李貴節(jié)，譚 祥，王 華,*，吳厚玖，Russell ROUSEFF

HPLC-DAD-FLD同時(shí)測(cè)定柑橘果汁中12 種多甲氧基黃酮和香豆素類物質(zhì)

李貴節(jié)1,2,3,4，譚 祥1，王 華1,*，吳厚玖1，Russell ROUSEFF1

（1.西南大學(xué)柑桔研 究所，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所，重慶 400712；2.重慶第二師范學(xué)院，重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心，重慶市功能性食品工程技術(shù)研究中心，重慶 400067；3.西南大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，重慶 400715；4.重慶第二師范學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，重慶 400067）

建立高效液相色譜-串聯(lián)二極管陣列檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器（high performance liquid chromatography-diode array detector-fl uorescence detector，HPLC-DAD-FLD）同時(shí)檢測(cè)柑橘果汁中12 種多甲氧基黃酮、香豆素及呋喃香豆素類物質(zhì)的方法。以0.01%磷酸、甲醇、乙腈組成三元流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，12 種物質(zhì)在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離。利用DAD和FLD獲得各物質(zhì)的紫外和熒光光譜信息，將柑橘果汁樣品組分的光譜與之比對(duì)，并結(jié)合色譜保留時(shí)間，實(shí)現(xiàn)樣品成分的定性分析。分別以320 nm和450 nm為紫外和熒光的檢測(cè)波長(zhǎng)，研究該方法的定量性能。結(jié)果顯示：標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系良好；熒光定量限低至μg/L級(jí)，可作為紫外定量的重要補(bǔ)充手段；果汁回收率的紫外和熒光檢測(cè)值分別為95.2%～104.8%和94.5%～103.5%。該方法對(duì)樣品定性、定量分析準(zhǔn)確，適合柑橘多甲氧基黃酮、香豆素等能發(fā)射熒光物質(zhì)的檢測(cè)。

高效液相色譜；熒光檢測(cè)；柑橘果汁；多甲氧基黃酮；香豆素

柑橘是蕓香科柑橘屬植物的總稱，其果實(shí)是世界第一、我國(guó)第二大栽培水果[1]。柑橘果汁富含VC、鈣、磷、鉀、檸檬酸、類胡蘿卜素等成分，以其較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和獨(dú)特的口感風(fēng)味深受人們的喜愛(ài)[2]。柑橘果汁中還含有一大類氧雜環(huán)化合物，如多甲氧基黃酮（polymethoxyflavones，PMFs）和香豆素類（包括呋喃香豆素類），其氧雜環(huán)母核結(jié)構(gòu)如圖1所示。它們都是柑橘的次生代謝產(chǎn)物，經(jīng)由莽草酸途徑合成前體[3-4]，大都具有廣泛的生物活性[5]。

多甲氧基黃酮幾乎只天然存在于柑橘果實(shí)中，其定義為甲氧基數(shù)不小于4的一類黃酮[6]。PMFs具有較高的口服生物活性，有很強(qiáng)的抗過(guò)敏、抗氧化、抗炎癥、抑菌及抗癌抗腫瘤等有益作用[7-8]。對(duì)皮膚癌變?nèi)绾谏亓黾?xì)胞，PMFs在體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出良好的預(yù)防、抑制和抗增生作用[9-12]。此外，PMFs的種類和含量差異還能用于柑橘產(chǎn)品鑒偽、品種及原產(chǎn)地區(qū)分等領(lǐng)域[13-14]。

柑橘中的香豆素及其呋喃衍生物的積累則主要源于植株對(duì)外界不利因素的響應(yīng)，這類物質(zhì)常存在于檸檬、來(lái)檬、佛手柑等果實(shí)中[15]。有研究顯示，香豆素類物質(zhì)具有抗氧化、抗微生物、護(hù)肝和預(yù)防腫瘤壞死等功能[16-19]。然而，部分呋喃香豆素對(duì)人體會(huì)產(chǎn)生不利作用，如香葉氧基呋喃香豆素二聚體導(dǎo)致葡萄柚汁抑制肝藥酶，從而影響藥物代謝[20]；佛手柑內(nèi)酯等具有一定的光致敏性，可能誘發(fā)皮膚的光敏病變[21-22]。因此，對(duì)于香豆素類物質(zhì)在柑橘果汁中分布的追蹤，對(duì)食源性疾病的預(yù)防具有一定的意義。

