王海艷，趙林立，趙治國，郭文秀，陳宇飛，劉 佳，任彩霞，敖威華，馬彩霞

（內蒙古出入境檢驗檢疫局，內蒙古呼和浩特 010020）

布魯氏菌野毒株A544和疫苗株104M差異蛋白的表達及抗體制備

王海艷，趙林立，趙治國，郭文秀，陳宇飛，劉 佳，任彩霞，敖威華，馬彩霞

（內蒙古出入境檢驗檢疫局，內蒙古呼和浩特 010020）

選取布魯氏菌差異蛋白部分基因序列，將其克隆到表達載體pGEX-6p-1中；經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定和序列測定，得到重組質粒pGEX-6p-1-bru；將重組質粒轉化到Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞中，用1 mmol/L 異丙基硫代-B-D-半乳糖苷（IPTG）對轉化菌進行誘導表達，并用表達蛋白制備多克隆抗體。結果：差異蛋白在體外獲得了高效表達，表達融合蛋白分子量約為35 kD；誘導5 h后表達量最高，占菌體總蛋白的30%左右；表達蛋白能與多克隆抗體發(fā)生免疫印跡反應，證明所表達的蛋白具有良好的免疫原性。該研究結果為免疫學檢測方法的建立奠定了基礎。

差異蛋白；布魯氏菌野毒株A544；布魯氏菌疫苗株104M；表達；抗體制備

Abstract：The variant protein gene from Brucella bovis virulent strain was cloned into the pGEX-6p-1 expression vector. The recombinant plasmid pGEX-6p-1-bru was transformed into E coli Rosetta（DE3）for expression after being identified by PCR，enzyme digestion and sequencing. The transformed bacteria were cultivated and induced with 1 mmol/L isoproyhhio-B-D-galactoside（IPTG），and polyclonal antibody was prepared by the expression protein.The results showed the variant protein was expressed efficiently in fusion protein form，the molecular weight of the fusion protein was 35 kD，the expression level of the fusion protein was the highest after exposure to IPTG for 5 h and accounted for approximately 30% of the total cellular proteins. The expression protein could react with polyclonal antibody，showing that the recombinant protein had a good immunogenicity. This result was a better basic for immunological detection research on Brucellosis.

Key words：variant protein；Brucella bovis virulent strain A544；Brucella abortus vaccine strain 104M；expression；antibody preparation

布魯氏菌?。ㄒ韵潞喎Q布?。槿双F共患傳染病，是我國二類傳染病，主要引起母畜流產(chǎn)及其他并發(fā)癥[1]。1990年，布魯氏菌在海洋哺乳動物中被分離到，從而改變了人們一直認為布病主要在陸地動物中分布的認識，也使人們對布病的控制措施進行了相應調整[2]。自20世紀90年代開始，布病疫情有回升勢頭。全球40～50個國家和地區(qū)的布病疫情出現(xiàn)不同程度的波動。目前，布病疫情回升的地區(qū)主要集中在非洲、亞洲、南美洲及歐洲的部分地區(qū)[3]。目前，全球布病患病總人數(shù)約有600萬，年新發(fā)病人數(shù)約50萬[4-5]。

為了建立布病自然感染與疫苗免疫的鑒別診斷方法，本研究先利用比較蛋白質組學研究技術，選出野毒株A544和疫苗株104M差異蛋白；然后在A544株中高表達的赤蘚糖醇轉錄調節(jié)子（蛋白編碼BruAb2-0365）蛋白中，選出與其它野毒株同源性高、與疫苗株同源性低、抗原表位信號強、包含重要抗原決定簇的序列部分片段，利用pGEX-6P-1表達載體，對其進行體外表達。

