的鑒別和定量。該檢測(cè)方法特異、敏感、快速，既能實(shí)現(xiàn)對(duì)布魯氏菌的分種，又能實(shí)現(xiàn)定量快速檢測(cè)，對(duì)于布魯氏菌病的流行病學(xué)調(diào)查和防治都具有重要意義。

布魯氏菌；熒光定量PCR；檢測(cè)方法

Abstract：In this study，three pairs of primers and Taqman fluorescent probes were designed and the specific loci of different species of Brucella were selected by comparing the sequences of the Brucella genome in the GeneBank database，according to the principle and technique of fluorescence quantitative PCR. Three pairs of primers were used to optimize the specific quantitative PCR. The final identification and quantification of Brucella of cattle，sheep and swine were completed in a fluorescence quantitative PCR reaction. The detection method was specific，sensitive and rapid，and it could not only realize the Brucella species，but also achieve rapid quantitative detection，which was very important for the epidemiological investigation of Brucella bacteria and the prevention and treatment of Brucellosis.

Key words：Brucella；fluorescence quantitative PCR；detection method

布魯氏菌病是由布魯氏菌引起的一種慢性人獸共患傳染病，在我國(guó)歸為二類(lèi)動(dòng)物疫病，呈全球性流行。該病既給畜牧業(yè)帶來(lái)巨大經(jīng)濟(jì)損失，也給人的生命安全帶來(lái)了極大威脅[1-2]。該病以牛、羊、豬感染為主，每年因此造成的經(jīng)濟(jì)損失高達(dá)數(shù)億美元。檢測(cè)技術(shù)一直是布魯氏菌病研究的重要領(lǐng)域。傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)和血清學(xué)檢測(cè)方法存在著陽(yáng)性率低、假陽(yáng)性和假陰性的干擾，應(yīng)用受到限制。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，直接檢測(cè)布魯氏菌核酸成為可能。Baily等[3]按B.abortus 31 kDa外膜蛋BCSP31基因選定的1對(duì)B4、B5 引物用于布魯氏菌屬檢測(cè)，擴(kuò)增產(chǎn)物為223 bp片段。這一方法已被國(guó)內(nèi)外多個(gè)實(shí)驗(yàn)室重復(fù)過(guò)，被證明是敏感、特異、可靠的布魯氏菌檢測(cè)方法，可用于提取的布魯氏菌DNA、快速煮沸菌體上清液、含菌病料等的檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)建立了3個(gè)獨(dú)立的種特異熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)。3個(gè)定量PCR熱循環(huán)參數(shù)是一致的，使之可以在1次熒光定量PCR反應(yīng)中完成對(duì)牛種、羊種、豬種布魯氏菌的鑒別和定量。由于PCR產(chǎn)物片段大小不同，可將本實(shí)驗(yàn)的引物和實(shí)驗(yàn)條件用于常規(guī)PCR實(shí)驗(yàn)，對(duì)布魯氏菌進(jìn)行種水平的鑒別。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1布魯氏菌和參考菌。布魯氏菌菌株（B.abortus 544A、104，B.melitensis l6M，B.suis 1330），購(gòu)于中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)微生物學(xué)研究所布魯氏菌病室；參考菌株E.coli O:157，Y.enter O:9，均購(gòu)于中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院流行病學(xué)微生物學(xué)研究所。

1.1.2屬特異引物和熒光探針。用Primer Express 2.0軟件設(shè)計(jì)牛種、羊種、豬種布魯氏菌特異性引物和Taqman熒光探針，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成、標(biāo)記和純化（表1）。

表1 引物相關(guān)情況

1.1.3試劑和儀器

1.1.3.1主要試劑。DNA Purificcation System質(zhì)粒提取試劑盒、DNA Purificcation System質(zhì)粒小量純化試劑盒、RNA酶（Rnase）、蛋白酶K（Protase K），均為美國(guó)Promega公司產(chǎn)品；DNA凝膠回收純化試劑盒，為杭州維特潔公司產(chǎn)品；SDS、瓊脂糖、胰蛋白陳、酵母抽提物、氯化鈉、Tris、EDTA等試劑，均為國(guó)外產(chǎn)品國(guó)內(nèi)公司分裝；Pst I、EcoR I、pMD 18-T載體、ExTaq DNA聚合酶、dNTP，均為寶生物大連有限公司產(chǎn)品。

