曹亞楠，白 雪，趙 鋼，鄒 亮,3，胡一晨,*

UPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)的多產(chǎn)地藜麥質(zhì)量控制

曹亞楠1,2，白 雪2，趙 鋼2，鄒 亮2,3，胡一晨2,*

（1.西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2.成都大學(xué) 農(nóng)業(yè)部雜糧加工重點實驗室，四川 成都 610106；3.成都大學(xué)醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610106）

采用超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）對來自世界范圍多地區(qū)的30 批次藜麥進行質(zhì)量控制研究，通過方法學(xué)考察建立不同產(chǎn)地藜麥樣品UPLC指紋圖譜，并分析其相似度。借助聚類分析、主成分分析、偏最小二乘判別分析等化學(xué)計量學(xué)方法對其產(chǎn)地和質(zhì)量的相關(guān)性進行分析。結(jié)果表明，30 批藜麥對照圖譜存在12 個共有峰，樣品相似度大于0.7；通過化學(xué)計量法，藜麥樣品按產(chǎn)地被很好地分為4 類，主成分分析和模式識別分析結(jié)果提示其質(zhì)量差異主要與3 個化合物相關(guān)。UPLC指紋圖譜的構(gòu)建和化學(xué)模式的識別為藜麥質(zhì)量控制提供更全面的參考，為有效控制藜麥質(zhì)量提供參考依據(jù)。

藜麥；超高效液相色譜法；指紋圖譜

藜麥屬于藜科藜屬雙子葉植物，原產(chǎn)于安第斯山區(qū)，主要分布在秘魯、玻利維亞和厄瓜多爾等國家，古代印加人稱之為“mother of all grains”[1]。聯(lián)合國糧農(nóng)組織認(rèn)為藜麥?zhǔn)俏ㄒ坏目蓾M足人體基本營養(yǎng)需求的單一植物性食物，和一般谷物相比，藜麥均衡營養(yǎng)，其籽粒中蛋白質(zhì)、維生素、礦物質(zhì)等營養(yǎng)物質(zhì)含量都較高，其種類和含量與人類生命活動的基本物質(zhì)需求匹配度相當(dāng)高[2-4]。值得關(guān)注的是，藜麥還含有豐富的多酚類、黃酮類、皂苷等活性成分，對于維持人類的身體健康具有十分重要的作用，具有增強機體功能、修復(fù)體質(zhì)、調(diào)節(jié)免疫和內(nèi)分泌系統(tǒng)、提高機體應(yīng)激能力、預(yù)防疾病、抗癌和減肥等功效，具有顯著抗氧化、抗炎、降血糖、減肥等多種生物活性[5-12]，適宜于“三高”疾病和心臟病等慢性病的保健和輔助治療。因此，藜麥對未來農(nóng)業(yè)和醫(yī)藥研究開發(fā)具有十分重要的意義。

鑒于藜麥高營養(yǎng)和經(jīng)濟價值，目前全世界多地區(qū)對藜麥進行了廣泛引種，中國的藜麥種植面積在2012年已成為非原產(chǎn)地國家第2位[13-14]。目前研究者們重點關(guān)注藜麥優(yōu)良品種選育和栽培技術(shù)優(yōu)化等方面，然而作物的品質(zhì)與其生長的地域和環(huán)境密切相關(guān)，如同中藥材講究“道地性”，自然條件或栽培條件改變，植物生產(chǎn)發(fā)育及其形態(tài)結(jié)構(gòu)常常出現(xiàn)變異。生態(tài)地理因子是影響藥材道地性的重要因素，其中水分狀況、溫度、光照、土壤成分是直接影響因子，而地形、成土是間接影響因子。如土壤中的微量元素直接影響植物中微量元素的富集，進而影響其品質(zhì)。所以不同地區(qū)種植的藜麥可能存在質(zhì)量差異[15-18]。因此，對比研究不同產(chǎn)地藜麥化學(xué)組分，揭示產(chǎn)地來源對藜麥質(zhì)量的影響，對藜麥質(zhì)量控制具有重要意義。指紋圖譜技術(shù)是全面、整體地控制中藥或農(nóng)作物質(zhì)量最有效的方法之一，是其化學(xué)組成整體性的化學(xué)表征，能夠反映研究對象盡量多的組分，對藥材或糧食質(zhì)量控制具有整體性，現(xiàn)已成為中藥（食物）質(zhì)量控制和評價的熱點之一[19-24]。目前鮮見藜麥化學(xué)組分指紋圖譜方面的文獻報道，本研究建立了6 個國家30 批藜麥樣品的超高效液相色譜（ultra performance liquid chromatography，UPLC）指紋圖譜，并結(jié)合相似度評價、系統(tǒng)聚類分析、主成分分析（principal component analysis，PCA）等方法對數(shù)據(jù)進行了深入挖掘和分析，進行藜麥多產(chǎn)地質(zhì)量分析和評價，以期為全面控制藜麥質(zhì)量提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

