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        液相串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定核桃中5種黃曲霉毒素

        2017-10-11 08:06:30臧國棟楊欽沾陳孟君林玉嬋
        食品研究與開發(fā) 2017年19期
        關(guān)鍵詞:親和柱黃曲霉乙腈

        臧國棟,楊欽沾,陳孟君,林玉嬋

        (惠州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心,廣東惠州516008)

        液相串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定核桃中5種黃曲霉毒素

        臧國棟,楊欽沾,陳孟君,林玉嬋

        (惠州市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心,廣東惠州516008)

        建立核桃中黃曲霉毒素G1、G2、B1、B2、M1的測(cè)定方法。核桃經(jīng)70%甲醇溶液提取、免疫親和柱凈化后,用高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜分析法測(cè)定。黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1在 0.5 μg/L~50 μg/L 范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系,r>0.999。回收率在86.5%~98.0%之間。此方法定量準(zhǔn)確、專屬性比較強(qiáng),假陽性率低,有較普遍的實(shí)用性,適合核桃中黃曲霉毒素的測(cè)定。

        核桃;三重四級(jí)桿質(zhì)譜;黃曲霉毒素

        Abstract:To establish the determination method of Aflatoxins G1,G2,B1,B2,M1in walnut.Walnut was extracted by 70%methanol solution,purified by immunoaffinity column and analyzed by ultra high performance liquid chromatography-tandem triple quadrupole mass spectrometry.The linear relationship between the peak area of Aflatoxins G1,G2,B1,B2,M1was 0.5 μg/L-50 μg/L,r> 0.999.The recoveries ranged from 86.5%to 98.0%.This method was accurate,and the specificity was relatively strong,the false positive rate was low,there were more general practicality,it was suitable for the determination ofAflatoxinsin walnut.

        Key words:walnut;triple quadrupole mass spectrum;Aflatoxins

        黃曲霉毒素(Aflatoxins)是生長(zhǎng)在食物及飼料中的黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉代謝的一組化學(xué)結(jié)構(gòu)類似的產(chǎn)物,黃曲霉毒素具有強(qiáng)毒性和致癌性,其中黃曲霉毒素B1急性毒性是氰化鉀的10倍,慢性中毒可誘發(fā)肝癌[1-3]。黃曲霉毒素存在于土壤、動(dòng)植物、各種堅(jiān)果,特別是花生和核桃中。1993年被世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)的癌癥研究機(jī)構(gòu)劃定為一類致癌物[4],是人類原發(fā)性肝癌的主要致病因素之一,目前大多數(shù)國家和地區(qū)都已出臺(tái)相關(guān)法律,對(duì)食品和飼料中黃曲霉毒素含量進(jìn)行嚴(yán)格控制。鑒于黃曲霉毒素對(duì)人類的健康造成的危害,世界上許多國家已建立黃曲霉毒素限量標(biāo)準(zhǔn)。因此,對(duì)各類油脂中黃曲霉毒素含量的檢測(cè)不可缺少,而目前油脂中黃曲霉毒素常用檢測(cè)方法包括薄層色譜法、酶聯(lián)免疫化學(xué)分析法、液質(zhì)聯(lián)用法、微柱篩選法和高效液相色譜法。在本研究中,我們建立用高效液相色譜-串聯(lián)三重四極桿質(zhì)譜對(duì)核桃中的黃曲霉毒素G1、G2、B1、B2、M1進(jìn)行測(cè)定。

        1 材料與方法

        1.1 儀器與試劑

        Agilent G6460三重串聯(lián)四極桿質(zhì)譜儀,配電噴霧離子源,配Agilent 1290超高效液相色譜儀:美國Agilent公司;TGL-16M高速冷凍離心機(jī):湘儀離心機(jī)公司;SC-8L-150數(shù)控固相萃取裝置:廣州智真生物公司;MCX 固相萃取小柱(60 mg,3 mL):美國 Waters公司;微孔濾膜(0.22 μm):天津津騰公司;