1.1.3.2主要儀器。Bio-Red IQ Detection System（美國(guó)BIO-RAD公司產(chǎn)品）；HVE-50自動(dòng)滅菌高壓鍋（口本平山公司產(chǎn)品）；400 L超低溫冰箱（德國(guó)賀利氏公司產(chǎn)品）；PL5241 K純水器（美國(guó)頗爾公司產(chǎn)品）；Biofuge臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（德國(guó)賀利氏公司產(chǎn)品）；TKP-M/WL凝膠成像系統(tǒng)（法國(guó)產(chǎn)品）；BS210S分析天平（德國(guó)S artorius公司產(chǎn)品）；BIO-RAD真空泵（美國(guó)伯樂(lè)公司產(chǎn)品）；FTGENEZD型PCR儀（英國(guó)Techgene公司產(chǎn)品）；移液器（法國(guó)吉爾森公司產(chǎn)品）；Gene Quant定量?jī)x（瑞典Pharamacia Biotech公司產(chǎn)品）。

1.2 方法

1.2.1活菌記數(shù)。將布魯氏菌在肝湯瓊脂斜面培養(yǎng)48 h，離心棄上清。生理鹽水重懸，用標(biāo)準(zhǔn)比濁管制成10億/mL菌液；10倍系列稀釋到1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101；每個(gè)稀釋度取 0.2 mL，接種于3個(gè)培養(yǎng)板中，每個(gè)平板0.1 mL，涂勻。將平板置于37 ℃溫箱中培養(yǎng)，48 h后觀察菌落數(shù)，計(jì)算每個(gè)稀釋度3個(gè)平板的平均菌落數(shù)，進(jìn)而得出CFU/mL。

1.2.2DNA提取。取1.0 mL菌懸液于1.5 mL的離心管中。10 000 r/min離心5 min，棄去上清。按照DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行DNA提取操作，將提取的DNA放置-20 ℃保存?zhèn)溆?，并將DNA溶液用Gene Quant定量?jī)x測(cè)濃度和純度。

1.2.3陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品制作

1.2.3.1牛、羊、豬屬特異片段的擴(kuò)增。以上述布魯氏菌提取的DNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。反應(yīng)體系：Premix 12.5 μL、Primer F 0.5 μL、Primer R 0.5 μL、模板 2 μL、Water 9.5 μL，總體積 25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃變性4 min，94 ℃變性45 s，52.8 ℃退火1 min，72 ℃延伸2 min，共35個(gè)循環(huán)，最后72 ℃再延伸10 min，4 ℃終止。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳，通過(guò)核酸染料染色后，紫外燈下觀察PCR擴(kuò)增結(jié)果。按照DNA凝膠回收試劑盒說(shuō)明，回收PCR產(chǎn)物，將其送往上海生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.3.2牛、羊、豬屬陽(yáng)性重組質(zhì)粒的克隆。將PCR純化產(chǎn)物與pMD18-T載體連接。連接反應(yīng)體系為：pMD18-T Vector 1 μL、DNA 3 μL、SolutionI 5 μL、ddH2O 5 μL。連接反應(yīng) 16 ℃過(guò)夜。次日，取出感受態(tài)細(xì)胞JM109，置37 ℃水浴中；待細(xì)胞融化后，立即把離心管轉(zhuǎn)移到冰浴中放置10 min。將連接產(chǎn)物加入到感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕旋轉(zhuǎn)，混勻，冰浴30 min；42 ℃水浴，熱應(yīng)激90 s，冷卻1～2 min。每管加200 μL的LB培養(yǎng)基，用水浴將培養(yǎng)基加溫至37 ℃，然后將管轉(zhuǎn)移到37 ℃搖床上，培養(yǎng)60 min；最后轉(zhuǎn)移到Amp平板上進(jìn)行培養(yǎng)過(guò)夜。用滅菌牙簽挑取可疑菌落接種于含Amp液體LB培養(yǎng)基的試管中培養(yǎng)過(guò)夜。提取質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。取部分菌液加入終濃度30%的甘油保存菌種。