藜麥原產(chǎn)于玻利維亞、智利和秘魯?shù)饶厦绹?，隨后在中國、日本、韓國等亞洲國家大量引種種植，而中國種植藜麥的區(qū)域分布廣泛，主要有山西、四川、云南、甘肅、內(nèi)蒙古等地區(qū)。因此，本實驗根據(jù)其主要原產(chǎn)地和引種地區(qū)，收集藜麥樣品進行測定，藜麥樣品的產(chǎn)地或收集地具體情況見表1。

表1 30 批藜麥樣品的產(chǎn)地Table 1 Geographical origins of 30 batches of buckheat samples

蘆丁（批號：150622，純度≥98%）、槲皮素（批號：150419，純度≥98%）、阿魏酸（批號：150526，純度≥98%）、對香豆酸（批號：150927，純度≥98%）、齊墩果酸（批號：151008，純度≥98%） 四川省維克生物技術(shù)有限公司；咖啡酸（批號：K-003-140730，純度≥98%）、異葒草素（批號：Y-132-140801，純度≥98%）、牡荊素（批號：M-023-140730，純度≥98%） 成都瑞芬思生物技術(shù)有限公司；乙腈（色譜純，生產(chǎn)批號：AS1122-001）、甲醇（色譜純，生產(chǎn)批號：MS1992-001） 安徽天地高純?nèi)軇┯邢薰?；水為超純水；其余實驗試劑均為分析純?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

ACQUITY UPLC H-Class UPLC儀（四元溶劑管理器、恒溫進樣樣品管理器、柱溫箱、二極管陣列檢測器） 沃特世上?？萍加邢薰?司；KQ5200DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；CP224C十萬分之一分析天平 上海奧豪斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱為ACQUITY UPLC?BEH C18（50 mm×2.1 mm，1.7 μm），流動相為甲醇（A）-0.2%冰乙酸溶液（B），梯度洗脫（表2）；檢測波長247 nm；柱溫35 ℃；流速0.2 mL/min；進樣量1 μL。

表2 梯度洗脫程序Table 2 Gradient elution program

1.3.2 供試品溶液的制備

將干燥后的藜麥粉碎過60 目篩，精密稱定藜麥粉末1.000 g，置10 mL容量瓶中，加90%甲醇溶液至刻度，搖勻，稱定質(zhì)量，超聲處理30 min，取出，冷卻至室溫，用90%甲醇溶液補足質(zhì)量，搖勻，12 000 r/min離心10 min，取上清液，0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

1.3.3 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

取對照品蘆丁、槲皮素、異葒草素、牡荊素、阿魏酸、咖啡酸、對香豆酸、齊墩果酸適量分別置于棕色量瓶中，精密稱定，加甲醇溶液溶解并定容，制成對照品儲備液。分別取對照品儲備液適 量置于同一棕色量瓶，加甲醇定容至刻度，制成質(zhì)量濃度蘆丁1.2 μg/mL、槲皮素3.0 μg/mL、異葒草素8.9 μg/mL、牡荊素8.8 μg/mL、阿魏酸1.5 μg/mL、咖啡酸1.2 μg/mL、對香豆酸1.5 μg/mL、齊墩果酸8.5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，搖勻即得。

1.3.4 方法學(xué)考察

1.3.4.1 精密度考察

取同一份藜麥供試品溶液，按1.3.1節(jié)色譜條件，連續(xù)進樣6 針，記錄色譜圖，以色譜圖中6.8、7.2、8.0、10.3 min共有色譜峰保留時間和峰面積為指標(biāo)計算相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）。

1.3.4.2 重復(fù)性考察

取6 份藜麥粉末，按1.3.2節(jié)供試品溶液制備方法制備供試品，以色譜圖中6.8、7.2、8.0、10.3min共有色譜峰保留時間和峰面積為指標(biāo)計算RSD。

1.3.4.3 穩(wěn)定性考察

取同一份藜麥供試品溶液，分別于0、2、4、8、16、24 h進樣，按1.3.1節(jié)色譜條件測定。以色譜圖中6.8、7.2、8.0、10.3 min共有色譜峰保留時間和峰面積為指標(biāo)計算RSD。

