林穎崢，林士佳，張冠楠，李樹清，熊 煒，郭雨雁，嚴(yán)亞賢

（1.上海交通大學(xué)，上海 200240；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135）

野兔熱快速檢測方法的建立

林穎崢1，林士佳2，張冠楠2，李樹清2，熊 煒2，郭雨雁2，嚴(yán)亞賢1

（1.上海交通大學(xué)，上海 200240；2.上海出入境檢驗檢疫局，上海 200135）

野兔熱是由土拉弗朗西斯菌引起的兔的一種高度接觸性、致死性傳染病。為加強口岸對進境野生及實驗用兔中野兔熱的篩查和流行病學(xué)調(diào)查，基于土拉弗朗西斯菌保守基因序列，建立了PCR和實時PCR檢測野兔熱的方法。將建立的方法應(yīng)用于臨床樣品檢測發(fā)現(xiàn)經(jīng)PCR檢測，僅有土拉弗朗西斯菌DNA出現(xiàn)條帶單一的特異性基因擴增，經(jīng)實時PCR檢測，土拉弗朗西斯菌DNA在10～12個循環(huán)處出現(xiàn)顯著擴增，對照病毒樣品未見擴增；PCR檢測土拉弗朗西斯菌DNA模板的下限量為100～10 pg，而實時PCR檢測的下限量為100～10 fg。檢測結(jié)果證實兩種檢測方法具有良好的特異性、靈敏性和穩(wěn)定性，適合應(yīng)用于野兔熱的快速檢測。

野兔熱；PCR；Real-time PCR；Taqman探針

Abstract：Tularemia is a highly contagious and lethal disease caused by Francisella tularensis. In order to investigate the epidemic character of Tularemia transmission among wild and experimental rabbits，methods of PCR and Real-time PCR to detect Tularemia were established，based on the conserved sequence of Francis tularensis strains. Both methods were applied to test clinical samples. By PCR detection，only Francis tularensis single band DNA showed bacteria specific gene amplification. By real-time PCR detection，tularemia bacteria DNA in 10-12 cycles Francis appeared significant amplification，and no amplification was found in the control virus samples. The lower limit of the amount of CR detected DNA template for tularemia bacteria Francis was 100-10 pg，and the lower limit of real-time PCR detection was 100-10 fg. The results showed that PCR and Real-time PCR methods were specific，sensitive and reproducible，thus both methods were suitable for Tularemia rapid detection.

Keywords：Tularemia；PCR；real-time PCR；taqMan probe

野兔熱（Tularaemia）又稱兔熱病、土拉熱、土拉桿菌病、土拉弗氏菌病，是由土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）感染引起的一種急性人獸共患傳染病。1912年，McCoy從美國土拉縣的黃鼠中分離出該菌，并根據(jù)該地名將其命名為土拉菌。1919年，美國華盛頓公共衛(wèi)生官員Francis被派到猶他州調(diào)查鹿蠅熱病期間，對該菌做了大量的研究工作。鑒于其貢獻，將該菌重命名為土拉弗朗西斯菌。根據(jù)菌株對家兔的毒力和能否分解甘油，將全世界已知菌株分為3個地理變種：美洲變種，能分解甘油，毒力最強；歐亞變種，大多不分解甘油，毒力較弱；中亞變種，能分解甘油，但毒力弱。該病以體溫升高、皮膚潰瘍、肝脾壞死、淋巴結(jié)腫大、呼吸道和消化道炎癥為主要特征，主要通過排泄物污染的飼草、飲水、用具及吸血節(jié)肢動物等媒介傳播，一般在夏季多發(fā)[1-7]。