        黃曲霉毒素總量免疫親和柱(3mL/60mg):美國Beacon;黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1標(biāo)準(zhǔn)品溶液:農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所;黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1的濃度均為 1.0 μg/mL;核桃:市場(chǎng)購買;甲醇、乙腈(均為色譜純):MERCK公司;試劑(均為分析純):中國醫(yī)藥(集團(tuán))上海化學(xué)試劑公司。

        1.2 液相色譜條件

        色譜柱:ZORBAX Eclipse PlusC18柱,2.1 mm×50 mm×1.8μm(Agilent公司);柱溫:30℃;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣量:10 μL;流動(dòng)相:A為0.2%甲酸水溶液,B為乙腈;梯度洗脫程序見表1。

        表1 流動(dòng)相條件Table 1 Mobile phase conditions

        1.3 質(zhì)譜條件

        電離方式:電噴霧電離源(ESI),正離子模式掃描,多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(multiple-reaction monitoring,MRM),離子源溫度:350℃;氣體:氮?dú)猓桓稍餁饬魉伲? L/min;霧化器壓力:310 kPa;鞘氣溫度:350℃;經(jīng)過對(duì)毛細(xì)管出口電壓、碰撞池能量等質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化,最終確定黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1質(zhì)譜條件見表2。

        表2 黃曲霉毒素G1、G2、B1、B2、M1檢測(cè)的質(zhì)譜參數(shù)Table 2 Mass spectrometry parameters of Aflatoxins G1,G2,B1,B2,M1

        1.4 樣品預(yù)處理

        準(zhǔn)確取粉碎均質(zhì)樣品5.0 g加入1.0 g氯化鈉和70%甲醇水溶液25 mL,均質(zhì)器高速攪拌提取1 min,然后超聲處理10 min,10 000 r/min離心5 min,定性濾紙過濾,吸取上清液5 mL,用水稀釋至20 mL,搖勻,待凈化。取10 mL待測(cè)液,緩慢通過免疫親和柱,流速控制在1 mL/min左右,再用10 mL純水淋洗,棄去淋洗液,準(zhǔn)確加入1.0 mL甲醇洗脫,流速控制在1 mL/min~2mL/min,收集甲醇洗脫液,渦旋混合1 min,過0.22 μm微孔濾膜于進(jìn)樣瓶,供液質(zhì)分析。

        2 結(jié)果

        2.1 線性關(guān)系

        配制黃曲霉毒素(AFT)G1、G2、B1、B2、M1混合標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度從 0.5 μg/L~50.0 μg/L,進(jìn)行檢測(cè)分析,結(jié)果表明:在 0.5、1.0、5.0、10.0、20.0、50.0 μg/L 的濃度范圍內(nèi),黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1都具有良好的線性,線性相關(guān)系數(shù)r大于0.999,記錄各待測(cè)組分色譜峰面積,以各成份的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X),各成份的峰面積為縱坐標(biāo)(Y),進(jìn)行回歸分析,校正曲線結(jié)果見表3。

        表3 回歸方程和相關(guān)系數(shù)Table 3 Regression equation and correlation coefficient

        2.2 檢出限及定量限

        以3倍信噪比(S/N=3)對(duì)應(yīng)的濃度作為方法檢出限(LOD),以10倍信噪比(S/N=10)對(duì)應(yīng)的濃度作為方法定量限(LOQ),5種黃曲霉毒素的檢出限為0.2μg/kg~0.3 μg/kg,定量限為 0.5 μg/kg~1.0 μg/kg,均滿足檢測(cè)要求,結(jié)果見表4。

        表4 5種黃曲霉毒素檢出限和定量限Table 4 LOD and LOQ about 5 kinds of Aflatoxins

        2.3 回收率及精密度

        在核桃陰性樣品中添加3.0 μg/L及10.0 μg/L黃曲霉毒素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,按1.4方法進(jìn)行前處理,平行測(cè)定6次,得到方法平均回收率及精密度,結(jié)果如表5所示。5種黃曲霉素的平均回收率為86.5%~98.0%,RSD為0.3%~2.9%。