1.2.3.3酶切鑒定。用所選限制性內(nèi)切酶，分別對(duì)陽(yáng)性重組質(zhì)粒進(jìn)行酶切鑒定。酶切反應(yīng)體系為內(nèi)切酶各 1 μL、K-Buffer 2 μL、質(zhì)粒 DNA 5 μL、ddH2O 12 μL。

1.2.3.4質(zhì)粒提取。對(duì)重組質(zhì)粒的提取，按照質(zhì)粒提取試劑盒說(shuō)明書(shū)要求進(jìn)行操作。

1.2.3.5質(zhì)粒濃度測(cè)定。用DNA quent定量?jī)x測(cè)定濃度，將純化質(zhì)粒稀釋100倍，平行作3管，分別測(cè)定濃度和A260/A280值。用含有屬特異片段的重組子，用分子生物學(xué)軟件DNAStar統(tǒng)計(jì)堿基數(shù)，計(jì)算重復(fù)組質(zhì)粒的平均分子量。用超純水將質(zhì)粒溶液稀釋成含 1×109、1×108、1×107、1×106、1×105、1×104、1×103、1×102、1×101、1×100個(gè)拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性質(zhì)粒，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)條件的優(yōu)化

1.2.4.1引物的最適濃度。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，大致確定各組分濃度后逐個(gè)進(jìn)行優(yōu)化，確定其最適濃度。引物經(jīng)超純水稀釋后的終濃度分別為200、250、300、350、400、450、500、550 nM 8個(gè)濃度水平；將所有成分充分預(yù)混，最后加入模板，進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)，觀察擴(kuò)增曲線。

1.2.4.2探針的最適濃度。對(duì)牛種、羊種、豬種3個(gè)基因分別進(jìn)行探針濃度優(yōu)化。3個(gè)基因上下游引物濃度分別保持在350 nmol/L，探針濃度分別取 200、250、300、350、400、450、500、550 nM 8個(gè)濃度梯度；每個(gè)濃度梯度做8個(gè)平行樣。實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)參數(shù)及最佳濃度的選擇同引物濃度優(yōu)化選擇方法。

1.2.4.3最適退火溫度。在體系各組分濃度最優(yōu)化后，將退火溫度設(shè)置為8個(gè)溫度梯度（55～65 ℃進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增；同一模板8個(gè)平行樣3次重復(fù)；對(duì)擴(kuò)增所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出反應(yīng)的最優(yōu)退火溫度。

1.2.5實(shí)時(shí)多重?zé)晒舛縋CR反應(yīng)條件

1.2.5.1牛種、羊種、豬種單重實(shí)時(shí)多重PCR反應(yīng)條件。反應(yīng)體系為：Premix 12.5 μL、Primer F 0.5 μL、Primer R 0.5 μL、探針 0.5 μL、模板 2 μL、水 9 μL，總體積25 μL。擴(kuò)增反應(yīng)條件為：95 ℃變性15 s，95 ℃變性 20 s，52.8 ℃退火 20 s，72 ℃延伸 20 s，共40個(gè)循環(huán)。退火步驟檢測(cè)熒光信號(hào)。

1.2.5.2牛種、羊種、豬種多重實(shí)時(shí)多重PCR反應(yīng)條件。反應(yīng)體系為：Premix 12.5 μL，3對(duì)Primer F 分別為 0.5 μL，3對(duì) Primer R 分別為 0.5 μL，3對(duì)探針?lè)謩e為 0.5 μL、模板 2 μL、水 3.5 μL，總體積25 μL。退火步驟檢測(cè)熒光信號(hào)。