野兔熱多數(shù)發(fā)生在北半球國家，流行于北緯30o～71o 地區(qū)。我國于1957年在內(nèi)蒙古通遼地區(qū)首次發(fā)現(xiàn)野兔熱病例，并從病人和死亡黃鼠體內(nèi)分離到本病病原體[8]；1959年，我國第1例人野兔熱病例在黑龍江省被報道[9]；1983年，相繼在青海、西藏、新疆等地，分別從人、野兔、硬蜱中分離出該菌[10-11]；1986年，山東省膠南縣某野兔肉加工廠暴發(fā)野兔熱疫情，10 d之內(nèi)發(fā)病31人；1992年，從西藏地區(qū)銀盾革蜱中發(fā)現(xiàn)10多株土拉弗朗西斯菌。199l—1993年，劉增加等[12]在甘肅省西部祁連山和南部迭部林區(qū)發(fā)現(xiàn)人群中存在野兔熱的隱性感染，血清陽性率分別為9.8%、10.3%。之后我國其他地區(qū)陸續(xù)發(fā)現(xiàn)存在土拉弗朗西斯菌感染和其自然疫源地。近幾年，該病在我國報道較少，在世界其他地區(qū)也以散發(fā)為主，但有小規(guī)模的暴發(fā)流行。

鑒于野兔熱危害較大，我國將其列為二類動物疫病。目前檢測野兔熱的方法主要有血象檢查、皮內(nèi)試驗、病原分離鑒定、免疫熒光抗體試驗、血清凝集試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗等。由于受試樣本的局限性，且傳統(tǒng)檢測方法存在操作繁瑣、耗時較長、靈敏度較低等問題[13-15]。為了加強口岸對進境野生及實驗用兔的野兔熱篩查和流行病學(xué)調(diào)查，本研究建立了PCR和實時PCR快速高通量檢測方法，并對所建立核酸檢測方法的特異性和靈敏性進行了評估。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

TRIzol購自Invitrogen公司；DNA提取試劑盒購自QIAGEN公司；Taq酶、AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、dNTP、隨機引物、DNA Marker（DL2000）購自TaKaRa公司。

1.2 陽性樣品來源及處理

本研究使用的土拉弗朗西斯菌菌株（AFTC410062）由上海出入境檢驗檢疫局保存；其他兔病對照病毒由上海實驗動物研究中心保存。根據(jù)樣品核酸性質(zhì)，分別進行核酸分離，提取制備成DNA或cDNA模板備用。

1.3 PCR檢測

基于土拉弗朗西斯菌保守基因序列設(shè)計PCR引物，擴增基因片段大小為663 bp。上游引物：5′-ATC AGA AGG AAC ACC AAT GGC GAA G-3′；下游引物：5′-GTA TTC TGA CCT GCG ATT ACT AGC GA-3′。在PCR薄壁管中，加模板2 μL、10×Taq 酶濃縮緩沖液 2.5 μL、dNTP 0.5 μL、上下游引物各0.25 μL、Taq酶0.25 μL，加水補足至總體積25 μL。將PCR管置PCR儀上，按如下程序擴增：首先94 ℃預(yù)變性3 min；然后94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸 40 s，35個循環(huán)；最后72 ℃延伸3 min。將PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳后，用凝膠成像系統(tǒng)拍攝。

1.4 實時PCR引物和TaqMan探針

基于土拉弗朗西斯菌保守基因序列，用Primer Express軟件設(shè)計實時PCR引物和TaqMan探針。上游引物：5′-GCA TGT GGT TTA ATT CGA TGC A-3′；下游引物：5′-GAA AGT TCG CAG GAT GTC AAG A-3′；TaqMan 探 針：FAM 5′-CGC GAA GAA CCT TAC-3′MGB。

1.5 實時PCR檢測

采用ABI公司ViiA7熒光PCR儀。反應(yīng)體系：dNTP 0.5 μL、Taq 酶 0.25 μL、10×Taq 酶 濃縮緩沖液 2.5 μL、上下游引物各 0.25 μL、模板 1 μL、TaqMan探針0.25 μL，加水補足至總體積25 μL。反應(yīng)條件：首先95 ℃預(yù)變性3 min；然后95 ℃ 15 s，58 ℃ 45 s，40個循環(huán)。在每個循環(huán)第2步收集熒光信號。