多甲氧基黃酮、香豆素及呋喃香豆素雖備受關(guān)注，但少有研究同時(shí)對(duì)三者在柑橘鮮果及產(chǎn)品中的分布進(jìn)行研究[23-24]；對(duì)果汁中三者的定性和定量分析更是僅有一篇報(bào)道，且僅使用了紫外檢測(cè)器進(jìn)行分析定量[25]。事實(shí)上，上述物質(zhì)在激發(fā)狀態(tài)下大都能發(fā)射熒光，從而提供了另一條分析檢測(cè)的途徑。本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)二極管陣列檢測(cè)器和熒光檢測(cè)器（high performance liquid chromatography-diode array detector-fluorescence detector，HPLC-DAD-FLD），通過(guò)對(duì)各物質(zhì)的紫外和熒光特征光譜的獲取，確定儀器分析的最佳條件，并利用2 種檢測(cè)器分別定量，建立同時(shí)檢測(cè)柑橘果汁中12 種多甲氧基黃酮、香豆素及呋喃香豆素類物質(zhì)的方法。

表1 標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物質(zhì)信息Table 1 Information about standard references used in this study

圖1 多甲氧基黃酮、香豆素及呋喃香豆素類結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)式Fig. 1 Schematic structures of polymethoxyfl avones, coumarins and furocoumarins

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

柑橘新鮮果實(shí)均采自西南大學(xué)柑桔研究所、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院柑桔研究所柑橘圃。非濃縮（not from concentrate，NFC）橙汁取自西南大學(xué)柑桔研究所，NFC葡萄柚汁購(gòu)自美國(guó)Florida’s Natural公司。

標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物質(zhì)：川陳皮素、橘皮素、甜橙黃酮、七甲氧基黃酮、檸美內(nèi)酯、異橙皮內(nèi)酯、東莨菪亭、傘形花內(nèi)酯、佛手柑素、佛手柑內(nèi)酯、環(huán)氧佛手柑素、佛手酚；內(nèi)標(biāo)物質(zhì)：補(bǔ)骨脂素、香豆素，詳細(xì)信息見(jiàn)圖1、表1。

磷酸、甲醇、乙腈（均為色譜純） 美國(guó)Sigma公司；乙酸乙酯（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Ultimate 3000 HPLC儀、DAD、FLD 德國(guó)Thermo Scientific公司；KQ5200DE超聲清洗器 江蘇昆山市超聲儀器有限公司；HN200多功能氮吹儀 山東濟(jì)南海能儀器股份有限公司；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)德國(guó)Merck-Millpore公司；MPZ9柑橘榨汁機(jī) 德國(guó)博朗公司；0.22 μm有機(jī)相微 孔濾頭 上海安譜科學(xué)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取1～12號(hào)對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各5.00 mg，分別用甲醇（或乙腈）溶液溶解，并定容至5.00 mL，配成1.00 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品母液備用。

對(duì)于內(nèi)標(biāo)物質(zhì)，準(zhǔn)確稱取補(bǔ)骨脂素和香豆素各10.00 mg，分別用甲醇溶液溶解，并定容至5.00 mL，配制成2.00 g/L的內(nèi)標(biāo)母液備用。

采用逐級(jí)稀釋法用甲醇將標(biāo)準(zhǔn)品母液配制成一系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。添加5 μL補(bǔ)骨脂素母液到混合標(biāo)準(zhǔn)品中，并隨混標(biāo)一同稀釋。

1.3.2 樣品的制備

采用手動(dòng)壓榨法制取新鮮柑橘果汁。量取10 mL鮮榨柑橘汁或NFC果汁，加入10 μL香豆素母液作內(nèi)標(biāo)，再加入10 mL乙酸乙酯振蕩萃取，靜置分層后收集上清液，水相再重復(fù)以10 mL乙酸乙酯萃?。还蔡崛?次，合并有機(jī)相，用氮?dú)獯蹈?，加? mL甲醇后超聲波處理重溶解，0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，再加入5 μL補(bǔ)骨脂素母液后待測(cè)。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：Thermo Scientific HyPURITY C18（4.6 mm×150 mm，3 μm）；流動(dòng)相：0.01%磷酸溶液、甲醇和乙腈，采用梯度洗脫；檢測(cè)器設(shè)置：DAD波長(zhǎng)掃描范圍210～400 nm；FLD激發(fā)波長(zhǎng)掃描范圍250～400 nm，發(fā)射波長(zhǎng)掃描范圍340～560 nm。其他設(shè)置：柱溫30℃，流速1 mL/min，進(jìn)樣量5.0 μL。以紫外吸收光譜掃描圖、熒光發(fā)射光譜掃描圖以及色譜峰保留時(shí)間三者結(jié)合進(jìn)行定性判斷。采用外標(biāo)法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 流動(dòng)相的選擇和洗脫條件優(yōu)化