1.2.6熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。應(yīng)先將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照管、標(biāo)準(zhǔn)陰性對(duì)照管（NTC）、待檢測(cè)樣品管的其他組分，按優(yōu)化的反應(yīng)體系充分混勻，進(jìn)行第1次分裝；將標(biāo)準(zhǔn)品、NTC對(duì)照、待檢模板充分混均，分裝各管。此過(guò)程要確保相同處理，確保各管反應(yīng)液的均一性，確保各管加樣量一致。將已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒10倍稀釋后作為模板，進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，得到相應(yīng)的動(dòng)力學(xué)曲線，并計(jì)算產(chǎn)生相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.7重復(fù)性試驗(yàn)。用熒光定量PCR儀對(duì)3份不同拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，每個(gè)樣品重復(fù)3次；根據(jù)每個(gè)稀釋度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值進(jìn)行變異系數(shù)計(jì)算，以確定該方法的重復(fù)性。

1.2.8引物探針特異性檢驗(yàn)。應(yīng)用建立的多重PCR反應(yīng)體系，分別擴(kuò)增布魯氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和陰性對(duì)照菌株的DNA，以檢測(cè)試驗(yàn)的特異性。

1.2.9實(shí)時(shí)多重?zé)晒釶CR敏感性檢測(cè)

1.2.9.1單重實(shí)時(shí)熒光PCR的敏感性檢測(cè)。分別對(duì)牛種、羊種、豬種基因進(jìn)行檢測(cè)。將以3個(gè)基因?yàn)槟０蹇寺〉馁|(zhì)粒進(jìn)行10倍稀釋制得的梯度標(biāo)準(zhǔn)品，分別取2 μL進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。每個(gè)稀釋度做3個(gè)平行樣。

1.2.9.2多重實(shí)時(shí)熒光PCR敏感性檢測(cè)。在1個(gè)多重實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)體系中，將上述牛種、羊種、豬種3種基因的梯度標(biāo)準(zhǔn)品，分別取2 μL進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR。

1.2.10臨床樣品檢測(cè)。將臨床送檢的58份血樣，用常規(guī)SAT、RBPT、常規(guī)PCR以及熒光定量PCR方法進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的PCR鑒定

以提取的質(zhì)粒為模板，對(duì)牛種、羊種、豬種布魯氏菌重組陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行常規(guī)PCR鑒定。電泳可見(jiàn)有不同長(zhǎng)度的特異條帶出現(xiàn)（圖1）。通過(guò)設(shè)計(jì)特異性引物，能夠?qū)⑴７N、羊種、豬種布魯氏菌檢測(cè)出來(lái)。PCR擴(kuò)增大小為牛種86 bp、羊種67 bp、豬種80 bp。

圖1 含不同種屬的布魯氏菌重組質(zhì)粒PCR鑒定

2.2 重組質(zhì)粒的酶切鑒定

重組質(zhì)粒經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切后，獲得相應(yīng)大小的酶切片段（圖2）。

圖2 含不同種屬的布魯氏菌重組質(zhì)粒酶切鑒定

2.3 重組質(zhì)粒的測(cè)序結(jié)果

結(jié)果顯示，布魯氏菌目的片段已成功克隆在pMD18-T中，測(cè)序的3個(gè)布魯氏菌株P(guān)CR產(chǎn)物序列具有很高的同源性；該片段具有高度保守性；獲得的3個(gè)布魯氏菌重組質(zhì)?？勺鳛闊晒舛縋CR標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照品。將獲得的重組質(zhì)粒分別命名為pMD18-A、pMD18-M、pMD18-S。以下為測(cè)序結(jié)果：

pMD18-A（牛種布魯氏菌）：

tgtctgcctgcaggtcgacgattgcatgcgctatgatctggttacgtt aaatgcagacacgccctagaacgcctttcggaaggtcagattaagccgaa acggccccagccgctcatgctcgccagacttcaatggtagaataccgtga tagaaaagcaatctctagaggatc

pMD18-M（羊種布魯氏菌）：

cttgcatgcctgcaggtcgacgattcatgcgctatgatctggttacg ttgaatgcagacacgccctaggggtgaatctggaaattgtcagaaagaca gtgcttcgtcacgctagagcgctcgctgccatacttgcaacagtgacagcg ataattgccgttattggctggtggcagggcgaagattggcgggtaagctatt ccaatctcgctattgttaatggcgtctattggatattactgctctaccttctgtgg attattctgagccgaaacactaatctctagaggatcc

pMD18-S（豬種布魯氏菌）：

gccaagcttgcatgcctgcaggtcgacgattcatgcgctatgatct ggttacgttaaatgcagacacgccctaaaacccctgaaccttcagaaaac cgcgctttgcgcgttttccagaaacttgcccccaagcgataatgcattcacc accgcataagtagggtctaagccggatcgcagcaatcgtcatttgcatgttc cggtaatctctagaggatc