2 結(jié)果

2.1 PCR和實時PCR檢測野兔熱的特異性

基于土拉弗朗西斯菌保守基因序列，設(shè)計引物和探針，分別建立PCR和實時PCR檢測方法，并使用不同兔病病毒（兔病毒性出血癥病、兔痘病、兔纖維瘤病、兔粘液瘤病、兔水皰性口炎?。┳鳛閷φ眨瑴y試這兩種檢測方法的特異性。結(jié)果顯示：經(jīng)PCR檢測，僅有土拉弗朗西斯菌DNA出現(xiàn)條帶單一的特異性基因擴增，其他對照樣品均呈陰性（圖1）；經(jīng)實時PCR檢測，土拉弗朗西斯菌DNA在10～12個循環(huán)處出現(xiàn)顯著擴增，對照病毒樣品未見擴增（圖2）。

圖1 常規(guī)PCR特異性檢測

圖2 實時PCR特異性檢測

2.2 PCR和實時PCR檢測野兔熱的靈敏性

為測試所建立的PCR和實時PCR方法的靈敏性，將土拉弗朗西斯菌DNA進行定量并梯度稀釋，制備濃度分別為 10 ng/μL、1 ng/μL、100 pg/μL、10 pg/μL、1 pg/μL、100 fg/μL、10 fg/μL、1 fg/μL 的模板，再分別用建立的兩種方法進行檢測。結(jié)果顯示，PCR檢測土拉弗朗西斯菌DNA模板的下限量為100 ～ 10 pg（圖3），而實時PCR檢測土拉弗朗西斯菌DNA模板的下限量為100～10 fg（圖4）。

3 討論

野兔熱是兔的主要疫病之一，危害嚴(yán)重，一旦感染較難從兔群中清除，從而影響實驗動物質(zhì)量，干擾實驗結(jié)果，是實驗動物養(yǎng)殖和使用中重點防范的疫病。數(shù)十年來，學(xué)者們對土拉弗朗西斯菌的病原學(xué)特性和診斷方法進行了深入研究。將感染動物病料進行病原分離鑒定，是診斷野兔熱最傳統(tǒng)、最經(jīng)典的方法。但土拉弗朗西斯菌對營養(yǎng)需求較高，生長速度緩慢，菌體偏小，分離困難，耗時較長，而且容易引起實驗室感染。也可用抗表面抗原特異性熒光抗體檢測病料或血液涂片，但其靈敏性和特異性不甚理想，且抗體通常在10 d左右才能達(dá)到診斷水平，檢測特異性抗體的方法同樣需要在2周之后才能使用。血清凝集試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗是檢測野兔熱常用的血清學(xué)方法，其敏感性高、操作簡便，但僅能檢測血清樣本，無法直接檢測體液和動物組織樣本，無法進行野兔熱的早期診斷[16-20]。

圖3 常規(guī)PCR敏感性檢測

圖4 實時PCR敏感性檢測

為了滿足口岸對大量野生、實驗用兔及兔產(chǎn)品入境快速檢疫的需要，本研究基于土拉弗朗西斯菌基因保守序列，建立了PCR和實時PCR快速核酸檢測方法，證實PCR方法能有效擴增土拉弗朗西斯菌的特異性基因片段，實時PCR方法檢測陰性和陽性樣品熒光信號區(qū)分顯著。將兩種檢測方法的靈敏性進行對比，證實實時PCR方法的檢測下限比PCR方法提高了3個數(shù)量級。此外，與PCR方法相比，實時PCR方法操作更簡便，檢測周期更短，適合用于野兔熱的快速高通量篩檢。由于野兔熱隱性感染率較高，采用靈敏度高的檢測方法有助于提高隱性感染的檢出率，可以做到早發(fā)現(xiàn)、早隔離，從而幫助實現(xiàn)盡可能降低損失、控制野兔熱傳入及傳播的目的。

[1] 王洪強. 野兔熱及其防治[J]. 山東畜牧獸醫(yī)，2011，32（9）：79-80.

[2] 唐家琪. 自然疫源性疾病[M]. 北京：科學(xué)出版社，2005：839-857.