對(duì)于12 種多甲氧基黃酮、香豆素和呋喃香豆素類物質(zhì)而言，因其母環(huán)都含有苯并吡喃酮結(jié)構(gòu)，性質(zhì)較為相似，因此需采用梯度洗脫的方式進(jìn)行分離。考慮傘形花內(nèi)酯及佛手酚等物質(zhì)含有易解離的酚羥基，故流動(dòng)相需為弱酸性以改變峰形和限制拖尾。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，加入乙酸調(diào)節(jié)pH值時(shí)存在較強(qiáng)的基線干擾，故選用干擾較小的0.01%磷酸溶液。設(shè)置原始流動(dòng)相洗脫程序?yàn)樾本€梯度：洗脫開始時(shí)，0.01%磷酸-乙腈溶液（50∶50，V/V）；洗脫時(shí)間為30 min時(shí)，0.01%磷酸-乙腈溶液（10∶90，V/V）。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，通過(guò)加入少量的甲醇可微調(diào)檸美內(nèi)酯、佛手柑內(nèi)酯、甜橙黃酮和異橙皮內(nèi)酯的相對(duì)位置，從而獲得最佳分離度。經(jīng)最終優(yōu)化后的洗脫程序見(jiàn)表2，在該條件下，得到12 種物質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)品（包含加入的內(nèi)標(biāo)物質(zhì)1）的紫外和熒光響應(yīng)色譜圖。如圖2所示，各物質(zhì)峰形良好，在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)所有成分的基線分離；熒光信號(hào)以倒峰的形式呈現(xiàn)，以便與紫外信號(hào)更清晰地對(duì)應(yīng)。除佛手酚和橘皮素外，其他物質(zhì)都有熒光響應(yīng)。

表2 流動(dòng)相洗脫程序Table 2 Gradient elution program

圖2 12 種標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照物質(zhì)及內(nèi)標(biāo)物質(zhì)的HPLC圖Fig. 2 HPLC chromatogram of mixture of twelve reference standards and internal standards

2.2 紫外、熒光光譜及其應(yīng)用

圖3 多甲氧基黃酮（A）、香豆素（B）和呋喃香豆素（C）的紫外吸收光譜（210～400 nm）和熒光發(fā)射光譜（340～560 nm）Fig. 3 UV spectra (210–400 nm) and fl uorescence emission spectra(340–560 nm) of polymethoxyfl avones, coumarins and furocoumarins

如圖3所示，F(xiàn)LD亦可記錄熒光的激發(fā)光譜，但由于激發(fā)光譜常與紫外吸收光譜類似，故本方法僅考慮發(fā)射光譜。總體上，各物質(zhì)的光譜信息具有特征性，故可據(jù)此將待分析樣品成分的光譜圖與標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的光譜圖進(jìn)行對(duì)比，對(duì)待測(cè)成分進(jìn)行準(zhǔn)確判斷。

表3 12 種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)紫外和熒光檢測(cè)線性關(guān)系、LOD和LOQTable 3 Linear relationship, limit of detection and limit of quantitation of UV and fl uorescence examination for the twelve reference standards

國(guó)內(nèi)大量關(guān)于柑橘成分分析的報(bào)道都是基于紫外光譜[26-30]。然而，受限于樣品濃度、儀器分辨率以及人為因素等，僅憑紫外光譜難免會(huì)有判斷誤差。如圖3所示，各組內(nèi)物質(zhì)紫外譜圖具有一定的相似性，如檸美內(nèi)酯和異橙皮內(nèi)酯的最大吸收波長(zhǎng)相近（324 nm和322 nm），佛手柑素和環(huán)氧佛手柑素的譜圖非常類似，這無(wú)疑對(duì)復(fù)雜樣品的準(zhǔn)確判斷提出了挑戰(zhàn)。熒光光譜的引入為解決這一問(wèn)題提供了輔助手段。檸美內(nèi)酯和異橙皮內(nèi)酯的熒光峰值發(fā)射波長(zhǎng)分別為437 nm和395 nm，佛手柑素和環(huán)氧佛手柑素波長(zhǎng)分別為479 nm和431 nm，均有明顯的區(qū)別。

