李 榮，于 君，姜子濤*，黃 賢勇

微波輔助分步酶解紫蘇餅粕蛋白制備鮮味肽

李 榮，于 君，姜子濤*，黃 賢勇

（天津商業(yè)大學(xué)生物技術(shù)與食品科學(xué)學(xué)院，天津市食品生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300134）

在微波輔助的條件下，利用堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶分步對(duì)紫蘇餅粕蛋白進(jìn)行水解，應(yīng)用正交試驗(yàn)確定了最佳的酶解條件。通過(guò)Sephadex G-15凝膠層析、反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法和電子舌技術(shù)對(duì)酶解液成分與鮮味的變化進(jìn)行了表征。結(jié)果表明，在微波功率400 W條件下，第1步堿性蛋白酶最佳酶解條件為酶添加量1 600 U/g、pH 10.0、 微波溫度60 ℃、微波時(shí)間35 min；第2步風(fēng)味蛋白酶的最佳酶解條件為酶添加量1 600 U/g、pH 6.5、微波溫度65 ℃、微波時(shí)間40 min，分步酶解最終水解度為44.86%。最后通過(guò)凝膠層析、RP-HPLC與電子舌表征，證明微波輔助分步酶解法快速、高效，且與單獨(dú)酶解所得產(chǎn)物相比，其產(chǎn)物鮮味改善明顯。

分步酶解；微波；凝膠層析；RP-HPLC；電子舌；鮮味肽

肽作為蛋白質(zhì)的水解產(chǎn)物，不僅具有與蛋白質(zhì)幾乎一致的氨基酸組成，而且更容易被人體消化吸收，同時(shí)還具有良好的加工特性、營(yíng)養(yǎng)功能和生理活性，在食品的呈味中具有重要作用。鮮味肽亦稱(chēng)為風(fēng)味提升肽，是一類(lèi)補(bǔ)充或增強(qiáng)食品原有風(fēng)味的呈味肽類(lèi)物質(zhì)。鮮味肽具有增強(qiáng)鮮味或產(chǎn)生鮮味的作用[1]，且不影響食品的其他味覺(jué)（酸、甜、苦、咸），因此在各種蔬菜、肉類(lèi)、乳類(lèi)、水產(chǎn)類(lèi)乃至酒類(lèi)增味方面都有良好的效果[2]。蛋白經(jīng)酶水解得到的水解產(chǎn)物是由多種肽類(lèi)化合物（或氨基酸）構(gòu)成的混合物，利用凝膠體積 排阻色譜的原理，可以將待分離的混合肽溶液按相對(duì)分子質(zhì)量大小篩分開(kāi)[3-5]。由于肽的滋味主要與肽鏈長(zhǎng)度、氨基酸的組成與順序有關(guān)[6-7]，因此利用凝膠色譜層析不僅能夠表征酶解前后分子質(zhì)量大小的變化，還能夠分離純化混合肽，如Su Guowan等[8]將花生蛋白水解后產(chǎn)生的肽通過(guò)凝膠層析后，使用反相高效液相色譜（reversed phase-high performance liquid chromatography，RP-HPLC）法與基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜鑒定出一個(gè)鮮味肽和一個(gè)鮮味增強(qiáng)肽。Zhang Meixiu等[9]從河豚魚(yú)（暗紋東方鲀）的肉中提取了風(fēng)味肽。Toelstede等[10]發(fā)現(xiàn)含有谷氨酸片段的呈味肽成分使豪達(dá)奶酪的口味更具有奶酪的濃厚感。Aristoy等[11]的研究表明，一些小分子肽具有一 定的鮮味。

