桑雷 孫世坤 陳冬金 陳巖峰 謝喜平 （福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 350013）

福建黃兔INHBA基因5’端cDNA克隆及序列分析

桑雷 孫世坤 陳冬金 陳巖峰 謝喜平 （福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所 350013）

為擴(kuò)增福建黃兔INHBA基因5'端，根據(jù)GenBank上已公布的家兔序列KC831577，設(shè)計(jì)了2條巢式引物，利用5'RACE技術(shù)克隆福建黃兔INHBA基因5'端序列，獲得1個(gè)682bp片段，對(duì)該片段克隆測(cè)序，獲得包括5'UTR、第1外顯子及部分第1內(nèi)含子的片段。利用在線軟件預(yù)測(cè)在-229～-180bp處存在可能的啟動(dòng)子，同時(shí)還發(fā)現(xiàn)9個(gè)潛在轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，其中包含對(duì)轉(zhuǎn)錄有重要調(diào)控作用的TATA-box位點(diǎn)。

福建黃兔；片段；克??；INHBA；5'RACE；啟動(dòng)子；序列分析

抑制素屬于TGF-β （transforming growth factor-bata，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β）超家族成員之一，由α、β兩個(gè)亞基組成的二聚體糖蛋白激素，此類(lèi)激素通過(guò)負(fù)反饋調(diào)節(jié)FSH（follicle stimulating hormone，卵泡雌激素）合成與分泌，從而影響卵泡發(fā)育和精子發(fā)生[1,2]。抑制素β亞基有βA和βB兩種形式，其中α亞基和βA組成抑制素A，此外βA與自身通過(guò)二硫鍵連接組成活化素A（Activin A，ACTA）以及與βB亞基組成活化素B（Activin B，ACTB）[3]。在母畜中，抑制素βA是影響山羊、綿羊產(chǎn)羔數(shù)的重要基因[4,5]。在公畜中，抑制素βA是影響荷斯坦公牛射精量及精子密度的重要因素[6]。目前對(duì)福建黃兔INHBA基因研究甚少，尤其cDNA 5’UTR(untranslated region，非翻譯區(qū))序列未見(jiàn)有報(bào)導(dǎo)，本研究目的是解析福建黃兔INHBA基因啟動(dòng)子序列及結(jié)構(gòu)特征，為進(jìn)一步研究福建黃兔INHBA基因調(diào)控與繁殖性狀的關(guān)聯(lián)分析提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及組織

性成熟的福建黃兔母兔由福建連江玉華山生態(tài)試驗(yàn)場(chǎng)購(gòu)買(mǎi)。黃兔母兔屠宰后立刻取卵巢組織，放入液氮罐中，備用。

1.2 總RNA提取

使用RNAiso Plus（Takara）提取黃兔卵巢組織中的總RNA，然后用不含RNA酶的Recombiant DNase I(Taraka)去除基因組DNA，隨后溶于DEPC水，中保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設(shè)計(jì)及合成

本試驗(yàn)以已獲得的INHBA cDNA部分序列 （KC831577）設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增5’端序列[7]，由上海生工合成，引物的部分序列見(jiàn)表1。

1.4 5'RACE前處理及反轉(zhuǎn)錄

使用Takara 5’Full RACE Kit with TAP對(duì)5μg的總DNA進(jìn)行CIAP、TAP處理，并與5’RACE Adaptor連接后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。cDNA反轉(zhuǎn)錄體系：連接好的RNA 6μl，隨機(jī) 引 物（ 50μM） 0.5μl， dNTPs Mixture(各 10mM)1μl，RNase Inhibitor （40U/μl） 0.25μl， 5×M-MLV buffer 2μl， Reverse Transcriptase M-MLV （200U/μl） 0.25μl。 RT 反應(yīng)條件為：30℃下10min，42℃下60min，70℃下15min，反應(yīng)結(jié)束后將cDNA產(chǎn)物保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 PCR擴(kuò)增

取上述反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液稀釋5倍取2μl，10μM上、下游引物 （INHBA 1， Outer primer） 各 2μl， 2×GC buffer 25μl， 5U/μl LA Taq?（Takara） 0.5μl， 用水補(bǔ)足至 50μl體系。 反應(yīng)條件為： 94℃下 3min； 94℃下 30s， 60℃下 30s， 72℃下 2min，30個(gè)循環(huán)；72℃下10min。取上述PCR產(chǎn)物1μl作為模板，上、 下游引物 （INHNA 2， Inner primer） 各取 2μl， dNTP（各 2.5mM） 8μl， 2×GC buffer25μl， 5U/μl LA Taq?（Takara）0.5μl，用水補(bǔ)足至50μl體系。反應(yīng)條件為：94℃下3min；94℃下 30s， 60℃下 30s， 72℃下 2min， 30個(gè)循環(huán)； 72℃下10min。取5μl進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

1.6 克隆測(cè)序

將膠回收試劑盒切膠回收的PCR產(chǎn)物 （約700bp）與pMD18-T載體連接后轉(zhuǎn)染至DH5α細(xì)胞中，涂平板37℃培養(yǎng)12h，挑選陽(yáng)性克隆用PCR法鑒定重組質(zhì)粒。隨后將鑒定過(guò)質(zhì)粒送至寶生物工程 （大連）有限公司進(jìn)行測(cè)序。