測(cè)序結(jié)果表明，用3種特異引物擴(kuò)增的片段是特異序列。其中，pMD18-A（牛種布魯氏菌）與GeneBank公布牛種布魯氏菌（ACCESSION：CP009099）序列同源性為100%；pMD18-M（羊種布魯氏菌）與GeneBank公布牛種布魯氏菌（ACCESSION：CP002931）序列同源性為100%；pMD18-S（豬種布魯氏菌）與GeneBank公布牛種布魯氏菌（ACCESSION：CP003128）序列同源性為99%。

2.4 質(zhì)粒濃度和純度的測(cè)定

提取的質(zhì)粒經(jīng)核酸蛋白分析儀測(cè)定，pMD18-A質(zhì)量濃度為389.5 ng/μL，其拷貝數(shù)為8.21×1010拷貝/μL；pMD18-M質(zhì)量濃度為412.4 ng/μL，其拷貝數(shù)為 6.45×1010拷貝 /μL；pMD18-S質(zhì)量濃度為367.6 ng/μL，其拷貝數(shù)為7.89×1010拷貝/μL；D260/D280值不低于1.80，符合純度要求。經(jīng)稀釋?zhuān)瞥?×1010～1×100的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照品，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 屬特異熒光定量PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

2.5.1引物濃度優(yōu)化。對(duì)牛種BCSP31基因引物濃度優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)8組濃度梯度的Ct值存在一定差異。根據(jù)最小Ct值和最小Ct值標(biāo)準(zhǔn)偏差觀察，發(fā)現(xiàn)350 nmol/L試驗(yàn)組擴(kuò)增曲線明顯優(yōu)于其他試驗(yàn)組的擴(kuò)增曲線，因此確定牛種的最佳引物濃度為350 nmol/L（表2、圖3）。

表2 不同引物、探針、dNTP濃度下PCR反應(yīng)條件優(yōu)化

圖3 牛種布魯氏菌引物濃度優(yōu)化結(jié)果

以同樣的方式確定豬種最佳引物濃度為350 nmol/L，羊種為300 nmol/L。

2.5.2探針濃度優(yōu)化。對(duì)牛種BCSP31基因探針濃度優(yōu)化結(jié)果進(jìn)行分析比較，發(fā)現(xiàn)5組濃度梯度的Ct值中，350 nmol/L試驗(yàn)組的Ct值和Ct值標(biāo)準(zhǔn)偏差最小，擴(kuò)增曲線明顯優(yōu)于其他試驗(yàn)組的擴(kuò)增曲線，因此確定牛種的最佳探針濃度為350 nmol/L（表2、圖4）。以同樣的方式確定豬種的最佳探針濃度為200 nmol/L，羊種為200 nmol/L。

圖4 牛種布魯氏菌探針濃度優(yōu)化結(jié)果

2.5.3退火溫度優(yōu)化。在體系各組分濃度最優(yōu)化后，將退火溫度設(shè)置為8個(gè)溫度梯度（55～65 ℃）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PLR擴(kuò)增；同一模板8個(gè)平行樣，進(jìn)行3次重復(fù)；對(duì)擴(kuò)增所得數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出反應(yīng)的最優(yōu)退火溫度（圖5）。

