張洋　李青　梅麗娟

摘要：利用稀釋平板計(jì)數(shù)和PCR-變性梯度凝膠電泳（簡稱PCR-DGGE）等方法，分析化肥（FT）、普通有機(jī)肥+化肥（FC）、微生物有機(jī)肥+化肥（FB）、不施肥（CK）等不同基肥處理?xiàng)l件下，連作1、3、5、7茬黃瓜土壤細(xì)菌、放線菌、真菌數(shù)量及多樣性的動態(tài)變化。結(jié)果表明：（1）隨著連作茬數(shù)的增加，根際土壤微生物數(shù)量呈逐漸增加趨勢；（2）與對照相比，施用化肥處理總體上明顯促進(jìn)了連作土壤中放線菌、真菌數(shù)量的增加，而對細(xì)菌數(shù)量的增加有明顯的抑制作用，施用普通有機(jī)肥+化肥對細(xì)菌、放線菌數(shù)量的增加均有不同程度的促進(jìn)作用；（3）連作及不同施肥方式對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均能產(chǎn)生不同程度的影響，除對照處理外，其他施肥處理土壤細(xì)菌多樣性及豐富度隨著連作茬數(shù)的增加呈下降趨勢，相對于化肥及普通有機(jī)肥+化肥處理，微生物有機(jī)肥+化肥處理對維持連作過程細(xì)菌多樣性及豐富度具有明顯作用；（4）連作均促進(jìn)了FT、FB、FC等3種施肥處理根際土壤真菌多樣性及豐富度的上升，但與對照相比上升幅度較小，在連作7茬后土壤真菌多樣性及豐富度表現(xiàn)為FB>FC>FT。

關(guān)鍵詞：施肥方式；黃瓜連作；細(xì)菌；真菌；多樣性；PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）

中圖分類號： S154.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0231-05

隨著我國現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的不斷發(fā)展，設(shè)施栽培面積逐年增加并呈規(guī)?；厔荨Ｔ谑袌鼋?jīng)濟(jì)驅(qū)動下的商品化設(shè)施蔬菜生產(chǎn)中，連作障礙普遍發(fā)生。黃瓜作為設(shè)施蔬菜的主要品種之一，近年來其連作障礙的發(fā)生機(jī)制及防治受到學(xué)者們的廣泛關(guān)注。已有研究表明，自毒作用、土壤理化性質(zhì)劣化、土壤微生物區(qū)系失衡是黃瓜連作障礙發(fā)生的主要原因[1-2]，并且認(rèn)為土壤滅菌[3]、嫁接[4]、合理輪作[5]、施用有機(jī)肥及微生物肥料[6-7]等措施可有效防止黃瓜連作障礙的發(fā)生。其中施用有機(jī)肥在平衡礦質(zhì)營養(yǎng)、提高作物品質(zhì)和產(chǎn)量的同時，可提高土壤微生物活性，有利于土壤健康微生物區(qū)系的形成[8-10]。作為一種方便、低成本的農(nóng)藝措施，合理施用有機(jī)肥對黃瓜連作障礙的預(yù)防與控制具有重要的實(shí)踐意義。目前有關(guān)施肥方式對黃瓜連作土壤微生物區(qū)系影響的研究較少，關(guān)于不同施肥方式對黃瓜連作過程土壤微生物區(qū)系及多樣性動態(tài)變化的研究更是鮮有報(bào)道[10-12]。本研究基于無機(jī)肥（化肥）、有機(jī)肥、微生物有機(jī)肥，設(shè)置不同的施肥處理，跟蹤分析不同施肥條件下大棚黃瓜連作過程中土壤微生物區(qū)系及多樣性的動態(tài)變化，以期為黃瓜連作土壤微生物區(qū)系的維持及連作障礙的預(yù)防及緩解提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)于2011年7月至2015年5月在江蘇省揚(yáng)州市農(nóng)作物品種區(qū)域試驗(yàn)站大棚內(nèi)進(jìn)行。試驗(yàn)所用土壤為沙質(zhì)壤土，已經(jīng)連續(xù)4年種植黃瓜，每年種植2茬，共連作7茬。試驗(yàn)共設(shè)4個處理，每個處理3次重復(fù)，每個處理小區(qū)面積為27 m2，小區(qū)間隔 25 cm，并采用南北向條壟方式種植，每季收獲后將壟拉平、施肥后再起壟，并逐茬沿用。在盛果期每個小區(qū)追施1次2.024 kg的復(fù)合肥，具體處理和代號見表1。