        2.4 樣品測(cè)定結(jié)果

        按擬訂方法測(cè)定核桃樣品,結(jié)果未檢出黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1。

        表5 5種黃曲霉毒素回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(n=6)Table 5 Recovery and relative standard deviation about 5 kinds ofAflatoxins(n=6)

        3 討論

        3.1 提取劑的選擇

        黃曲霉毒素易溶于有機(jī)試劑甲醇和乙腈,普遍采用的提取方法是用一定比例的甲醇水[5-7]或乙腈水[8-9]來提取樣品中的黃曲霉毒素,本文選用70%甲醇水溶液為提取劑。

        3.2 凈化小柱的選擇

        目前,用于黃曲霉毒素分離純化的固相萃取方法有多功能凈化柱[1]、免疫親和柱[10-11]和分散固相萃取法(C18)[12]等,由于免疫親和柱,本文使用免疫親和柱凈化樣品。靈敏度高,用凝膠作為固相載體,與黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1高特異性的單克隆抗體共價(jià)連接,可以有效除去雜質(zhì),相比傳統(tǒng)凈化方法,操作簡(jiǎn)單快速靈敏度高,可實(shí)現(xiàn)較大量樣品的提取。

        3.3 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

        在電噴霧正離子監(jiān)測(cè)模式下對(duì)AFT B1、AFT B2、AFT G1、AFT G2進(jìn)行一級(jí)質(zhì)譜掃描,得到母離子;然后對(duì)母離子進(jìn)行子離子掃描(Product Ion Scan)得到子離子;對(duì)裂解電壓(Fragmentor)和碰撞能量(CE)等二級(jí)質(zhì)譜參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,以由母離子產(chǎn)生的子離子豐度達(dá)到最大時(shí)為最優(yōu),選擇兩個(gè)豐度最高一對(duì)子離子作為定量和定性離子。

        3.4 液相條件的優(yōu)化

        普遍用乙腈-水作為流動(dòng)相,質(zhì)譜靈敏度高,在乙腈-水中加入甲酸有助于待測(cè)物母離子 [M+H]+的形成,而且隨著甲酸濃度的增加,質(zhì)譜響應(yīng)值增加,超過一定的濃度反而下降[13-14],本文采用乙腈-水(0.2%甲酸)作為流動(dòng)相。因?yàn)?種黃曲霉毒素的分子結(jié)構(gòu)比較接近,采用梯度洗脫能較好的得到分離。

        4 結(jié)論

        目前,黃曲霉毒素 G1、G2、B1、B2、M1文獻(xiàn)記載的測(cè)定方法有液相色譜法、薄層色譜法、酶聯(lián)免疫法、熒光分光光度法等[4],我國現(xiàn)在還沒有黃曲霉毒素的質(zhì)譜檢法的國標(biāo),與以前的方法相比,本文采用免疫親和柱凈化樣品,用高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜分析樣品,優(yōu)點(diǎn)在于待分析樣品無需衍生,可直接分析測(cè)定,大大減少了分析的時(shí)間,結(jié)果準(zhǔn)確性和檢測(cè)靈敏度大幅度提高,此方法快速、靈敏、準(zhǔn)確、專屬性比較強(qiáng),假陽性率低,有較普遍的實(shí)用性,是核桃及其其它堅(jiān)果中的黃曲霉毒素測(cè)定較好的參考方法。

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        Determination of Aflatoxins G1,G2,B1,B2and M1in Walnut by HPLC-MS/MS

        ZANG Guo-dong,YANG Qin-zhan,CHEN Meng-jun,LIN Yu-chan
        (Huizhou Center for Agricultural Products Quality and Safety Supervision and Testing,Huizhou 516008,Guangzhou,China)

        2017-02-21

        10.3969/j.issn.1005-6521.2017.19.028

        惠州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014B40008003)

        臧國棟(1981—),男(漢),碩士,研究方向:抗逆分子生物學(xué)。

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