紫蘇餅粕是紫蘇榨油后的副產(chǎn)品，其富含蛋白質(zhì)，且氣味芳香，適口性好，其中鮮味氨基酸在紫蘇蛋白的組成中含量較高[12]，是制備鮮味肽的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)資源。目前對(duì)于紫蘇肽的研究，僅見(jiàn)有單酶水解[13]和制備高F值低聚肽方面的報(bào)道[14]，而對(duì)于應(yīng)用微波輔助進(jìn)行分步酶解制備紫蘇鮮味肽，進(jìn)而分離純化的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以紫蘇餅粕蛋白作為底物，采用堿性蛋白酶與風(fēng)味蛋白酶的分步酶解，利用微波輔助技術(shù)代替常規(guī)水浴加熱，大大地縮短了蛋白質(zhì)的酶解時(shí)間，提高了酶解效率[15-16]。應(yīng)用凝膠層析、RP-HPLC表征酶解成分的變化，且為進(jìn)一步驗(yàn)證分步酶解對(duì)制備紫蘇鮮味肽的積極作用，利用電子舌技術(shù)對(duì)制備出的紫蘇肽呈鮮味的效果進(jìn)行對(duì)比，以期為肽類(lèi)在食品調(diào)味料的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫蘇餅粕 天津東方雷格工貿(mào)有限公司；紫蘇餅粕蛋白（純度為質(zhì)量分?jǐn)?shù)91.74%） 本實(shí)驗(yàn)室自制[17]；堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶 北京索萊寶科技有限公司；Sephadex G-15 美國(guó)Pharmacia公司；甲醛溶液 天津贏達(dá)稀貴化學(xué)試劑廠；乙腈（色譜純） 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；純凈水 杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Multi SYNTH微波合成儀 意大利Milestone公司；ASTREE電子舌 法國(guó)Alpha MOS公司；1100系列高效液相色譜儀 美國(guó)安捷倫公司；Vydac-C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm） 美國(guó)Grace公司；80-1離心機(jī) 上海醫(yī)療設(shè)備（集團(tuán)）有限公司手術(shù)器械廠；LGJ-10型冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；HD-5型核酸蛋白檢測(cè)儀 南京大學(xué)普陽(yáng)科學(xué)儀器研究所；FA1104N型電子天平 上海精密儀器有限公司；RE52-86A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 分步酶解工藝流程

將紫蘇餅粕蛋白溶于水中制成質(zhì)量濃度3g/100 mL的溶液，加入適量的NaOH調(diào)節(jié)至溶液的pH值為10，之后加入1 600 U/g的堿性蛋白酶，在70 ℃、微波400 W的條件下進(jìn)行酶水解25 min。滅酶后利用HCl調(diào)節(jié)水解液的pH值為6.5，然后再加入1 200 U/g的風(fēng)味蛋白酶，在65 ℃、微波400 W的條件下繼續(xù)進(jìn)行酶水解30 min，滅酶后將水解混合物迅速冷卻，經(jīng)冷凍干燥后即可得到混合紫蘇肽的材料。

1.3.2 酶活性的測(cè)定

參照GB/T 23527—2009 《蛋白酶制劑》方法測(cè)定。

1.3.3 堿性蛋白酶水解度測(cè)定

按照pH-stat法測(cè)定堿性蛋白酶的水解度[18]，見(jiàn)公式（1）。由于在酶解過(guò)程中pH值迅速下降，使酶活力降低，所以應(yīng)每隔5 min加入已標(biāo)定的0.1 mol/L NaOH溶液維持pH值至實(shí)驗(yàn)值。

式（1）中：V為NaOH溶液的體積/mL；c為NaOH溶液的濃度/（mol/L）；α為α-氨基的離解常數(shù)；mp為底物中蛋白質(zhì)的質(zhì)量/g；htot為每克原料蛋白中肽鍵的毫摩爾數(shù)/（mmol/g），本實(shí)驗(yàn)取7.219。

1.3.4 風(fēng)味蛋白酶水解度測(cè)定

采用甲醛滴定法測(cè)定風(fēng)味蛋白酶水解度[19-20]。由于風(fēng)味蛋白酶的最適pH值介于中性與弱酸性之間；而在酸性環(huán)境下，肽鍵斷裂時(shí)產(chǎn)生的—NH3上的質(zhì)子無(wú)法游離出來(lái)，不可用pH-stat法測(cè)定水解度，因此本研究采用甲醛滴定法測(cè)定蛋白的水解度，計(jì)算如式（2）所示：