1.2試驗(yàn)材料

化肥（復(fù)合肥，即無機(jī)肥）為市售，其中N ∶[KG-*3]P2O5 ∶[KG-*3]K2O 為15 ∶[KG-*3]13 ∶[KG-*3]12；普通有機(jī)肥為發(fā)酵雞糞；微生物有機(jī)肥由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)提供。供試土壤基本理化性質(zhì)：總氮含量1.81 g/kg，總磷含量 0.87 g/kg，速效磷含量43.66 m g/kg，速效鉀含量 155.81 mg/kg，有機(jī)質(zhì)含量26.96 g/kg，總鹽含量5.67 g/kg，電導(dǎo)率為806.50 μS/cm，pH值為7.80。

1.3土壤樣品采集與處理

于每茬黃瓜成熟期對不同處理及各重復(fù)小區(qū)采用5點(diǎn)法采集黃瓜根際土壤樣品，采用4分法混勻后置于4、 -80 ℃ 冰箱中保存。

1.4土樣微生物數(shù)量測定

采用稀釋平板法[13]。分別用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、馬丁氏孟加拉紅培養(yǎng)基、高氏1號培養(yǎng)基對土壤細(xì)菌、霉菌、放線菌數(shù)量進(jìn)行測定。微生物數(shù)量以1 g干土中的菌落數(shù)表示。

1.5土壤總DNA的提取

采用試劑盒（FastDNA SPIN Kit，MP Biomedicals，美國）提取各土壤樣品微生物總DNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，-20 ℃保存。

1.6土樣DNA的PCR擴(kuò)增

分別采用細(xì)菌16S通用引物P2/P3+GC[14]和真菌28S通用引物U1/U2+GC[15]對土壤微生物總DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，引物具體信息如表2所示。細(xì)菌PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。真菌PCR擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)?4 ℃ 3 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，共35個循環(huán)；72 ℃ 10 min。

細(xì)菌、真菌PCR擴(kuò)增體系為Taq DNA聚合酶（大連TaKaRa公司）0.25 U，10×Buffer 5 μL，dNTP（2.5 mmol/反應(yīng)，大連TaKaRa公司）4 μL，引物各1 μL（20 μmol/L），牛血清白蛋白（BSA） 5 μL（10 mg/mL），模板DNA 2 μL，無菌水補(bǔ)足至50 μL。

擴(kuò)增產(chǎn)物均經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)后，于4 ℃冰箱中保存。

1.7PCR-變性梯度凝膠電泳（PCR-DGGE）

采用Bio-Rad公司的DcodeTM基因突變檢測系統(tǒng)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳分離。細(xì)菌及真菌電泳條件均為8%聚丙烯酰胺凝膠，變性梯度為20%～60%，電泳緩沖液為1×TAE，130 V 電壓，60 ℃電泳720 min。電泳結(jié)束后用EB染色 30 min，無菌水褪染10 min，最后用Bio-Rad凝膠成像分析系統(tǒng)觀察結(jié)果并拍照。

1.8數(shù)據(jù)處理

采用Quantity One 4.6（Bio-Rad）軟件對PCR-DGGE圖譜進(jìn)行分析，電泳條帶的數(shù)量代表細(xì)菌和真菌的群落豐富度（S）；通過DGGE圖譜的數(shù)字化結(jié)果分別計(jì)算土壤樣品中細(xì)菌和真菌群落的多樣性指數(shù)（H），Shannon-Weaver多樣性指數(shù)