1.3.5 樣品測定及UPLC指紋圖譜建立

取30 份藜麥樣品，按1.3.2節(jié)方法制備供試品溶液，按1.3.1節(jié)色譜條件依次進樣測定，記錄色譜圖，選擇分離度良好、峰位居中、峰面積較大的色譜峰作為參比峰。將所得的30 批藜麥UPLC圖譜依次導(dǎo)入國家藥典委員會編寫的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2012版”軟件，以S1批樣品作為相似度計算時的校正參照圖譜，時間窗寬度設(shè)定為0.10，采用多點校正法對參照譜進行指紋匹配，并進行相似度計算，得到對照圖譜。同時根據(jù)8 種對照品對對照圖譜中化學(xué)色譜峰進行指認(rèn)。

1.3.6 化學(xué)計量學(xué)數(shù)據(jù)分析

聚類分析是一種自動聚類技術(shù)，目的是建立樣簇的層次結(jié)構(gòu)，密切相似的樣品可以歸類為相同的集群，相聚較遠(yuǎn)的可以歸類為不同的集群[25]。本實驗運用SPSS軟件（18.0版本）對30批藜麥樣品進行聚類分析，根據(jù)所得樹狀圖對樣品來源和質(zhì)量進行分類；PCA是一種常見的無監(jiān)督模式識別方法，在盡量保留原信息的基礎(chǔ)上，以降維的方式將多個原始變量，綜合為少數(shù)幾個變量，并找出對于模型鑒別影響大的重要變量[26-27]。偏最小二乘法判別分析（partial least squares-discriminate analysis，PLS-DA）技術(shù)是PCA的回歸延伸，它利用類的信息優(yōu)勢，試圖最大限度地觀測組之間的分離，進一步提升方法的可靠性和有效性[28-29]。本實驗運用SIMCA-P軟件對30 批藜麥樣品的化學(xué)成分信息進行PCA和PLS-DA模式識別，篩選出對藜麥質(zhì)量影響大的化學(xué)成分信息，為藜麥質(zhì)量控制提供依據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 UPLC指紋圖譜方法學(xué)考察結(jié)果

表3 基于4 個共有峰的方法學(xué)考察結(jié)果（RSD）Table 3 Evaluation of fi gures of merit based on four common chromatogram peeaakkss%

由表3可知，重復(fù)進樣6 次，藜麥樣品UPLC圖譜中4 個共有峰的保留時間和峰面積的RSD均小于3%，儀器的精密度良好，符合UPLC指紋圖譜的分析要求；6 份藜麥樣品采用同一方法處理，4 個共有峰的保留時間和峰面積的RSD均小于3%，表明該方法重復(fù)性良好；24 h內(nèi)不同時間進樣，4 個共有峰的保留時間和峰面積的RSD均小于3%，表明藜麥樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2 藜麥UPLC指紋圖譜的建立

取1.1節(jié)30 批不同產(chǎn)地的藜麥供試品，參照1.3.2節(jié)方法分別制備供試品溶液，采用1.3.1節(jié)色譜條件進樣測定，記錄30 批次藜麥UPLC指紋色譜疊加圖[24]（圖1）。將30 批藜麥的指紋圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012版）軟件，以中位數(shù)法生成藜麥對照指紋圖譜，確定了12 個共有峰。將該對照指紋圖譜與其他批次藥材圖譜進行對比，30 批不同產(chǎn)地和來源的藜麥樣品化學(xué)成分相似度在0.744～0.966之間，見表4。其中，大部分樣品和對照譜圖的相似度在0.85以上，導(dǎo)致不同樣本之間差異性的原因可能是產(chǎn)地、種屬和采收季節(jié)的不同。因為不同產(chǎn)地的溫度、光照、土壤成分、水分狀況不同，導(dǎo)致植物出現(xiàn)一定的品質(zhì)差異；生態(tài)地理環(huán)境也會對植物的遺傳物質(zhì)產(chǎn)生一定的影響，進而導(dǎo)致植物初生及次生代謝物的累積差異。

圖1 30 批次藜麥樣品的UPLC疊加圖Fig. 1 Overlapping UPLC chromatograms for 30 batches of quinoa samples

2.3 指紋圖譜中主要色譜峰的指認(rèn)

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液（A）和對照品（B）色譜圖Fig. 2 UPLC fi ngerprints of mixed standard solution (A) and control sample (B)