式（2）中：c為NaOH溶液的濃度/（mol/L）；V1為滴定樣品時(shí)所消耗的NaOH溶液體積/mL；V2為空白試驗(yàn)時(shí)所消耗NaOH溶液體積/mL；htot為每克原料蛋白中肽鍵的毫摩爾數(shù)/（mmol/g），本實(shí)驗(yàn)取7.219；V為所取水解液的體積/mL；m為未水解時(shí)蛋白質(zhì)的質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.5 酶解條件的確定

以水解度為指標(biāo)，對(duì)酶添加量、pH值、溫度、微波時(shí)間、微波功率在合適的范圍值內(nèi)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上選擇L9（34）表進(jìn)行正交試驗(yàn)。堿性蛋白酶和風(fēng)味蛋白酶酶解條件正交試驗(yàn)因素及水平見(jiàn)表1和表2。

表1 堿性蛋白酶酶解條件L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Factors and their coded and actual levels used in L9(34))orthogonal array design for the optimization of alcalase hydrolysis

表2 風(fēng)味蛋白酶酶解條件L9（34）正交試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 2 Factors and their coded and actual levels used in L9(34))orthogonal array design for the optimization of fl avourzyme hydrolysis

1.3.6 Sephadex G-15柱層析分離純化

將活化后的Sephadex G-15裝柱（1.2 cm×60 cm），經(jīng)藍(lán)色葡聚糖基準(zhǔn)物測(cè)定，空水體積為26.2 mL。水解液樣品用超純水配制為質(zhì)量濃度20 mg/mL的溶液，上樣量為1 mL。以超純水作為洗脫液，流速為0.5 mL/min，檢測(cè)器波長(zhǎng)為220 nm，收集各洗脫峰組分。

1.3.7 RP-HPLC分析條件

流動(dòng)相為乙腈（A）-水（B），梯度洗脫條件：0～5 min，體積分?jǐn)?shù)3% A；5～10 min，體積分?jǐn)?shù)5% A；10～15 min，體積分?jǐn)?shù)7% A；15～25 min，體積分?jǐn)?shù)40% A。進(jìn)樣量5 μL；流速0.8 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)器波長(zhǎng)220 nm。

1.3.8 電子舌滋味測(cè)定

將堿性蛋白酶單酶水解液、風(fēng)味蛋白酶單酶水解液、分步酶解水解液經(jīng)冷凍干燥后，分別取0.50 g，溶解在100 mL去離子水中，完全溶解后過(guò)濾。取25 mL溶解后的樣品于進(jìn)樣燒杯中，編輯進(jìn)樣序列。傳感器經(jīng)預(yù)平衡、校準(zhǔn)、診斷后測(cè)樣。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿性蛋白酶酶解條件的優(yōu)化

2.1.1 微波時(shí)間、酶添加量、pH值及微波功率對(duì)水解度的影響

微波通過(guò)高頻變化的電場(chǎng)使分子內(nèi)部極性分子進(jìn)行劇烈運(yùn)動(dòng)，短時(shí)間內(nèi)即可產(chǎn)生大量的熱，使體系達(dá)到酶解反應(yīng)溫度，因此微波法與傳統(tǒng)的水浴加熱法有著明顯的不同。在紫蘇分離蛋白的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%的條件下，分別測(cè)定了不同微波時(shí)間、堿性蛋白酶添加量、pH值及微波功率對(duì)紫蘇分離蛋白水解度的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 微波時(shí)間、酶添加量、pH值及微波功率對(duì)水解度的影響（堿性蛋白酶）Fig. 1 Effects of microwave irradiation time, enzyme dosage, pH and microwave power on degree of hydrolysis with alcalase

由圖1A可知，微波時(shí)間在5～25 min之間時(shí)，蛋白 的水解度快速提升，蛋白質(zhì)底物濃度不斷降低；當(dāng)微波時(shí)間達(dá)到25 min以上時(shí)，酶水解速率變緩，水解度僅有微弱的上升；可見(jiàn)在微波25 min條件下，紫蘇餅粕分離蛋白的酶水解已基本完全，而繼續(xù)延長(zhǎng)水解時(shí)間是不經(jīng)濟(jì)的。因此，選擇微波時(shí)間為25 min。