式中ni為每個峰的面積，N為所有峰的面積和，s為條帶數(shù)。對樣品采用不加權(quán)平均連鎖聚類（UPGMA） 的處理方法進(jìn)行簇群歸類。

2結(jié)果與分析

2.1不同施肥處理對黃瓜連作土壤微生物區(qū)系的影響

土壤細(xì)菌、放線菌、真菌是土壤微生物的主要組成部分，其數(shù)量是衡量土壤中微生物區(qū)系健康狀況的1個重要指標(biāo)。由圖1-a可知，隨著連作茬數(shù)的增加，各施肥處理根際土壤細(xì)菌數(shù)量均呈增加趨勢；微生物有機(jī)肥+化肥處理（FB）根際土壤細(xì)菌數(shù)量除連作第5茬外其他茬均顯著高于其他處理；化肥處理（FT）細(xì)菌數(shù)在黃瓜連作各階段均低于對照，且從連作第3茬開始差異達(dá)顯著水平。上述結(jié)果說明，隨著連作茬數(shù)的增加，各肥料處理根際土壤細(xì)菌數(shù)量均持續(xù)增加，但相對于同茬對照處理，化肥處理對細(xì)菌數(shù)量有明顯的抑制作用，而有機(jī)肥+化肥處理（FC、FB）尤其是微生物有機(jī)肥+化肥處理（FB）對細(xì)菌增加有明顯的促進(jìn)作用。

由圖1-b可知，隨著連作茬數(shù)的增加，各施肥處理根際土壤放線菌數(shù)量均呈增加趨勢；與CK處理相比，F(xiàn)T處理的放線菌數(shù)量除連作第3茬外其他茬均顯著高于CK處理； FB處理的放線菌數(shù)量除連作第3茬外均顯著高于CK處理，且隨連作茬數(shù)的增加，其增幅逐漸明顯高于FT處理；FC處理除連作第1茬外根際土壤放線菌數(shù)量均高于其他處理。上述結(jié)果表明，隨著連作茬數(shù)的增加，各肥料處理根際土壤放線菌數(shù)量均持續(xù)增加，與對照相比，化肥、普通有機(jī)肥+化肥、微生物肥料+化肥處理對放線菌數(shù)量增加均有不同程度的促進(jìn)作用，其中，普通生物有機(jī)肥+化肥的促進(jìn)作用在各茬次均比較明顯。

由圖1-c可知，隨著連作茬數(shù)的增加，各施肥處理根際土壤真菌數(shù)量均呈增加趨勢；相對于CK處理，各連作茬次FT處理除連作第3茬外其他茬土壤真菌數(shù)量均明顯提高，而FC、FB處理真菌數(shù)量在不同茬次表現(xiàn)為高低交替狀態(tài)，其中FC處理根際土壤真菌數(shù)量均除連作第1茬外顯著高于其他處理。上述結(jié)果表明，隨著連作茬數(shù)的增加，各肥料處理根際土壤真菌數(shù)量均持續(xù)增加。

2.2不同施肥處理對黃瓜連作土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響

依據(jù)不同施肥處理連作第 1、7茬土壤細(xì)菌PCR-DGGE指紋圖譜（圖2-a），進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)聚類分析（圖2-b）。結(jié)果顯示，相對于CK，不同施肥處理對同茬土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的影響存在差異，連作前期表現(xiàn)為FB>FC>FT，連作7茬后表現(xiàn)為FB>FT>FC；除FB處理外，連作過程各施肥處理土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)均發(fā)生變化；FB處理對連作前期土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)有較大影響，并且在連作7茬后未發(fā)生明顯變化。

進(jìn)一步對上述處理土壤細(xì)菌遺傳多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。表3表明，與CK相比，有機(jī)、無機(jī)肥處理均能在短期內(nèi)促進(jìn)根際土壤細(xì)菌多樣性及豐富度的提高，并且這種作用在不同肥料處理間存在差異；連作7茬后不同肥料處理土壤細(xì)菌多樣性及豐富度均有不同程度下降甚至低于同期CK處理，F(xiàn)B處理下降程度相對小于FT及FC處理。

