臧國(guó)棟，楊欽沾，陳孟君，林玉嬋

（惠州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心，廣東惠州516008）

液相串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定核桃中5種黃曲霉毒素

臧國(guó)棟，楊欽沾，陳孟君，林玉嬋

（惠州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心，廣東惠州516008）

建立核桃中黃曲霉毒素G1、G2、B1、B2、M1的測(cè)定方法。核桃經(jīng)70%甲醇溶液提取、免疫親和柱凈化后，用高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜分析法測(cè)定。黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1在 0.5 μg/L～50 μg/L 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系，r＞0.999?；厥章试?6.5%～98.0%之間。此方法定量準(zhǔn)確、專屬性比較強(qiáng)，假陽(yáng)性率低，有較普遍的實(shí)用性，適合核桃中黃曲霉毒素的測(cè)定。

核桃；三重四級(jí)桿質(zhì)譜；黃曲霉毒素

Abstract：To establish the determination method of Aflatoxins G1，G2，B1，B2，M1in walnut.Walnut was extracted by 70%methanol solution，purified by immunoaffinity column and analyzed by ultra high performance liquid chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry.The linear relationship between the peak area of Aflatoxins G1，G2，B1，B2，M1was 0.5 μg/L-50 μg/L，r＞ 0.999.The recoveries ranged from 86.5%to 98.0%.This method was accurate，and the specificity was relatively strong，the false positive rate was low，there were more general practicality，it was suitable for the determination ofAflatoxinsin walnut.

Key words：walnut；triple quadrupole mass spectrum；Aflatoxins

黃曲霉毒素（Aflatoxins）是生長(zhǎng)在食物及飼料中的黃曲霉（Aspergillus flavus）和寄生曲霉代謝的一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的產(chǎn)物，黃曲霉毒素具有強(qiáng)毒性和致癌性，其中黃曲霉毒素B1急性毒性是氰化鉀的10倍，慢性中毒可誘發(fā)肝癌[1-3]。黃曲霉毒素存在于土壤、動(dòng)植物、各種堅(jiān)果，特別是花生和核桃中。1993年被世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為一類致癌物[4]，是人類原發(fā)性肝癌的主要致病因素之一，目前大多數(shù)國(guó)家和地區(qū)都已出臺(tái)相關(guān)法律，對(duì)食品和飼料中黃曲霉毒素含量進(jìn)行嚴(yán)格控制。鑒于黃曲霉毒素對(duì)人類的健康造成的危害，世界上許多國(guó)家已建立黃曲霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn)。因此，對(duì)各類油脂中黃曲霉毒素含量的檢測(cè)不可缺少，而目前油脂中黃曲霉毒素常用檢測(cè)方法包括薄層色譜法、酶聯(lián)免疫化學(xué)分析法、液質(zhì)聯(lián)用法、微柱篩選法和高效液相色譜法。在本研究中，我們建立用高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜對(duì)核桃中的黃曲霉毒素G1、G2、B1、B2、M1進(jìn)行測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent G6460三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀，配電噴霧離子源，配Agilent 1290超高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent公司；TGL-16M高速冷凍離心機(jī)：湘儀離心機(jī)公司；SC-8L-150數(shù)控固相萃取裝置：廣州智真生物公司；MCX 固相萃取小柱（60 mg，3 mL）：美國(guó) Waters公司；微孔濾膜（0.22 μm）：天津津騰公司；

黃曲霉毒素總量免疫親和柱（3mL/60mg）：美國(guó)Beacon；黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液：農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所；黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1的濃度均為 1.0 μg/mL；核桃：市場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)；甲醇、乙腈（均為色譜純）：MERCK公司；試劑（均為分析純）：中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司。

1.2 液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse PlusC18柱，2.1 mm×50 mm×1.8μm（Agilent公司）；柱溫：30℃；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：A為0.2%甲酸水溶液，B為乙腈；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 流動(dòng)相條件Table 1 Mobile phase conditions

1.3 質(zhì)譜條件

電離方式：電噴霧電離源（ESI），正離子模式掃描，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)（multiple-reaction monitoring，MRM），離子源溫度：350℃；氣體：氮?dú)?；干燥氣流速? L/min；霧化器壓力：310 kPa；鞘氣溫度：350℃；經(jīng)過(guò)對(duì)毛細(xì)管出口電壓、碰撞池能量等質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，最終確定黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1質(zhì)譜條件見(jiàn)表2。

表2 黃曲霉毒素G1、G2、B1、B2、M1檢測(cè)的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters of Aflatoxins G1，G2，B1，B2，M1

1.4 樣品預(yù)處理

準(zhǔn)確取粉碎均質(zhì)樣品5.0 g加入1.0 g氯化鈉和70%甲醇水溶液25 mL，均質(zhì)器高速攪拌提取1 min，然后超聲處理10 min，10 000 r/min離心5 min，定性濾紙過(guò)濾，吸取上清液5 mL，用水稀釋至20 mL，搖勻，待凈化。取10 mL待測(cè)液，緩慢通過(guò)免疫親和柱，流速控制在1 mL/min左右，再用10 mL純水淋洗，棄去淋洗液，準(zhǔn)確加入1.0 mL甲醇洗脫，流速控制在1 mL/min～2mL/min，收集甲醇洗脫液，渦旋混合1 min，過(guò)0.22 μm微孔濾膜于進(jìn)樣瓶，供液質(zhì)分析。