在1.3.1節(jié)色譜條件下，將咖啡酸、對香豆酸、阿魏酸、異葒草素、牡荊素、蘆丁、槲皮素、齊墩果酸及其混合標(biāo)準(zhǔn)品依次進樣，根據(jù)保留時間將混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液與對照指紋圖譜進行對比，完成對其中部分共有峰的指認(rèn)，結(jié)果如圖2所示。

2.4 模式識別分析結(jié)果

2.4.1 聚類分析結(jié)果

聚類分析是根據(jù)樣本的相似程度進行歸類，目前在中藥真?zhèn)舞b別、質(zhì)量評價、品種分類等應(yīng)用較多[30]。本實驗對不同產(chǎn)地的30 批次藜麥樣品作指紋圖譜分析，獲得12 個共有峰，將各個共有峰相對于參比峰的峰面積量化，得到30×12階原始數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SPSS軟件，采用組間連接法，選用歐氏距離對30 批樣品進行系統(tǒng)聚類分析，結(jié)果如圖3所示。

圖3 30 批藜麥樣品聚類分析樹狀圖Fig. 3 Dendrogram from hierarchical cluster analysis for the 30 tested batches of quinoa

由圖3可以明顯看出，聚類分析將指紋圖譜大致分成了4 類，第Ⅰ類：S13、S23、S7、S8、S29、S15、S28、S5、S4、S9、S2、S21、S6、S16、S14、S26、S19、S24、S30、S20、S22。第Ⅱ類：S3、S10、S27、S18、S25、S11、S17。第Ⅲ類：S1。第Ⅳ類：S12。

由圖3還可以看出，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ類之間的距離為25，Ⅲ、Ⅳ類之間的距離為16，Ⅰ、Ⅱ類之間的距離為10，由此說明Ⅲ、Ⅳ類之間很相似，Ⅰ、Ⅱ類之間很相似，Ⅰ、Ⅱ類和Ⅲ、Ⅳ類相差較大。根據(jù)表1中藜麥樣品產(chǎn)地（或收集地）信息可知，Ⅲ和Ⅳ類樣品分別來自于藜麥的原產(chǎn)地南美秘魯和玻利維亞，Ⅱ類樣品大多來源于日本、韓國等亞洲國家或地區(qū)，Ⅰ類樣品基本來源于中國的多個產(chǎn)地。由此說明，藜麥的產(chǎn)地對其質(zhì)量影響較大，可能與其種植氣候、品種等因素相關(guān)。藜麥的原產(chǎn)地秘魯、玻利維亞屬于高原地區(qū)，與中國、韓國等亞洲國家及地區(qū)的氣候相差較大，作物的生長 狀況就會出現(xiàn)一定的差異；土壤中微量元素與水分含量也有一定的差異，導(dǎo)致植物吸收的營養(yǎng)成分也大不相同，所以不同產(chǎn)地的藜麥其質(zhì)量有一定差異。

2.4.2 PCA結(jié)果

選取共有色譜峰的相對峰面積值作為變量，對30 批藜麥樣品進行PCA，經(jīng)計算，前3 個主成分因子對總方差的累計貢獻率達78.53%（圖4），故僅用前3 個主成分就可表示藜麥UPLC數(shù)據(jù)的主要信息。

圖4 基于PCA提取的3 個主成分對樣品來源進行判別的PCAFig. 4 Distribution of quinoa samples based on the fi rst three principal components extracted in PCA

2.4.3 PLS-DA結(jié)果

圖5 基于PLS-DA提取的3 個主成分對樣品來源進行判別的PLS-DAFig. 5 Distribution of quinoa samples based on the first three principal components extracted in PLS-DA

運用PLS-DA技術(shù)獲得一個高水平的組間分離結(jié)果?；?0 批藜麥樣品中共有峰峰面積所得到的三維的PLS-DA散點圖（圖5）表明，所有測試樣品可以根據(jù)其起源分為4組，并且根據(jù)每個變量對樣品辨別的貢獻率得出峰1（咖啡酸）、峰7（槲皮素）和峰8（齊墩果酸）可能是區(qū)分藜麥來源的最重要的變量。然后，用7 倍交叉分析估計所建立的判別模型的預(yù)測能力，R2Y和Q2Y的值分別為0.822和0.486，由此得出所建立的判別模型穩(wěn)定性良好，預(yù)測能力也較好。運用統(tǒng)計推斷方法分析是為了進一步驗證鑒別模型，圖6為PLS-DA模型置換驗證圖，圖中Q2為累計交叉有效性，Q2值越大表示模型的預(yù)測能力越好；R2為累計方差值，表示有多少原始數(shù)據(jù)被用于建立新的PLS-DA判別模型，R2值越大則表示模型的解釋能力越強。由圖6可知，R2和Q2截距值分別為0.711和-0.245，所有位于左邊的R2和Q2（Y軸數(shù)據(jù)）均低于最右邊的R2和Q2值，且Q2回歸線的截距均為負(fù)值，說明所建立的PLS-DA判別模型沒有出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象，具有較好的預(yù)測能力。上述結(jié)果表明，根據(jù)樣品的起源對樣品進行分類，進而進行質(zhì)量控制，PLS-DA技術(shù)會比PCA更適合。