上述結(jié)果說明，連作導(dǎo)致土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，各施肥處理對連作不同時期土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同程度的影響；從細(xì)菌多樣性及豐富度上看，連作后對照處理呈增加趨勢，而其他施肥處理均呈相反趨勢，且連作7茬后土壤細(xì)菌多樣性及豐富度呈現(xiàn)FB>FT>FC。

2.3不同施肥處理對黃瓜連作土壤中真菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的影響

依據(jù)不同施肥處理第1、7茬土壤真菌PCR-DGGE指紋圖譜（圖3-a），進(jìn)行群落結(jié)構(gòu)聚類分析（圖3-b）。結(jié)果顯示，相對于CK處理，不同施肥處理對同茬土壤真菌群落結(jié)構(gòu)的影響存在差異，連作前期FT、FB處理對真菌群落結(jié)構(gòu)的影響比FC處理更大，連作7茬后表現(xiàn)為FB>FT>FC；連作導(dǎo)致各施肥處理土壤真菌群落結(jié)構(gòu)均發(fā)生變化；FT、FB處理對連作前期土壤真菌群落結(jié)構(gòu)有較大的影響，但在連作7茬后對真菌群落結(jié)構(gòu)的影響變小（圖3）。

進(jìn)一步對上述處理土壤真菌遺傳多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明，與CK處理相比，F(xiàn)C、FB處理均能在短期內(nèi)促進(jìn)根際土壤真菌多樣性及豐富度的提高，而FT處理降低了根際土壤真菌的多樣性及豐富度；連作7茬后不同肥料處理土壤真菌多樣性及豐富度均有不同程度上升，但是均不高于同茬CK處理，F(xiàn)C處理上升程度相對小于FT及FB處理（表4）。

上述結(jié)果說明，連作導(dǎo)致土壤真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，各施肥處理對連作不同時期土壤真菌群落結(jié)構(gòu)有不同程度的影響?？傮w上，連作促進(jìn)了施肥處理根際土壤真菌多樣性及豐富度的上升，但與對照相比上升幅度較??；在連作7茬后土壤真菌多樣性及豐富度表現(xiàn)為FB>FC>FT。

3結(jié)論與討論

周寶利等認(rèn)為，隨著連作年限的增加，根際土壤中細(xì)菌和放線菌數(shù)量急劇下降，真菌數(shù)量顯著上升[16-17]。馬云華等研究發(fā)現(xiàn)，連作黃瓜土壤細(xì)菌和放線菌數(shù)量在5年前明顯上升，5年后急劇下降，呈倒馬鞍形變化[2]；真菌數(shù)量隨連作年限的增加而增長，趙萌等的研究也有相似結(jié)果[18]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，連作4年的黃瓜根際土壤中細(xì)菌、放線菌、真菌的數(shù)量均呈增加趨勢。這與馬云華等的研究結(jié)果[2，18]一致，而與周寶利等的研究結(jié)果[16-17]并不完全一致，其原因可能是由于種植作物種類不同、土壤基本性狀不同[19]。與對照相比，單施復(fù)合肥使根際土壤真菌、放線菌的數(shù)量呈增加的趨勢，而細(xì)菌的數(shù)量呈下降趨勢；有機(jī)-無機(jī)肥的配施使根際土壤細(xì)菌、放線菌的數(shù)量總體呈增加趨勢，而真菌的數(shù)量多數(shù)呈下降趨勢，與單施化肥相比下降更明顯。這與其他學(xué)者的研究結(jié)果[20]相似，說明相比化肥的單施，有機(jī)-無機(jī)肥的配施可以有效地降低黃瓜連作土壤中真菌與細(xì)菌比率，為作物提供更加良好的生長環(huán)境[21]。

