許宗麗，黃溢泓，李志源，劉針伶，周師師，覃艷然，邱 潔，盤美妮

（柳州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西柳州 545000）

豬偽狂犬病病毒LAMP可視化檢測(cè)方法的建立

許宗麗，黃溢泓，李志源，劉針伶，周師師，覃艷然，邱 潔，盤美妮

（柳州市動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，廣西柳州 545000）

根據(jù)GenBank中豬偽狂犬病病毒（PRV）gB基因的保守序列，設(shè)計(jì)一套特異性引物，在對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化后，建立了PRV環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）可視化檢測(cè)方法。結(jié)果顯示：該方法能在常規(guī)65 ℃水浴鍋中30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)對(duì)目的片段的特異性擴(kuò)增，并且可通過肉眼觀察顏色直接判定檢測(cè)結(jié)果；該方法具有很高的特異性，與豬瘟病毒、豬圓環(huán)病毒2型等均無交叉反應(yīng)；該方法的敏感性可達(dá)1 fg；將該方法應(yīng)用于臨床樣品檢測(cè)，結(jié)果與普通PCR方法一致。研究表明，本研究建立的LAMP方法簡(jiǎn)便、快速、靈敏、特異，適合基層PRV感染的快速檢測(cè)。

豬偽狂病病毒；環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）；檢測(cè)

Abstract：According to the sequences of PRV gB gene in GenBank，a set of primers was designed. After the optimization of the reaction conditions，a visualized LAMP for PRV was established. The results showed that the optimized detection assay could be conducted by incubating in the conventional water bath at 65℃ for 30min，and the result could be directly determined by visual observation. The assay was specific to PRV with a detection limit of 1 fg，and no crossreactivity with other pathogens of swine，including CSFV and PCV2. The results of detection of clinical samples by our LAMP approach were consistent with that of the ordinary PCR assay. These results suggested that the LAMP assay described in this study was a simple，rapid，specific method for detection of PRV in the field.

Key words：Pseudorabies virus；LAMP；detection

偽狂犬?。≒R）是一種以急性腦脊髓炎、發(fā)熱以及奇癢（豬除外）等為主要臨床癥狀的急性傳染病，由偽狂犬病病毒（PRV）引起，可危害多種家畜和野生動(dòng)物[1-2]。豬是PRV的傳染源和自然宿主，感染后表現(xiàn)為發(fā)熱，仔豬還表現(xiàn)神經(jīng)癥狀和高死亡率，大中豬表現(xiàn)呼吸癥狀，母豬出現(xiàn)流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、不育等臨床特征[3]。據(jù)鄧仕偉等[4]統(tǒng)計(jì)，2006年該病在我國(guó)29個(gè)省、香港特別行政區(qū)及臺(tái)灣發(fā)生。目前，PR的流行出現(xiàn)上升趨勢(shì)，成為養(yǎng)豬業(yè)中危害嚴(yán)重的疫病之一。

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP）是一種新型核酸擴(kuò)增技術(shù)，由Notomi等[5]于2000年研發(fā)成功。它通過識(shí)別靶序列上的8個(gè)特異區(qū)域和Bst DNA聚合酶在恒溫（60～65 ℃）下形成瀑布式的核酸高效擴(kuò)增。該技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、反應(yīng)快速、成本低廉和結(jié)果可視等優(yōu)點(diǎn)，目前被廣泛應(yīng)用于病毒、細(xì)菌、寄生蟲等病原體的檢測(cè)[6-10]。為了提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性及其效率、降低檢測(cè)成本，本研究所采用LAMP技術(shù)對(duì)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和實(shí)驗(yàn)條件要求不高，適合養(yǎng)殖場(chǎng)和基層獸醫(yī)站快速準(zhǔn)確檢測(cè)的方法。

1 材料和方法

1.1 主要試劑

MgSO4、Bst DNA聚 合 酶（ 大 片 段）、Betaine，購(gòu)自New England Biolabs公司；TIANamp血液/細(xì)胞/組織 基因DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根公司；RNA提取試劑TRIzol LS Reagent，購(gòu)自Invitrogen公司。

1.2 病毒株

豬瘟病毒（CSFV）、豬圓環(huán)病毒2型（PCV-2）、豬藍(lán)耳病毒（PRRSV）和豬偽狂病毒（PRV-2015）等，由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；豬O型口蹄疫病毒（FMDV-O）滅活疫苗，由本單位疫苗室保管。