[3] 方美玉，林立輝，劉建偉. 蟲媒傳染病[M]. 北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)出版社，2005：331-340.

[4] 劉增加. 蜱與疾病關(guān)系[M]//李朝品，主編. 醫(yī)學(xué)蜱螨學(xué).北京：人民軍醫(yī)出版社，2006：83-104.

[5] 宮英，逄增昌，強新. 土拉弗氏菌病的研究進展[J]. 預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇，2006，12（1）：76-78.

[6] 湯永健. 野兔熱的診斷及其綜合防治[J] . 農(nóng)業(yè)災(zāi)害研究，2016，6（2）：21-23.

[7] DENNIS D T，INGLESBY D A，HENDERSON D A，et al.Tularemia as a bio-logical weapon：medical and public health management[J]. JA-MA，2001，285（21）：2763-2767.

[8] 內(nèi)蒙古自治區(qū)鼠疫防治所. 從黃鼠體內(nèi)分離出土拉弗氏菌的報告[J]. 鼠疫叢刊，1958（2）：4-10.

[9] 康成貴. 我國首次發(fā)現(xiàn)人間土拉弗氏菌病的流行病學(xué)調(diào)查報告[J]. 流行病學(xué)雜志，1980，1（4）：248-250.

[10] 王文華. 從青海柴達(dá)木盆地灰尾兔體內(nèi)分離出土拉弗氏菌的報告[J]. 流行病學(xué)雜志，1980，1（4）：245-247.

[11] 郭從厚. 西藏地區(qū)土拉弗氏菌病初步調(diào)查[J]. 中華流行病學(xué)雜志，1981，2（2）：176-181.

[12] 劉增加，王大虎. 祁連山地區(qū)人土拉菌病血清流行病學(xué)調(diào)查[J]. 中國公共衛(wèi)生，1995，11（7）：320.

[13] 魯志新，胡曉芳，賈立輝. 旅游與自然疫源性疾病[M].沈陽：遼海出版社，2008：214-222.

[14] 張啟恩，魯志新，韓光紅. 我國重要自然疫源地與自然疫源性疾病[M]. 沈陽：遼寧科學(xué)技術(shù)出版社，2003：141-146.

[15] 張芳. 我國土拉弗氏菌分子流行病學(xué)調(diào)查研究[C]//軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院. 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病調(diào)查研究論文集. 北京：軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2008：18-43.

[16] 魏嘉良，孟慶峰，王偉利，等. 土拉菌病國內(nèi)外流行情況與診斷的研究進展[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報，2012，28（29）：29-33.

[17] 王振東，景瀅瀅，王靜. 土拉弗朗西斯菌檢測研究進展[J].生物磁學(xué)，2009，9（14）：2763-2765.

[18] 張常印，唐泰山，陳國強，等.野兔熱病原分離鑒定操作規(guī)程：SN/T 1501—2004[S]. 北京：中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2004.

[19] VERSAGE J L，SEVERIN D D M，CHU M C，et al.Development of a multitarget real-time TaqMan PCR assay for enhanced detection of Francisella tularensis in complex specimens[J]. Journal of clinical microbiology，2003，41（12）：5492-5499.

[20] KUGEIER K J，MEAD P S，MCGOWAN K L，et al.Isoiation and characterization of a novel Francisella sp.from human cerebro-spinal fluid and blood[J]. J Clinic Microbiol，2008，46（7）：2428-2431.

（責(zé)任編輯：朱迪國）

Establishment of Rapid Detection Methods for Tularemia

Lin Yingzheng1，Lin Shijia2，Zhang Guannan2，Li Shuqing2，Xiong Wei2，Guo Yuyan2，Yan Yaxian1
（1. Shanghai Jiaotong University，Shanghai 200240；2. Shanghai Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Shanghai 200135）

S852.65

B

1005-944X（2017）10-0094-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.025

國家重點研發(fā)計劃項目（2016YFC1202000、2016YFC1202004）；上海出入境檢驗檢疫局科研專項（編號HK001-2014）