土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的研究結(jié)果表明，不施基肥條件下（CK），連作增加了細(xì)菌及真菌的多樣性，馬寧寧等通過 PCR-DGGE技術(shù)對設(shè)施番茄連作土壤微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的研究也證實(shí)了這一結(jié)果[21]；而吳鳳芝等通過隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（RAPD）技術(shù)研究設(shè)施黃瓜連作對微生物群落多樣性的影響時發(fā)現(xiàn)，隨著連作年限的增加，土壤細(xì)菌和真菌多樣性及豐富度處于下降趨勢[22]。本試驗(yàn)條件下得到的結(jié)果與吳鳳芝等的結(jié)果[22]不一致，可能與以上2種分子生物學(xué)技術(shù)有關(guān)，當(dāng)然土壤質(zhì)地、肥力以及施肥等均會影響結(jié)果，有關(guān)方面還需進(jìn)一步研究。

夏昕等認(rèn)為，與對照相比，在紅壤性水稻土壤中長期施用化肥降低了土壤細(xì)菌多樣性，而長期施用無機(jī)-有機(jī)豬糞肥增加了細(xì)菌的多樣性[23]。夏昕等對長期施肥條件下菜田土壤真菌多樣性研究表明，與對照相比，無機(jī)-有機(jī)馬糞肥的配施增加了真菌的多樣性，而無機(jī)肥單施降低了真菌的多樣性[24]。魏巍等在研究長期施肥對黑土農(nóng)田土壤微生物群落的影響時發(fā)現(xiàn)，長期施用化肥降低了細(xì)菌和真菌的多樣性，化肥配施有機(jī)豬糞肥降低了細(xì)菌多樣性，卻增加了真菌的多樣性[25]。因?yàn)橥寥李愋褪怯绊懠?xì)菌的最主要因素，而土壤管理與施肥是影響真菌的最主要因素，上述試驗(yàn)的供試土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分對比顯示，魏巍等試驗(yàn)用的土壤為典型黑土，有機(jī)質(zhì)含量明顯高于其他2種土壤，所以結(jié)果的差異可能與供試土壤的養(yǎng)分狀況有關(guān)[25-26]。而本試驗(yàn)結(jié)果顯示，連作條件下各施肥處理的土壤細(xì)菌與真菌多樣性均低于CK處理，但無機(jī)肥配施微生物有機(jī)肥條件下土壤細(xì)菌和真菌的多樣性與CK處理并沒有顯著差異。本試驗(yàn)供試土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分狀況與魏巍等的試驗(yàn)土壤最為接近，所以細(xì)菌多樣性與魏巍等的研究結(jié)果趨于相似，而施肥種類的不同可能導(dǎo)致了兩者在真菌變化趨勢上的差異[25]。

通過比較不同施肥處理對黃瓜連作土壤微生物區(qū)系以及細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)的影響可以看出，較其他施肥處理而言，微生物有機(jī)肥的連續(xù)施用能夠使連作土壤中細(xì)菌多樣性更為豐富，群落物種分布更為均勻，群落結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定；而對于真菌，無機(jī)-有機(jī)肥配施的2種處理都能夠較好地穩(wěn)定真菌的群落結(jié)構(gòu)，但是化肥-微生物有機(jī)肥配施較化肥-普通有機(jī)肥配施能更好地提高土壤中真菌的多樣性及豐富度。土壤微生物結(jié)構(gòu)越穩(wěn)定，多樣性越豐富，物種分布越均勻，對病原菌拮抗能力就越強(qiáng)[27]。

綜上所述，微生物有機(jī)肥與化肥（復(fù)合肥）的配施更有利于根際健康土壤細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。PCR-DGGE技術(shù)雖然具有重現(xiàn)性強(qiáng)、可靠性高、速度快等優(yōu)點(diǎn)，但是它只能對微生物群落中數(shù)量大于1%的優(yōu)勢種群進(jìn)行分析[28]，而且不同的DGGE試驗(yàn)條件也可能導(dǎo)致出現(xiàn)不同的指紋圖譜，這對系統(tǒng)發(fā)育分析均有一定的影響。因此，仍需進(jìn)一步應(yīng)用高通量測序技術(shù)，更全面、詳細(xì)地了解不同施肥處理對連作土壤中細(xì)菌、真菌的多樣性及豐富度的影響。

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