圖6 基于PLS-DA 的 R2和Q2的截距Fig. 6 R2and Q2intercept values from 200 permutations in PLS-DA

3 結(jié) 論

藜麥中含有多種天然化學(xué)成分，測定一個或幾個指標(biāo)成分不能全面地反映其質(zhì)量，因此全面系統(tǒng)地建立其特征性指紋圖譜，是質(zhì)量評價和控制的有效方法。全世界范圍內(nèi)藜麥產(chǎn)地較多，由于生長環(huán)境、土壤性質(zhì)等原因，不僅易導(dǎo)致其營養(yǎng)組成不同，化學(xué)成分之間也有所不同，因而表現(xiàn)在UPLC色譜圖中峰位的差異。本實驗首先對樣品處理方法、流動相系統(tǒng)、柱溫、流速等實驗條件進行考察，得到最佳分析條件，建立了多產(chǎn)地藜麥的指紋圖譜，并通過相似度分析、聚類分析、PCA、PLSDA模式識別等方法相互印證，根據(jù)其化學(xué)組成對不同產(chǎn)地或來源的藜麥進行分類，篩選出共有的特征成分和決定其質(zhì)量的關(guān)鍵色譜峰，將各產(chǎn)地藜麥質(zhì)量較清晰地區(qū)別和分類，為藜麥質(zhì)量控制提供依據(jù)。

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Application of UPLC Fingerprint Coupled with Chemometry for Quality Control of Quinoa from Different Geographical Origins

CAO Yanan1,2, BAI Xue2, ZHAO Gang2, ZOU Liang2,3, HU Yichen2,*
(1. College of Food and Bioengineering, Xihua University, Chengdu 610039, China;2. Key Laboratory of Coarse Cereal Processing, Ministry of Agriculture, Chengdu University, Chengdu 610106, China;3. College of Medicine, Chengdu University, Chengdu 610106, China)

In this research, a method for the quality control of 30 batches of quinoa from many different areas of the world was established by ultra-performance liquid chromatography (UPLC). UPLC fi ngerprints were established after evaluation of fi gures of merit. The similarity was analyzed by similarity evaluation software. The relationship between geographical origin and quality was analyzed by cluster analysis, principal component analysis (PCA), partial least squares-discriminant analysis (PLS-DA) and other chemometric methods. The results showed that there were 12 peaks common to 30 batches of quinoa, and the similarity among samples was greater than 0.7. Using the chemometric methods, the quinoa samples were classifi ed into four categories according to their geographical orgins. The PCA and pattern recognition analysis indicated that the quality difference was mainly related to three compounds. Therefore, UPLC fi ngerprinting and chemical pattern recognition can provide detailed references for the quality control of quinoa.

quinoa; ultra performance liquid chromatography (UPLC); fi ngerprinting

TS201.1

A

1002-6630（2017）20-0286-06

曹亞楠, 白雪, 趙鋼, 等. UPLC指紋圖譜結(jié)合化學(xué)計量學(xué)的多產(chǎn)地藜麥質(zhì)量控制[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(20): 286-291.DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720042. http://www.spkx.net.cn

CAO Yanan, BAI Xue, ZHAO Gang, et al. Application of UPLC fi ngerprint coupled with chemometry for quality control of quinoa from different geographical origins[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 286-291. (in Chinese with English abstract)DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720042. http∶//www.spkx.net.cn

2016-10-24

四川省教育廳項目（17ZB0113）；成都大學(xué)校青年基金項目（2080516032）

曹亞楠（1993—），女，碩士研究生，研究方向為食品科學(xué)。E-mail：1015880420@qq.com

*通信作者：胡一晨（1987—），女，講師，博士，研究方向為中藥質(zhì)量控制及活性成分。E-mail：huyichen0323@126.com

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720042