圖5 退火溫度優(yōu)化熒光定量PCR試驗(yàn)結(jié)果

2.5.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線。用3組引物和探針，分別檢驗(yàn)了牛種、羊種、豬種布魯氏菌和其他細(xì)菌的DNA，結(jié)果上述引物探針只對(duì)相應(yīng)種別的布魯氏菌DNA有特異熒光曲線生成，并給出了定量結(jié)果，對(duì)其他細(xì)菌和無(wú)模板對(duì)照（NTC）均無(wú)熒光曲線生成，亦無(wú)定量結(jié)果。選擇107、106、105、104、103拷貝/μL 6個(gè)梯度濃度的質(zhì)粒為模板，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。牛種特異性熒光定量PCR的相關(guān)系數(shù)R為0.996，擴(kuò)增效率不低于99%（圖6）。

圖6 標(biāo)準(zhǔn)品3次重復(fù)熒光定量PCR試驗(yàn)結(jié)果

2.6 引物探針特異性檢測(cè)

基于BCSP31基因片段設(shè)計(jì)的引物探針，對(duì)牛種、羊種、豬種布魯氏菌都有較好的擴(kuò)增信號(hào)，陰性菌株對(duì)照和空白對(duì)照均無(wú)擴(kuò)增信號(hào)（圖7、圖8）。

圖7 引物特異性擴(kuò)增曲線

圖8 種屬特異性擴(kuò)增曲線

2.7 實(shí)時(shí)單重?zé)晒舛縋CR敏感性試驗(yàn)

將已定量的牛種、羊種、豬種布魯氏菌陽(yáng)性質(zhì)粒 DNA 的 10 倍稀釋?zhuān)?.0×106～1.0×101拷貝 /μL）為模板進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果1.0×102拷貝/μL仍有熒光曲線，表明該方法檢測(cè)靈敏度為1.0×102拷貝/μL，并且重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于5%，說(shuō)明該方法具有良好的重復(fù)性（表3）。

表3 熒光定量PCR重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（3次重復(fù)循環(huán)閾值）

2.8 實(shí)時(shí)多重?zé)晒舛縋CR敏感性試驗(yàn)

將已定量的牛種、羊種、豬種布魯氏菌陽(yáng)性質(zhì)粒 DNA 的 10 倍稀釋?zhuān)?.0×106～1.0×101拷貝 /μL）為模板進(jìn)行擴(kuò)增。每個(gè)濃度3個(gè)重復(fù)，并對(duì)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果1.0×102拷貝/μL仍有熒光曲線，表明該方法檢測(cè)靈敏度為1.0×102拷貝/μL，并且重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于5%，說(shuō)明該方法具有良好的重復(fù)性（圖9）。

圖9 實(shí)時(shí)多重?zé)晒舛縋CR敏感性試驗(yàn)

2.9 實(shí)時(shí)多重?zé)晒釶CR臨床應(yīng)用檢測(cè)

將臨床送檢的58份血樣，用常規(guī)SAT、RBPT、常規(guī)PCR以及熒光定量PCR方法檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表4和圖10。

表4 常規(guī)SAT、RBPT、常規(guī)PCR以及熒光定量PCR方法檢測(cè)結(jié)果

圖10 布魯氏菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增曲線

上述檢測(cè)結(jié)果可知，在病原學(xué)檢測(cè)方面，普通PCR與熒光定量PCR檢測(cè)結(jié)果一致，沒(méi)有表現(xiàn)出優(yōu)勢(shì)，可能存在的主要原因：（1）血清中布魯氏菌的含量較高，達(dá)到普通PCR的檢測(cè)水平；（2）樣品采集的范圍小，相對(duì)較集中，群體之間沒(méi)有反應(yīng)出顯著差異。但與常規(guī)方法相比，熒光定量PCR可以通過(guò)1次反應(yīng)就能區(qū)分出各種屬布魯氏菌，省時(shí)省力，且降低了人為感染病原的風(fēng)險(xiǎn)。而常規(guī)方法則需要進(jìn)一步鑒定，才能達(dá)到區(qū)分種屬的目的。