1 材料和方法

1.1 載體、菌株

表達載體pGEX-6P-1質粒、表達菌株Rosetta（DE3），均購自上海基音生物有限公司。

1.2 主要試劑

異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）、Ex Taq酶、T4 DNA連接酶及BamH I和 XholI限制性內切酶，購自Takara公司；質粒DNA提取試劑盒與膠回收試劑盒，購自Takara公司；羊抗兔IgG辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體、四甲基聯(lián)苯胺（TMB）緩沖溶液，購自Sigma公司；重組蛋白純化系統(tǒng)GSTrap FF，購自美國GE公司；LB培養(yǎng)基，購自陸橋公司；葡聚糖凝膠G-20000，購自上?；瘜W試劑廠；弗氏完全佐劑（CAF）和弗氏不完全佐劑（IAF），購自GIBCO公司；硫酸銨，購自中國金山化工廠。

1.3 開放閱讀框的選擇與引物設計合成

對選取的序列（GGGTGCGACCTCGCAATAATCGAGGCCGTAAAGATCGGCCAGACGGTTTTCCAGATCGATGCATTCGGTGATGTCACCGTCGATGGTCACTTTCACCGCGCCGTCGGCAACGGCCTTGGCGATGAGACGATGCGCTTTCACCGAAGGCAGGCCAAGGCGCTTGGCAACGGCAGACTGAGTCATGCCGGCGACGAAATGAAGCCAGGCGGCGCGAAGCGCCAGAGAATCGTCTGCATCTGC）上游加起始密碼子（ATG）和EcoRI酶切位點（GAATTC），下游加Xho I酶切位點（CTCGAG）。利用Oligo 6.0軟件設計1對擴增此片段的引物：上游引物為5′-GAATTCATG GCAGCTCTCCTTGTAG-3′，下游引物為5′-CTCGAGGCAGATGCAGACGATT-3′。引物由上?；羯镉邢薰竞铣伞?/p>

1.4 表達載體的構建及鑒定

以布魯氏菌野毒株A544的DNA為模板，經(jīng)PCR擴增，BamH I/XholI雙酶切回收純化后，將其定向連接到經(jīng)EcoR I/XholI雙酶切的pGEX-6p-1表達載體中，并轉化到表達菌株BL21（DE3）Plys細胞中；對提取的質粒，經(jīng)PCR鑒定和酶切鑒定正確后，選取陽性菌進行測序；將重組質粒命名為pGEX-6p-1-bru。PCR鑒 定 反 應 體 系：Ex Taq（5 U/μL）0.5 μL、10×Ex Taq Buffer 5 μL、dNTP（2.5 mmol/L）5 μL、 上 下 游 引 物（25 nmol/μL） 各 1 μL、質粒 0.5 μL，加水至 50 μL。PCR 反應條件：94 ℃ 1 min；94℃ 45 s，54 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min。酶切鑒定反應體系：10×Buffer for EcoR I 2 μL，EcoR I 和 XholI酶各 0.5 μL，BSA 0.5 μL、質粒 7 μL，加水至20 μL。

1.5 pGEX-6p-1-bru重組蛋白不同時間的誘導表達及SDS-PAGE電泳分析

用陽性重組質粒pGEX-6p-1-bru（或空質粒pGEX-6p-1）轉化表達菌株Rosetta（DE3）感受態(tài)細胞，挑取單菌落，將其加入到10 mL含氨芐青霉素的液體LB中，37 ℃培養(yǎng)過夜增菌。取3 mL細菌培養(yǎng)物接種到50 mL含氨芐青霉素的LB中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.6～1.0時，加誘導劑IPTG至終濃度為1.0 mmol/L。37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)，分別于2、3、4 、5 h后，各取1.5 mL菌液離心，收集細菌沉淀，用PBS洗2遍；加入150 μL 1×SDS-PAGE凝膠加樣緩沖液，煮沸10 min；冰浴5 min后，取15 μL經(jīng)15 %分離膠的SDS-PAGE電泳分析。將未加入誘導劑的細菌培養(yǎng)液培養(yǎng)5 h，作空白對照。