1.3 引物設(shè)計(jì)和合成

下載GenBank中的PRV gB基因序列，利用Lasergene軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，在保守區(qū)運(yùn)用在線軟件Primer Ex-plorer V4設(shè)計(jì)LAMP引物（表1）。引物由上海Invitrogen公司合成。

表1 LAMP引物序列

1.4 核酸的提取和模板的制備

對(duì)PCV-2和PRVDNA的提取，參照TIANamp血液/細(xì)胞/組織基因DNA提取試劑盒說書進(jìn)行；對(duì)CSFV、PRRSV、FMDV-O疫苗株的RNA抽提，按照TRIzol LS Reagent使用說明書進(jìn)行，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，-70 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

PRV模板標(biāo)準(zhǔn)品的制備：用試劑盒回收B3、F3引物，擴(kuò)增PRV PCR產(chǎn)物，與pGM18-T載體鏈接，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)品重組質(zhì)粒pGM-PRV；提取質(zhì)粒，通過紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度。

1.5 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

對(duì)反應(yīng)體系在如下范圍內(nèi)進(jìn)行優(yōu)化：FIP/BIP引物終濃度 1.6 μmol/L、B3/F3 引物 0.2 μmol/L、LF/LB 0.8 μmol/L，Bst DNA 聚 合 酶（8 U/μL）1 μL、10×Bst buffer 2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）3.5 μL、Betaine（1 mol/L）1～7 μL、MgSO4（100 mmol/L）1.5 μL、Calcein（625 μmol/L）、MnCl2（12.5mmol/L）各 1 μL、模板 DNA 1 μL，加水至 25 μL。用水替代模板DNA，設(shè)陰性對(duì)照管。在水浴鍋中65 ℃反應(yīng)60 min，12 ℃ 4 min冷卻，多次重復(fù)試驗(yàn)后確定Betaine最佳反應(yīng)用量。根據(jù)Betaine的最佳用量，以上其他反應(yīng)條件不變，MgSO41～7 μL，多次重復(fù)試驗(yàn)后確定最佳反應(yīng)用量。根據(jù)Betaine、MgSO4的最佳用量，以上其他反應(yīng)條件不變，將溫度按59 ℃～67 ℃依次遞增，多次重復(fù)試驗(yàn)后確定最佳退火溫度。

1.6 特異性和靈敏度檢驗(yàn)

利用優(yōu)化好的LAMP反應(yīng)體系，對(duì)CSFV、豬細(xì)小病毒（PPV）、PRRSV、PCV-2和FMDV-O的疫苗毒株進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用水替代模板，設(shè)陰性對(duì)照管，檢驗(yàn)LAMP方法的特異性；使用Beckman UV-800紫外分光光度計(jì)測(cè)定PRV的DNA濃度，并按10倍遞增稀釋；對(duì)各濃度DNA用LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用水替代模板，設(shè)陰性對(duì)照管，并用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增；按照1.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察結(jié)果確定該方法的靈敏度。

1.7 臨床樣品的檢測(cè)

對(duì)2016年柳州市各養(yǎng)殖場(chǎng)送來的28份豬腦組織樣品同時(shí)進(jìn)行PCR和LAMP檢測(cè)，來驗(yàn)證所建立方法的臨床運(yùn)用效果。PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR mix 12.5 μL， 上 下 引 物 F3/B3各0.5 μL，模板 1 μL，補(bǔ)充水至 25 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃ 3 min ，94 ℃ 45 s，60 ℃ 45 s，72 ℃1 min，35個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。擴(kuò)增的目的片段為gB基因，長(zhǎng)度為209 bp。

2 結(jié)果

2.1 LAMP反應(yīng)條件的優(yōu)化

通過對(duì)各反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定LAMP反應(yīng)體系為25 μL：FIP/BIP引物終濃度 1.6 μmol/L、B3/F3 引物 0.2 μmol/L、LF/LB 0.8 μmol/L，Bst DNA 聚合酶（8 U/ul）1 μL、10×Bst buffer 2.5 μL、dNTPs（10 mmol/L）3.5 μL、Betaine（1 mol/L）5 μL、MgSO4（100 mmol/L）1.5 μL、Calcein（625 μmol/L）、MnCl2（12.5 mmol/L）各 1 μL、模板 DNA 1 μL（14 ng/μL，加水至25 μL。用水替代模板DNA，設(shè)陰性對(duì)照管。充分混勻后，在水浴鍋中65 ℃反應(yīng)30 min，12 ℃4 min冷卻。反應(yīng)后肉眼可見陽性管溶液變綠，陰性對(duì)照管溶液為較淺的桔紅色（圖1-A）；反應(yīng)液瓊脂糖凝膠電泳后的陽性管呈現(xiàn)出特征性梯形條帶（圖1-B）。