3 討論

近年來(lái)，布魯氏菌病疫情呈反彈趨勢(shì)。據(jù)《獸醫(yī)公報(bào)》統(tǒng)計(jì)，布魯氏菌病為我國(guó)牛羊源人獸共患病發(fā)病報(bào)告最多的傳染病，且感染率與發(fā)病率呈現(xiàn)明顯上升趨勢(shì)[4]。自2000年以后，人間布魯氏菌病已成為報(bào)告發(fā)病數(shù)上升速度最快的傳染病之一[5]。帶菌動(dòng)物是其他動(dòng)物和人類(lèi)布魯氏菌病的主要傳染源。病原學(xué)監(jiān)測(cè)顯示，在我國(guó)引起人發(fā)病的布魯氏菌主要是羊種3型，其次是牛種[6]。在不同的國(guó)家和地區(qū)，以至在同一個(gè)國(guó)家的不同地區(qū)，各種動(dòng)物作為傳染源的意義也不盡相同[7]。因此，建立快速、靈敏、準(zhǔn)確性高的布魯氏菌種檢測(cè)方法，對(duì)于不同地區(qū)的流行病學(xué)、防控及風(fēng)險(xiǎn)分析具有重要意義。熒光定量 PCR 技術(shù)自建立以來(lái)，發(fā)展迅速、應(yīng)用廣泛。由于其具有定量、特異、靈敏和快速等特點(diǎn)，成為目前檢測(cè)目的核酸拷貝數(shù)的可靠方法，被廣泛應(yīng)用于動(dòng)物醫(yī)學(xué)和分子生物學(xué)研究領(lǐng)域。

我國(guó)用于布魯氏菌病診斷的方法大體有3類(lèi)：一是血清學(xué)檢測(cè)方法，也是主要的診斷方法，有平板凝集試驗(yàn)、試管凝集試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合試驗(yàn)及酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等。但血清學(xué)檢測(cè)存在特異性不強(qiáng)、敏感性差或操作煩瑣等缺點(diǎn)，且易受主觀意識(shí)影響，易出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性結(jié)果。二是細(xì)菌分離培養(yǎng)技術(shù)。它雖是細(xì)菌檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，但病原菌的分離耗時(shí)長(zhǎng)、技術(shù)復(fù)雜、檢出率低，也存在生物安全隱患。三是分子生物學(xué)診斷技術(shù)，如PCR方法以其靈敏、高效、省時(shí)省力、安全等優(yōu)點(diǎn)已被廣泛應(yīng)用于布魯氏菌鑒定。

本研究根據(jù)布魯氏菌保守基因，設(shè)計(jì)引物、合成探針，并建立了熒光定量分析體系。該檢測(cè)體系準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好，且表現(xiàn)出較好的檢測(cè)敏感性。當(dāng)血液中布魯氏菌病血清抗體水平或菌體載量較低時(shí)，血清學(xué)檢測(cè)和普通PCR會(huì)存在假陰性結(jié)果。熒光定量PCR快速檢測(cè)方法靈敏性高，在樣本中菌體含量很低的情況下，仍能檢測(cè)出菌體核酸，并且可對(duì)大量樣本進(jìn)行定性和定量分析[8]。其不僅可區(qū)分不同種屬布魯氏菌，而且能夠?qū)M織樣本中布魯氏菌載量進(jìn)行定量，同時(shí)在實(shí)驗(yàn)操作中減少了與病原接觸的幾率，降低了生物安全風(fēng)險(xiǎn)，因此該方法具有較好的潛在應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Establishment on Rapid Detection Method for Quantitative PCR of Brucella Strains

Liu Liya1，2，Lu Guili2，Wang Jie2，Shen Chenfeng2，Ma Xiaojing2，Xue Jing2，Ye Feng2，Yi Xinping2，Wang Jinquan1，Zhong Qi2
（1. College of Veterinary Medicine，Xinjiang Agricultural University，Urumqi，Xinjiang 830052；2. Veterinary Research Institute（Animal Clinical Medicine Research Center），Animal Science Academy of Xinjiang，Urumqi，Xinjiang 830000）

S851.3

A

1005-944X（2017）10-0065-07

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.019

新疆自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（KYGY2016020）；新疆自治區(qū)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)經(jīng)費(fèi)資助項(xiàng)目（KY2017004）

王金泉、鐘 旗