隨著堿性蛋白酶添加量的增加（圖1B），水解度不斷增大；而1 600 U/g的酶添加量與2 000 U/g的添加量 相比，水解度趨于穩(wěn)定，僅有微弱幅度增長(zhǎng)。這是因?yàn)殡S著酶添加量的增加，使得蛋白質(zhì)分子中肽鍵與酶的接觸幾率增加，在一定時(shí)間內(nèi)被水解的肽鍵數(shù)不斷增加，但當(dāng)酶添加量達(dá)到一定值后，酶與底 物的接觸幾乎達(dá)到飽和，因此 水解度增長(zhǎng)的趨勢(shì)漸緩。因此，選定堿性蛋白酶的最佳添加量為1 600 U/g。

堿性蛋白酶對(duì)溶液的pH值十分敏感，其最適pH值范圍為9～12。由圖1C可知，在微波的作用下，當(dāng)pH值為10時(shí)水解度達(dá)到最大值。因此，選定堿性蛋白酶的水解紫蘇蛋白的最適pH值為10。

如圖1D所示，微波功率的大小對(duì)紫蘇蛋白的水解度有一定的影響；此外，微波功率的大小直接影響達(dá)到水解溫度所用的時(shí)間。綜合考慮蛋白的水解度和微波時(shí)間，選擇最佳微波功率為400 W。

2.1.2 微波溫度對(duì)水解度的影響

溫度對(duì)酶促反應(yīng)速率的影響表現(xiàn)在兩個(gè)方面，一方面是當(dāng)溫度升高時(shí)，與一般化學(xué)反應(yīng)一樣，反應(yīng) 速率加快。另一方面由于酶是蛋白質(zhì)，隨著溫度升高，使酶蛋白逐漸變性而失活，引起酶反應(yīng)速率下降。因此酶所表現(xiàn)的最適溫度是這兩種影響的綜合結(jié)果。最適溫度隨著酶促作用時(shí)間的長(zhǎng)短而改變，由于溫度使酶蛋白變性是隨時(shí)間累加的。一般來(lái)說(shuō)反應(yīng)時(shí)間長(zhǎng)，酶的最適溫度低，反應(yīng)時(shí)間短則最適溫度就高[21-23]。如圖2所示，在微波短時(shí)間作用下堿性蛋白酶作用的最適溫度高至70 ℃，隨后在80 ℃時(shí)酶活力開(kāi)始大幅降低，到90 ℃時(shí)接近失活，水解度迅速降低，而普通水浴的最適溫度為50～60 ℃左右[6]，從而充分證明了微波輔助酶解能夠極大的縮短酶解時(shí)間，提高酶解效率。

圖2 微波溫度對(duì)水解度的影響Fig. 2 Effect of temperature on degree of hydrolysis with alcalase

2.1.3 堿性蛋白酶酶解條件的正交試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響水解度的4 個(gè)因素酶添加量、pH值、溫度、微波時(shí)間進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，確定最佳的酶解條件，并進(jìn)行方差分析。由表3和表4可知，各因素對(duì)微波酶解效果影響程度的大小順序?yàn)镈＞C＞A＞B，最佳工藝條件為A2B2C1D3。即在酶添加量1 600 U/g、微波溫度60 ℃、pH 10.0、微波時(shí)間35 min條件下，微波輔助堿性蛋白酶酶解紫蘇餅粕分離蛋白水解度最高為31.79%。

表3 堿性蛋白酶酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果Table 3 Orthogonal array design with experimental results for the optimization of alcalase hydrolysis

表4 堿性蛋白酶酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 4 Analysis of variance for degree of hydrolysis with alcalase as a function of operating parameters