本研究采用相同色譜條件下的紫外、熒光光譜以及保留時(shí)間3種不同手段，為樣品成分的準(zhǔn)確檢測(cè)設(shè)置三重保障。同時(shí)，利用光譜數(shù)據(jù)對(duì)定量分析的波長(zhǎng)進(jìn)行了折中選擇，最終確定為：紫外吸收波長(zhǎng)320nm，熒光激發(fā)波長(zhǎng)340 nm、發(fā)射波長(zhǎng)450 nm。異橙皮內(nèi)酯由于熒光最大發(fā)射波長(zhǎng)與其他物質(zhì)相差過(guò)大，故以波長(zhǎng)395 nm單獨(dú)定量。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限（limit of detection，LOD）和定量限（limit of quantitation，LOQ）結(jié)果

在上述色譜分析條件下，測(cè)定0.06～4500 mg/L系列質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。以測(cè)得各物質(zhì)積分峰面積為縱坐標(biāo)，質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。12 種物質(zhì)的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、方法LOD和LOQ如表3所示。測(cè)定質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，各物質(zhì)質(zhì)量濃度與峰面積呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，R2在0.9984以上。不同檢測(cè)方法所得LOD及LOQ各不相同，甜橙黃酮、檸美內(nèi)酯、東莨菪亭和佛手柑素用熒光檢測(cè)更加靈敏，其中東莨菪亭的熒光LOQ為0.0009 mg/L，比紫外檢測(cè)的靈敏度高100倍以上。

混合標(biāo)準(zhǔn)溶液中加入內(nèi)標(biāo)物質(zhì)補(bǔ)骨脂素，其目的是監(jiān)測(cè)在逐級(jí)稀釋的過(guò)程中各對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品加入量是否正確。對(duì)被測(cè)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)而言，其校正因子為常數(shù)，公式如下：

校正因子=（被測(cè)物濃度×內(nèi)標(biāo)物峰面積）/（被測(cè)物峰面積×內(nèi)標(biāo)物濃度）

2.4 回收率結(jié)果

分別對(duì)混合柑橘果汁樣品進(jìn)行80%、100%、120%3個(gè)水平的加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)做3 次重復(fù)，驗(yàn)證整套方法的準(zhǔn)確性。如表4所示，2 種方法檢測(cè)混合果汁中各成分的回收率所得結(jié)果相近，分別為紫外回收率95.2%～104.8%和熒光回收率94.5%～103.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.8%～4.1%和0.7%～4.1%。該結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)方法準(zhǔn)確度較高，利用紫外和熒光2 種方法同時(shí)定量分析PMFs、香豆素和呋喃香豆素具有高可信度。

表4 柑橘混合果汁加標(biāo)回收率Table 4 Recovery of the analytes in spiked samples of mixed citrus juice

2.5 樣品分析

采用1.3.2節(jié)和1.3.3節(jié)方法對(duì)NFC錦橙汁、鮮榨椪柑汁和NFC紅葡萄柚汁3 個(gè)樣品中的PMFs、香豆素和呋喃香豆素進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。如圖4所示，各樣品的紫外和熒光色譜圖在5 min以后呈現(xiàn)出良好的分離度，1～5 min范圍內(nèi)出現(xiàn)峰堆集情況，反映出乙酸乙酯提取了部分極性較強(qiáng)的成分。由圖4可見(jiàn)，不同品種的柑橘果汁中含有的PMFs、香豆素和呋喃香豆素差異較大，錦橙汁主要含PMFs以及少量的異橙皮內(nèi)酯；椪柑汁主要含PMFs，但甜橙黃酮含量較錦橙汁低；紅葡萄柚汁則主要含呋喃香豆素，如佛手酚和佛手柑素，以及少量的香豆素和PMFs；這3 類柑橘汁都不含東莨菪亭、傘形花內(nèi)酯和環(huán)氧佛手柑素。進(jìn)一步定量分析，由表5可知，各物質(zhì)含量的熒光和紫外測(cè)定值的差異范圍在-6.2%～9.7%以內(nèi)，兩者吻合度較好。紅葡萄柚含有極微量的檸美內(nèi)酯，其含量無(wú)法由紫外檢出，但可被熒光檢出并準(zhǔn)確定量；反之，椪柑中的七甲氧基黃酮可被紫外檢出，卻低于熒光的定量限。因此，結(jié)合紫外、熒光信號(hào)共同進(jìn)行定量檢測(cè)，有助于擴(kuò)大含量分析的范圍，提高定量的精度。