2 結(jié)果

2.1 線性關(guān)系

配制黃曲霉毒素（AFT）G1、G2、B1、B2、M1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度從 0.5 μg/L～50.0 μg/L，進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果表明：在 0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L 的濃度范圍內(nèi)，黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1都具有良好的線性，線性相關(guān)系數(shù)r大于0.999，記錄各待測(cè)組分色譜峰面積，以各成份的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），各成份的峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行回歸分析，校正曲線結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Regression equation and correlation coefficient

2.2 檢出限及定量限

以3倍信噪比（S/N=3）對(duì)應(yīng)的濃度作為方法檢出限（LOD），以10倍信噪比（S/N=10）對(duì)應(yīng)的濃度作為方法定量限（LOQ），5種黃曲霉毒素的檢出限為0.2μg/kg～0.3 μg/kg，定量限為 0.5 μg/kg～1.0 μg/kg，均滿足檢測(cè)要求，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 5種黃曲霉毒素檢出限和定量限Table 4 LOD and LOQ about 5 kinds of Aflatoxins

2.3 回收率及精密度

在核桃陰性樣品中添加3.0 μg/L及10.0 μg/L黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.4方法進(jìn)行前處理，平行測(cè)定6次，得到方法平均回收率及精密度，結(jié)果如表5所示。5種黃曲霉素的平均回收率為86.5%～98.0%，RSD為0.3%～2.9%。

2.4 樣品測(cè)定結(jié)果

按擬訂方法測(cè)定核桃樣品，結(jié)果未檢出黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1。

表5 5種黃曲霉毒素回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 5 Recovery and relative standard deviation about 5 kinds ofAflatoxins（n=6）

3 討論

3.1 提取劑的選擇

黃曲霉毒素易溶于有機(jī)試劑甲醇和乙腈，普遍采用的提取方法是用一定比例的甲醇水[5-7]或乙腈水[8-9]來(lái)提取樣品中的黃曲霉毒素，本文選用70%甲醇水溶液為提取劑。

3.2 凈化小柱的選擇

目前，用于黃曲霉毒素分離純化的固相萃取方法有多功能凈化柱[1]、免疫親和柱[10-11]和分散固相萃取法（C18）[12]等，由于免疫親和柱，本文使用免疫親和柱凈化樣品。靈敏度高，用凝膠作為固相載體，與黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1高特異性的單克隆抗體共價(jià)連接，可以有效除去雜質(zhì)，相比傳統(tǒng)凈化方法，操作簡(jiǎn)單快速靈敏度高，可實(shí)現(xiàn)較大量樣品的提取。

3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

在電噴霧正離子監(jiān)測(cè)模式下對(duì)AFT B1、AFT B2、AFT G1、AFT G2進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描，得到母離子；然后對(duì)母離子進(jìn)行子離子掃描（Product Ion Scan）得到子離子；對(duì)裂解電壓（Fragmentor）和碰撞能量（CE）等二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化，以由母離子產(chǎn)生的子離子豐度達(dá)到最大時(shí)為最優(yōu)，選擇兩個(gè)豐度最高一對(duì)子離子作為定量和定性離子。

3.4 液相條件的優(yōu)化

普遍用乙腈-水作為流動(dòng)相，質(zhì)譜靈敏度高，在乙腈-水中加入甲酸有助于待測(cè)物母離子 [M＋H]＋的形成，而且隨著甲酸濃度的增加，質(zhì)譜響應(yīng)值增加，超過(guò)一定的濃度反而下降[13-14]，本文采用乙腈-水（0.2%甲酸）作為流動(dòng)相。因?yàn)?種黃曲霉毒素的分子結(jié)構(gòu)比較接近，采用梯度洗脫能較好的得到分離。

4 結(jié)論

目前，黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1文獻(xiàn)記載的測(cè)定方法有液相色譜法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、熒光分光光度法等[4]，我國(guó)現(xiàn)在還沒(méi)有黃曲霉毒素的質(zhì)譜檢法的國(guó)標(biāo)，與以前的方法相比，本文采用免疫親和柱凈化樣品，用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析樣品，優(yōu)點(diǎn)在于待分析樣品無(wú)需衍生，可直接分析測(cè)定，大大減少了分析的時(shí)間，結(jié)果準(zhǔn)確性和檢測(cè)靈敏度大幅度提高，此方法快速、靈敏、準(zhǔn)確、專屬性比較強(qiáng)，假陽(yáng)性率低，有較普遍的實(shí)用性，是核桃及其其它堅(jiān)果中的黃曲霉毒素測(cè)定較好的參考方法。

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Determination of Aflatoxins G1，G2，B1，B2and M1in Walnut by HPLC-MS/MS

ZANG Guo-dong，YANG Qin-zhan，CHEN Meng-jun，LIN Yu-chan
（Huizhou Center for Agricultural Products Quality and Safety Supervision and Testing，Huizhou 516008，Guangzhou，China）

2017-02-21

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.028

惠州市科技計(jì)劃項(xiàng)目（2014B40008003）

臧國(guó)棟（1981—），男（漢），碩士，研究方向：抗逆分子生物學(xué)。