2.2 風(fēng)味蛋白酶酶解條件的優(yōu)化

2.2.1 微波時(shí)間、酶添加量、pH值及溫度對(duì)水解度的影響

利用堿性蛋白酶水解蛋白時(shí)，能夠?qū)⒌鞍字械囊恍┦杷园被岜┞冻鰜?lái)，水解產(chǎn)物常常帶有異味或苦味[11]。而外切酶能夠?qū)⒌鞍踪|(zhì)或多肽分子末端的氨基酸肽鍵水解，從而使這些疏水性氨基酸從蛋白或多肽的末端斷掉。利用風(fēng)味蛋白酶中含有外切酶對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)一步水解，不但可以提高蛋白的水解度，同時(shí)還可以降低異味，并通過(guò)協(xié)同作用增加水解液的風(fēng)味[24-26]。

按1.3.5節(jié)方法進(jìn)行酶解，固定其他條件，先采用堿性蛋白酶最佳酶解條件酶解后，再加入一定量風(fēng)味蛋白酶，分別測(cè)定在不同微波時(shí)間、酶添加量、pH值及溫度下蛋白質(zhì)的水解度。

圖3 微波時(shí)間、酶添加量、pH值及溫度對(duì)水解度的影響（風(fēng)味蛋白酶）Fig. 3 Effects of microwave irradiation time, enzyme dosage, pH and temperature on degree of hydrolysis with fl avourzyme

由圖3可知，在反應(yīng)時(shí)間為10～30 min之間時(shí)，水解度不斷上升。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間在30 min以上時(shí)，酶解速率減緩，水解度增長(zhǎng)微弱，因此從高效節(jié)能的角度考慮，選取微波時(shí)間為30 min為反應(yīng)最佳時(shí)間。隨著酶添加量的增加，水解度不斷增大，當(dāng)酶添加量大于1 200 U/g時(shí)，酶與底物的接觸幾乎達(dá)到飽和，因此可選擇1 200 U/g的酶添加量為最佳條件。水解度受到pH值的影響，呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，因此選擇pH值為6.5為最適條件。在微波短時(shí)間作用下，風(fēng)味蛋白酶的最適溫度為65 ℃，隨后在70 ℃時(shí)酶活力大幅下降，水解度迅速降低。

2.2.2 風(fēng)味蛋白酶酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，對(duì)影響水解度的4 個(gè)因素微波時(shí)間、酶添加量、pH值、溫度進(jìn)行L9（34）正交試驗(yàn)，確定最佳的酶解條件，并對(duì)正交試驗(yàn)結(jié)果做極差分析與方差分析，結(jié)果見(jiàn)表5和表6。

由表5和表6可知，各因素對(duì)微波酶解效果影響程度的大小順序?yàn)锽＞C＞A＞D，最佳工藝條件為A3B2C2D3。即在酶添加量1 600 U/g、溫度65 ℃、pH 6.5、微波時(shí)間40 min條件下，微波輔助分步酶解紫蘇餅粕分離蛋白水解度為44.86%。

表5 風(fēng)味蛋白酶酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 5 Orthogonal array design with experimental results for the optimization of fl avorzyme hydrolysis

表6 風(fēng)味蛋白酶酶解條件優(yōu)化正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Table 6 Analysis of variance for degree of hydrolysis with fl avorzyme as a function of operating parameters

2.3 紫蘇肽的分離純化與表征

2.3.1 凝膠層析分離酶解液

圖4 堿性蛋白酶與分步酶解水解液的Sephadex G-15凝膠色譜洗脫圖Fig. 4 Elution profi les of hydrolysatses produced by sequential enzymatic hydrolysis and with alcalase alone by Sephadex G-15 gel permeation chromatography

由圖4A可知，單酶酶解結(jié)束后的洗脫峰分成5 個(gè)組分，分別編號(hào)Ⅰ～Ⅴ，洗脫總體積約為90 mL。跟其他組分相比，組分Ⅰ的吸收峰強(qiáng)度最大，為分子質(zhì)量最大的部分，組分Ⅱ分子質(zhì)量其次，組分Ⅲ和Ⅳ的保留時(shí)間表現(xiàn)出很小的差異，由此可以推斷這兩部分分子質(zhì)量差異不大，第Ⅴ組分分離效果最好，分子質(zhì)量為最小。由圖4B可知，分步酶解的水解液洗脫峰主要包含3 個(gè)組分，分別編號(hào)為Ⅰ’、Ⅱ’和Ⅴ’，洗脫總體積約為120 mL。不同于單酶洗脫圖譜的是，分步酶解中分子質(zhì)量處于中間位置的洗脫峰Ⅲ和Ⅳ消失，分子質(zhì)量較小的組分Ⅴ’含量大幅增加，證明了分步酶解將肽分解為更小的肽段，且分離出的3 個(gè)組分可進(jìn)一步鑒定鮮味肽。