圖4 3 種柑橘果汁樣品的HPLC圖Fig. 4 HPLC chromatograms of three citrus juice samples

表5 3 種柑橘果汁樣品中的多甲氧基黃酮、香豆素和呋喃香豆素含量Table 5 Contents of polymethoxyfl avones, coumarins and furocoumarins in three citrus juice samples determined by HPLC-DAD-FLD

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)建立了HPLC-DAD-FLD同時(shí)檢測(cè)柑橘果汁中的12 種多甲氧基黃酮、香豆素及呋喃香豆素類物質(zhì)的方法，上述物質(zhì)在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)基線分離。采用2 種不同的檢測(cè)器可同時(shí)獲得各物質(zhì)的紫外和熒光光譜信息，提高檢測(cè)靈敏度，檢出限可低至μg/L級(jí)，能滿足柑橘果汁中該類氧雜環(huán)化合物的分析檢測(cè)要求。

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Simultaneous Determination of Twelve Compounds of Polymethoxyfl avones, Coumarins and Furocoumarins in Citrus Juices by Using HPLC-DAD-FLD

LI Guijie1,2,3,4, TAN Xiang1, WANG Hua1,*, WU Houjiu1, Russell ROUSEFF1
(1. Citrus Research Institute, Southwest University, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Chongqing 400712, China;2. Chongqing Collaborative Innovation Center for Functional Food, Chongqing Engineering Research Center of Functional Food,Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China;3. College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China;4. College of Biological and Chemical Engineering, Chongqing University of Education, Chongqing 400067, China)

A method using high performance liquid chromatography with diode array detection and fl uorescence detection(HPLC-DAD-FLD) was developed to simultaneously analyze 12 compounds of polymethoxyfl avones (PMFs), coumarins and furocoumarins in citrus juice samples. Baseline separation of twelve compounds was achieved within 30 min using gradient elution with a ternary mobile phase composed of 0.01% phosphoric acid, methanol and acetonitrile. Qualitative identifi cation of the components in citrus juices was confi rmed by comparing their UV and fl uorescence (FL) spectra and retention times with those of the reference standards. Quantitative analysis of the juice components was operated at a UV wavelength of 320 nm (OD320nm) and a fl uorescence emission of 450 nm. The calibration curves showed good linearity.The limit of quantitation (LOQ) with FLD was at as low as μg/L level so that FLD could be an important complementary tool to UV detection. The recovery tests showed a good accuracy for both UV (95.2%–104.8%) and FL (94.5%–103.5%)examination. In general, this method is accurate and reliable for qualitative and quantitative analysis of citrus juice components, especially the ones having fl uorescence emission like PMFs and coumarins.

high performance liquid chromatography (HPLC); fl uorescence detection; citrus juice; polymethoxyfl avones; coumarins

TS207.3

A

1002-6630（2017）20-0112-07

2016-12-29

公益性行業(yè)（農(nóng)業(yè)）科研專項(xiàng)（201503142-12）；重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心建設(shè)項(xiàng)目（167001）；

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)（XDJK2016E048）；重慶市功能性食品協(xié)同創(chuàng)新中心科研項(xiàng)目（ccicff-rp-201604）；

重慶市統(tǒng)籌城鄉(xiāng)教師教育研究中心2015年工作室項(xiàng)目（JDGZS201507）；

重慶第二師范學(xué)院2016年校級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201605）

李貴節(jié)（1983—），男，副教授，博士研究生，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)與營(yíng)養(yǎng)學(xué)及功能性食品學(xué)。E-mail：ligj@cque.edu.cn

*通信作者：王華（1963—），男，研究員，本科，研究方向?yàn)楦涕偌庸ぁ-mail：wanghua@cric.cn

李貴節(jié), 譚祥, 王華, 等. HPLC-DAD-FLD同時(shí)測(cè)定柑橘果汁中12 種多甲氧基黃酮和香豆素類物質(zhì)[J]. 食品科學(xué), 2017,38(20): 112-118. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201720016. http://www.spkx.net.cn

LI Guijie, TAN Xiang, WANG Hua, et al. Simultaneous determination of twelve compounds of polymethoxyflavones,coumarins and furocoumarins in citrus juices by using HPLC-DAD-FLD[J]. Food Science, 2017, 38(20)∶ 112-118.(in Chinese with English abstract) DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720016. http∶//www.spkx.net.cn

DOI∶10.7506/spkx1002-6630-201720016