圖1 LAMP方法的優(yōu)化結(jié)果

2.2 特異性檢驗(yàn)

用本研究建立的LAMP方法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)只有PRV為陽性（肉眼觀察可見翠綠色，瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)特征性梯形條帶），而CSFV、PPV、PRRSV、FMDV-O（疫苗株）和PCV-2均為陰性（圖2）。

圖2 LAMP方法檢測(cè)特異性

2.3 靈敏度檢驗(yàn)

該方法對(duì)PRV的最小檢測(cè)限為1 fg（圖3），靈敏度是常規(guī)PCR方法的100倍（圖4）。

2.4 臨床樣品的檢測(cè)

在2016年柳州市各養(yǎng)殖場(chǎng)送來的28份腦組織樣品中，用所建立的方法檢測(cè)出12份陽性。該結(jié)果與普通PCR結(jié)果一致，說明LAMP方法可以用于臨床檢測(cè)。

圖3 LAMP方法檢測(cè)的靈敏度

3 討論

目前，PR在世界多個(gè)區(qū)域流行，給養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)是養(yǎng)豬業(yè)大國(guó)，也面臨同樣嚴(yán)峻的PR疫情。相關(guān)資料表明，我國(guó)有50%左右的規(guī)?；i場(chǎng)存在PRV野毒感染，散養(yǎng)戶的感染情況更為嚴(yán)重[11。如何防治和凈化PR成為國(guó)內(nèi)養(yǎng)豬業(yè)專家、技術(shù)人員及學(xué)者共同關(guān)注的話題。快速診斷技術(shù)在PR的防治中起至關(guān)重要的作用。

LAMP技術(shù)是新型的核酸擴(kuò)增技術(shù)，不需要特殊的儀器設(shè)備，在水浴鍋即可完成。在有熒光染料的條件下，反應(yīng)結(jié)果可肉眼觀察。本研究根據(jù)GenBank中PRV gB基因保守序列，優(yōu)化反應(yīng)條件，建立了PRV LAMP檢測(cè)方法。本研究建立的PRV LAMP檢測(cè)方法，具有較高的靈敏性，DNA的最小檢測(cè)量為1 fg。楊睿等[12]、王樹芬等[13]分別根據(jù)PRV gE和DBP基因保守序列建立了LAMP方法。他們建立的體系反應(yīng)時(shí)間均為40 min。本研究根據(jù)gB基因建立的方法，只需要在65 ℃等溫條件30 min內(nèi)就可觀察結(jié)果，表明建立的方法更快速。楊睿等[12]、張莉等[14]均選用SYBR Green I為染料，建立了PR可視化檢測(cè)方法；王淑芬等[13]用一種新的熒光染料——羅丹明B衍生物作為指示劑。當(dāng)其由紫色變成藍(lán)色時(shí)為陽性，因而避免了反應(yīng)后開蓋加入染料造成的假陽性。本研究使用Calcein+MnCl直接加入反應(yīng)液中，反應(yīng)后陽性由桔紅色變?yōu)榇渚G色，更直觀，因此開闊了不同反應(yīng)指示劑在PR LAMP快速檢測(cè)中的應(yīng)用空間。應(yīng)用所建立的方法對(duì)CSFV、PPV、PRRSV和PCV-2和FMDV-O（疫苗）等5種核酸進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果都為陰性。用該方法和PCR方法對(duì)28份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)結(jié)果完全一致。這表明所建立的LAMP方法可用于臨床樣品的檢測(cè)。此外，所建立的PRV LAMP檢測(cè)方法，操作簡(jiǎn)單，僅需1臺(tái)水浴鍋，通過肉眼觀察顏色變化，便可直接判定結(jié)果，適合基層的快速檢測(cè)，在PR的診斷和凈化方面具有廣闊的應(yīng)用前景。

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（責(zé)任編輯：朱迪國(guó)）

Establishment of a Visualized LAMP Method for Detection of Pseudorabies Virus

Xu Zongli，Huang Yihong，Li Zhiyuan，Liu Zhenling，Zhou Shishi，Qin Yanran，Qiu Jie，Pan Meini
（Liuzhou Animal Disease Prevention and Control Center，Liuzhou，Guangxi 545000）

S851.3

A

1005-944X（2017）10-0079-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.022

廣西柳州科技項(xiàng)目（2015E040501）

黃溢泓