2.3.2 RP-HPLC對(duì)酶解前后成分變化的表征

圖5 酶解前后成分變化在RP-HPLC中的表征Fig. 5 RP-HPLC chromatograms of hydrolysatses produced by sequential enzymatic hydrolysis and with alcalase alone

如圖5所示，相同樣品濃度下，紫蘇蛋白在保留時(shí)間為1.59、2.52、17.59、19.54 min有4 個(gè)較強(qiáng)的吸收峰，分別將其標(biāo)記為1、2、3和4號(hào)化合物。經(jīng)過(guò)堿性蛋白酶酶解后，1和4號(hào)化合物吸收峰明顯降低，3號(hào)化合物吸收峰略有降低，2號(hào)化合物吸收峰升高，在風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行第2步酶解后，2號(hào)化合物明顯升高，而1、3和4號(hào)化合物較第1步水解后又明顯降低了，說(shuō)明經(jīng)過(guò)分步酶解，蛋白含量降低，分子質(zhì)量較小的肽段含量增加，水解程度增大。

這個(gè)結(jié)果與圖4凝膠色譜表征的酶解效果，即分步酶解水解液相比于堿性蛋白酶水解液的Ⅴ號(hào)化合物峰明顯增強(qiáng)相對(duì)應(yīng)。將二者比較可得，第2步酶解中風(fēng)味蛋白酶將第1步水解液水解為更小的肽段，且效果較為明顯，充分證明了微波輔助分步酶解紫蘇餅粕分離蛋白是快速且有效的。

2.3.3 單酶酶解物與分步酶解物的呈味特性

從圖6可以看出，第1主成分與第2主成分的貢獻(xiàn)率分別為91.611%、8.084%，二者之和達(dá)到了99.695%，故能夠代表樣品本身絕大部分的信息并能很好地反映樣品的實(shí)際情況。且3 種樣品的主成分分析的識(shí)別指數(shù)為97，說(shuō)明3 種樣品在滋味間存在差異，并通過(guò)電子舌能夠很好地區(qū)分開(kāi)來(lái)。樣品A在右側(cè)，與在左側(cè)的樣品B、C距離較遠(yuǎn)，說(shuō)明滋味差別比較大。

圖6 單酶酶解物與分步酶解物主成分分析Fig. 6 PCA plots for hydrolysatses produced by sequential enzymatic hydrolysis and with alcalase alone

圖7 單酶酶解物與分步酶解物滋味雷達(dá)圖譜Fig. 7 Radar charts showing taste profi les of hydrolysatses produced by sequential enzymatic hydrolysis and with alcalase alone

圖7 為樣品A（風(fēng)味蛋白酶酶解物）、B（堿性蛋白酶酶解物）、C（分步酶解物）3 種紫蘇肽處理樣品在電子舌第5套傳感器上各種滋味的相對(duì)強(qiáng)度，電子舌通過(guò)軟件對(duì)信號(hào)值的分析，能夠在0～12的刻度上比較不同樣品間的各種滋味的相對(duì)強(qiáng)度，而圖中給出的數(shù)值為相對(duì)強(qiáng)度值。從圖7中可以直觀地看出鮮味、咸味與酸味的相對(duì)強(qiáng)度大小順序，其余4 根傳感器數(shù)值為不同側(cè)重的綜合滋味大小。其中鮮味的大小順序?yàn)椋篊＞A＞B，且B的鮮味明顯小于其余二者，證明了第1步堿性蛋白酶酶解達(dá)到深度水解目的的同時(shí)，產(chǎn)生了較差的風(fēng)味，通過(guò)第2步風(fēng) 味蛋白酶將氨基或羧基末端的肽鍵剪切下來(lái)，明顯改善堿性蛋白酶酶解后的鮮味，且2 種酶合作使用的效果均大于單獨(dú)使用時(shí)的鮮味，因此證明了利用分步酶解水解紫蘇蛋白制備鮮味肽是可行且有效的。