1.6 重組蛋白的親和純化

按照GSTrap FF親和純化系統(tǒng)的操作說明書進行。

1.7 多克隆抗體的制備

簡單步驟：將蛋白大量表達，并用蛋白純化柱進行純化；取500 μg純化蛋白溶于2 mL 弗氏完全佐劑中，使之充分乳化；皮下多點注射新西蘭家兔。加強免疫時用弗氏不完全佐劑，抗原劑量為首次的1/4。每2～3周加強免疫1 次。在第1 次加強免疫后2 周，從耳緣靜脈取血2～3 mL，分離血清；用間接ELISA法檢測抗體效價，至抗體效價達到1:10 000以上。2 周后取血約50 mL，室溫凝固后，4 ℃冷藏4 h，離心分離血清。

1.8 Western blot分析

將細菌裂解物，經(jīng)SDS-PAGE分析后，再轉移到硝酸纖維素膜上；用5%脫脂奶室溫封閉3 h（或4 ℃過夜），用PBST洗3次；加多克隆抗體（1:100倍稀釋）室溫作用1 h，PBST緩沖液洗3次；加入羊抗兔IgG辣根過氧化物酶（HRP）標記抗體 （1:2 500倍稀釋），37 ℃作用30 min，用PBST緩沖液洗3次；在四甲基聯(lián)苯胺（TMB）緩沖溶液中顯色1 min。

2 結果

2.1 表達載體的構建及鑒定

將PCR擴增產(chǎn)物定向連接到pGEX-6p-1表達載體，然后轉化到表達菌株Rosetta（DE3）細胞中。對選取的陽性質粒，經(jīng)PCR鑒定，可擴增出約240 bp的片段。酶切鑒定結果與預期結果相符，測序結果也與提供的序列完全一致（圖1、圖2和圖3）。

圖1 陽性質粒PCR鑒定結果

圖2 陽性質粒酶切鑒定結果

圖3 陽性質粒測序結果

2.2 表達蛋白的SDS-PAGE電泳及Western blot分析結果

將不同時間誘導的菌體裂解后進行SDSPAGE電泳及Western blot分析，結果表明：差異片段在體外獲得了高效表達，表達融合蛋白分子量約35 kD，誘導5 h后表達量最高，占菌體總蛋白的30 %左右；表達蛋白能與多克隆抗體發(fā)生免疫印跡反應，證明所表達的蛋白具有良好的免疫原性（圖4）。

3 討論

目前，外源蛋白的表達系統(tǒng)較多。其中，大腸桿菌表達系統(tǒng)具有培養(yǎng)方便、操作簡單、成本低廉、表達量大、易于純化和工業(yè)化批量生產(chǎn)等優(yōu)點；pGEX-6P-1原核表達的載體重組蛋白，在折疊時不易掩蓋被研究蛋白的表位，能夠保持蛋白原本的反應性。因此，本試驗利用pGEX-6P-1原核表達載體系統(tǒng)，表達了以包涵體形式存在的差異蛋白。以包涵體形式表達的蛋白有其不利的一面：包涵體需要變性溶解、復性后才能得到溶解的蛋白，而且復性后蛋白的活性容易降低；但也有其有利的一面：其能夠避免細胞內蛋白水解酶的作用，有利于目的蛋白的富集和分離純化。本研究用pGEX-6P-1載體系統(tǒng)中表達的差異蛋白，經(jīng)變性溶解SDS-PAGE電泳后，用免疫印跡檢測證明，該重組蛋白依然具有良好的免疫原性。因此，可利用表達蛋白及制備的多克隆抗體，建立免疫學檢測方法。

圖4 誘導表達蛋白的SDS-PAGE電泳及Western blot 鑒定結果

免疫血清質量的好壞直接關系到使用的效果和研究的成敗，直接影響到試驗的準確性、特異性和敏感性。制備優(yōu)質的免疫血清，一方面取決于抗原的種類、純度及其免疫原性；另一方面也取決于動物的選擇及動物機體免疫應答的能力。此外，還須考慮注射途徑、抗原劑量、注射次數(shù)、時間間隔、有無佐劑以及合理的免疫方法和免疫程序等。