2 結(jié)果與分析

2.1 兔INHBA基因5'UTR區(qū)擴(kuò)增

經(jīng)過(guò)1%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，3’RACE產(chǎn)物為大約700bp的條帶 （圖1），與預(yù)期的產(chǎn)物大小一致。將擴(kuò)增產(chǎn)物送至寶生物工程 (大連)有限公司進(jìn)行測(cè)序，最后得到1個(gè)682bp片段。從獲得序列分析結(jié)果來(lái)看，所獲得序列包含1個(gè)5’UTR(280bp)，第1外顯子 （288bp）以及部分第1內(nèi)含子 （14bp）（見(jiàn)圖2）。

圖1 黃兔INHBA 5’端擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖電泳

圖2 福建黃兔INHBA基因5’UTR區(qū)序列分析

2.2 兔INHBA基因的生物信息學(xué)分析

將測(cè)序得到的兔INHBA基因5’UTR區(qū)序列用BDGP∶NeuralNetwork PromoterPrediction （ http∶//www.fruitfly.org/seq_tools/promoter.html）進(jìn)行啟動(dòng)子位點(diǎn)預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)在-229～-180bp處存在可能的啟動(dòng)子位點(diǎn)，得分為0.92，具體位置見(jiàn)圖2。

將測(cè)序得到的兔INHBA基因5’UTR序列用BIMAS網(wǎng)站的 Promoter Scan （https∶//www-bimas.cit.nih.gov/molbio/） 預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)9個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn) （表2），其中-273bp處存在 3種TFFIID結(jié)合位點(diǎn)，分別為T(mén)ATA-box.2、 Ad2MLP US.5、 TATA-box-CS， 其中 TATA-box.2為真核生物共有的轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)，Ad2MLP US.5、TATA-box-CS為哺乳動(dòng)物特有的TFIID結(jié)合位點(diǎn)，-208bp、-206bp存在激活蛋白AP-2（activator protein-2）結(jié)合位點(diǎn)，此外還存在 glucagon-G3A （-230bp）、 UCE.2 （-227bp）、JCV_repeated_sequence（-58bp）轉(zhuǎn)錄結(jié)合位點(diǎn)。

表1 PCR引物擴(kuò)增序列

表2 轉(zhuǎn)錄結(jié)合因子

3 討論

TFIID（Transcription factor IID，轉(zhuǎn)錄因子IID）由TBP（TATA-box binding protein，TATA結(jié)合蛋白）和多種TBP協(xié)同因子 （TBP-associated factors，TAFs）組成，是真核生物中唯一具有位點(diǎn)特異的DNA結(jié)合能力的因子。TFIID能識(shí)別TATA位點(diǎn)并與之結(jié)合，形成TFIID-啟動(dòng)子復(fù)合物，指導(dǎo)其他轉(zhuǎn)錄因子與RNA聚合酶II形成轉(zhuǎn)錄起始復(fù)合物 (transcriptional preinitiation complex），引發(fā)RNA的合成過(guò)程[8]。UCE(upstream control element，上游控制元件)，與核心啟動(dòng)子（core promoter） 一起被 UBF （upstream binding factor， 上游結(jié)合因子）結(jié)合，再與SL1（selectivity factor 1，選擇性因子1）一起促進(jìn)轉(zhuǎn)錄[9]。GCF（GC binding factor，GC結(jié)合因子）是一種轉(zhuǎn)錄抑制因子，通過(guò)與上游啟動(dòng)子中富含GC序列的區(qū)域特異結(jié)合，進(jìn)而抑制基因的轉(zhuǎn)錄[10]。AP-2（activator protein-2，激活蛋白-2）是一種DNA結(jié)合蛋白，參與調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄及細(xì)胞增殖、分化、凋亡[11]。Csh1、PRP-I及PAG1等基因上游有AP-2結(jié)合位點(diǎn)，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)Csh1、PRP-I及PAG1與胎盤(pán)子葉和胚胎發(fā)育相關(guān)，敲除小鼠胚胎細(xì)胞AP-2基因會(huì)導(dǎo)致合體滋養(yǎng)層細(xì)胞喪失增殖能力[12,13]。研究發(fā)現(xiàn)人滋養(yǎng)層細(xì)胞的hCG、hCSH1和hGRH等基因上游區(qū)域存在AP-2結(jié)合位點(diǎn)，這些基因的特異表達(dá)受AP-2家族的調(diào)控[14,15]。INHBA基因上GCF和AP-2位點(diǎn)是否與表達(dá)調(diào)控相關(guān)，有待進(jìn)一步的驗(yàn)證。

4 小結(jié)

本研究利用5’RACE技術(shù)獲得INHBA基因5’端1個(gè)682bp片段，通過(guò)克隆測(cè)序獲得了其5’UTR序列。通過(guò)在線分析軟件預(yù)測(cè)福建黃兔INHBA基因轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位置及啟動(dòng)子序列，為進(jìn)一步研究福建黃兔INHBA在生殖軸中的表達(dá)機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

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項(xiàng)目資金：福建省公益類(lèi)研究院所專(zhuān)項(xiàng) “閩西南黑兔FABP4基因的克隆、多態(tài)性及與生長(zhǎng)、肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析”（2015R1023-13）；福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)PI項(xiàng)目 “家兔優(yōu)良品種資源創(chuàng)新育種研究”（2016PI-11）；福建農(nóng)業(yè)科學(xué)院杰出青年人才基金 “閩西南黑兔FABP4基因的克隆、多態(tài)性及與生長(zhǎng)、肉質(zhì)性狀的關(guān)聯(lián)分析”（2014JQ-1）。

桑雷 （1981-），男，漢族，博士，助理研究員，從事草食動(dòng)物遺傳育種與繁殖工作。