3 結(jié) 論

利用微波輔助分步酶解的方法以紫蘇餅粕蛋白為原料制備紫蘇肽，第1步使用堿性蛋白酶水解時(shí)間為35 min，第2步酶解使用風(fēng)味蛋白酶水解時(shí)間為40 min，與文獻(xiàn)[13-14]所報(bào)道的水解時(shí)間4 h相比，使用微波輔助分步酶解的方法制備紫蘇肽可使水解時(shí)間縮短大約3.3 h，且紫蘇蛋白水解度分別為38.75%和34.8%，而本實(shí)驗(yàn)利用微波輔助分步酶解方法水解度達(dá)到44.86%。蛋白酶的水解產(chǎn)物具有非常明顯的鮮味，經(jīng)過(guò)凝膠層析對(duì)酶水解液中不同分子質(zhì)量肽段進(jìn)行分離純化，結(jié)合RPHPLC表征，最后應(yīng)用電子舌測(cè)定鮮味大小，優(yōu)化了紫蘇鮮味肽的最佳工藝條件，證明了微波輔助分步酶解相比于單酶水解是一種快速且有效的方法[27-30]，本研究為獲得高品質(zhì)、高產(chǎn)率、水解度較高和成本較低的鮮味肽提供了較充分的理論依據(jù)。

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Preparation of Umami Peptide by Microwave-Assisted Stepwise Enzymatic Hydrolysis of Perilla Seed Meal Protein

LI Rong, YU Jun, JIANG Zitao*, HUANG Xianyong
(Tianjin Key Laboratory of Food Biotechnology, College of Biotechnology and Food Science,Tianjin University of Commerce, Tianjin 300134, China)

Umami peptide was prepa red by microwave-assisted sequential enzymatic hydrolysis of perilla seed meal prote in with alcalase followed by fl avorzyme. Optimization of the hydrolysis conditions was performed using an orthogonal array design. Sephadex G-15 gel permeation chromatography, reversed phase-high performance liquid chromatography (RP-HPLC)and electronic tongue were applied to characterize the changes in peptide composition and umami taste during the hydrolysis process. The results showed that the optimum conditions for alcalase hydrolysis were as follows∶ microwave power, 400 W;enzyme dosage, 1 600 U/g; pH, 10.0; temperature, 60 ℃; and hydrolysis time, 35 min, and the optimum conditions for fl avorzyme hydrolysis were as follows∶ enzyme dosage, 1 600 U/g; pH, 6.5; temperature, 65 ℃; and hydrolysis time, 40 min.A degree of hydrolysis of 44.86% was obtained under the optimized conditions. Compared with single enzymatic hydrolysis,the microwave-assisted stepwise enzymatic hydrolysis was quicker and more effi cient and show ed improved taste.

step-wise enzymatic hydrolysis; microwave; gel permeation chromatography; RP-HPLC; electronic tongue;umami peptide

TS229

A

1002-6630（2017）20-0169-07

李榮, 于君, 姜子濤, 等. 微波輔助分步酶解紫蘇餅粕蛋白制備鮮味肽[J]. 食品科學(xué), 2017, 38(20)∶ 169-175.DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720024. http∶//www.spkx.net.cn

LI Rong, YU Jun, JIANG Zitao, et al. Preparation of umami peptide by microwave-assisted stepwise enzymatic hydrolysis of perilla seed meal protein[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 169-175. (in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720024. http∶//www.spkx.net.cn

2016-12-02

天津市自然科學(xué)基金項(xiàng)目（12JCZDJC34100；13JCYBJC18700）

李榮（1962—），女，教授，學(xué)士，研究方向?yàn)榉治龌瘜W(xué)與食品分析。E-mail：lirong@tjcu.edu.cn

*通信作者：姜子濤（1956—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称诽砑觿?。E-mail：ztjiang@tjcu.edu.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720024