抗原是指能刺激機體免疫系統(tǒng)誘導免疫應答并能與應答產(chǎn)生的抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異反應的物質。一個完整的抗原應包括兩方面的免疫性能：免疫原性，指誘導機體產(chǎn)生免疫應答的能力，具有這種能力的物質稱為免疫原；免疫反應性，指抗原與抗體或致敏淋巴細胞發(fā)生特異性結合的能力，亦稱為反應原性。有些物質在獨立存在時，只具有反應原性而無免疫原性，稱為半抗原，而免疫原通常同時具有免疫反應能力。良好的抗原是產(chǎn)生優(yōu)質免疫血清的重要條件。

動物機體產(chǎn)生抗體的過程有一定的時間規(guī)律。一般在首次接觸抗原的7～10 d后，血清中才有抗體出現(xiàn)，并在14～21 d達到高峰，這段時間稱為初次反應階段。初次應答產(chǎn)生的抗體主要是IgM分子，與抗原的結合力低，為低親和性抗體。若此后一定時間內，再次接觸同一抗原，則特異抗體的量就會成倍增加，稱為二次反應。這個階段產(chǎn)生的主要為IgG分子，且為高親和性抗體。依據(jù)這一規(guī)律，必須制定合理的免疫次數(shù)和間隔時間。本研究利用該程序獲得了比較滿意的血清效價，證明該免疫程序切實可行。但免疫程序并不是一成不變的，須綜合考慮動物的種別、免疫原的種類、免疫途徑及免疫劑量等，必要時還要根據(jù)具體情況隨時調整。

免疫劑量需因動物種類、抗原分子大小及免疫方案不同進行調整，可分為微量、中等劑量及大劑量。免疫劑量低于一定限度時，抗體就不能形成，或不能檢出；超過一定限度時，抗體的產(chǎn)生就會受到抑制，使控制免疫系統(tǒng)的神經(jīng)因過度興奮轉為阻抑，產(chǎn)生“免疫麻痹”。因此，掌握好適當?shù)膭┝糠浅ｊP鍵。

免疫途徑的選擇也是相當重要的。通?？刹捎渺o脈、腹腔、皮下、皮內或肌肉及足掌等途徑注射抗原。經(jīng)靜脈或腹腔注射的抗原能直接或很快進入血流，可在短時間內被清除，因此沒有足夠的時間刺激抗體形成細胞，因而也不能獲得效價滿意的抗血清。但最后一次的經(jīng)靜脈加強免疫能使抗體水平迅速提升。一般情況下，抗原經(jīng)皮下、皮內或肌肉注射后，抗原擴散速度很慢，貯留時間長，有利于抗體的產(chǎn)生和并可持續(xù)較長時間。因此，在免疫動物時，應遵循這一原則，以便得到滿意的高效價血清，從而為下一步研究奠定基礎。

必須根據(jù)抗原的性質采用適當?shù)拿庖叻椒āＲ话泐w粒性抗原，如紅細胞、細菌體等，通常采用無佐劑免疫法。本研究針對應用的免疫原采用佐劑免疫法，這有利于減緩抗原在體內釋放速度，增加抗原在體內的存留時間，糖醇轉錄調節(jié)子蛋白中抗原表位信號強的包含重要抗原決定簇的序列部分片段進行了表達，從而為布病自然感染與疫苗免疫的鑒別診斷建立一種行之有效的、快速的檢測方法提供了參考。

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（責任編輯：朱迪國）

Expression and Antibody Preparation of Variant Protein between Brucella bovis Virulent Strain A544 and Brucella abortus Vaccine Strain 104M

Wang Haiyan，Zhao Linli，Zhao Zhiguo，Guo Wenxiu，Chen Yufei，Liu Jia，Ren Caixia，Ao Weihua，Ma Caixia
（Inner Mongolia Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau，Huhhot，Inner Mongolia 010020）

S852.65

A

1005-944X（2017）10-0060-05

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.10.018

國家質檢總局科技計劃（2012IK014、2016IK165）