李然然　王述彬　潘寶貴

摘要：病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，簡(jiǎn)稱(chēng)VIGS）技術(shù)在候選基因功能驗(yàn)證方面起著非常重要的作用。以辣椒八氫番茄紅素脫氫酶基因（簡(jiǎn)稱(chēng)PDS）為目標(biāo)基因，分析表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌的菌液在LB液體培養(yǎng)基和誘導(dǎo)培養(yǎng)基（IM）中D600 nm值的變化趨勢(shì)。結(jié)果表明，當(dāng)LB液體培養(yǎng)基中菌液D600 nm值為1.15時(shí)，后續(xù)利用IM培養(yǎng)菌液的效率最高，PDS基因沉默效果明顯；優(yōu)化了農(nóng)桿菌接種方法，可為辣椒利用VIGS技術(shù)進(jìn)行候選基因的功能驗(yàn)證提供參考。

關(guān)鍵詞：辣椒；VIGS；農(nóng)桿菌接種；基因沉默

中圖分類(lèi)號(hào)： Q786文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2017）14-0082-03

病毒誘導(dǎo)的基因沉默（virus-induced gene silencing，簡(jiǎn)稱(chēng)VIGS）是通過(guò)攜帶靶基因的病毒侵染植株從而引起寄主植株對(duì)應(yīng)的目標(biāo)基因沉默，使該基因不能繼續(xù)表達(dá)，進(jìn)而探究基因功能的一種方式[1-2]。目前，VIGS技術(shù)已被廣泛應(yīng)用，棉花[3]、煙草[4]、擬南芥[5]、大麥[6]、大豆[7]等植物都已經(jīng)成功構(gòu)建了VIGS體系，茄科作物[8-10]也開(kāi)始普遍利用VIGS技術(shù)研究基因功能。候選基因VIGS載體構(gòu)建成功后，農(nóng)桿菌接種侵染植株是VIGS的關(guān)鍵步驟，農(nóng)桿菌菌液培養(yǎng)占據(jù)了大量的時(shí)間，其中菌液的D600 nm值是試驗(yàn)的關(guān)鍵點(diǎn)。沉默八氫番茄紅素脫氫酶基因（簡(jiǎn)稱(chēng)PDS）可使植株出現(xiàn)明顯的白化癥狀，PDS基因常用作VIGS試驗(yàn)的陽(yáng)性對(duì)照基因[11]。本試驗(yàn)以PDS為目標(biāo)基因構(gòu)建VIGS載體接種辣椒，分析在農(nóng)桿菌振蕩培養(yǎng)過(guò)程中菌液的D600 nm值，從而簡(jiǎn)化搖菌的測(cè)量次數(shù)，為利用VIGS方法進(jìn)行候選基因功能驗(yàn)證提供參考。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

供試?yán)苯凡牧蠟榻K省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所高效園藝作物遺傳改良重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存的G43（Capsicum annuum L.）。VIGS載體pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌液引自西北農(nóng)林科技大學(xué)。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1植物材料培養(yǎng)2015年10月，利用RGL-P1000D人工氣候箱育苗，出苗前30 ℃、黑暗培養(yǎng)，出苗后，晝、夜溫度28、20 ℃，光照375 μmol/（m2·s）（光照—黑暗為12 h—12 h），濕度60%，培養(yǎng)至2張子葉完全展開(kāi)、真葉尚未長(zhǎng)出時(shí)用于接種。

1.2.2試劑配制試劑的配制參照Velásquez等[12]所述，配制體積稍有改動(dòng)。

20×AB鹽配制：NH4Cl 20.00 g、MgSO4·7H2O 6.00 g、KCl 3.00 g、CaCl2 0.20 g、FeSO4·7H2O 0.05 g，用超純水定容至1 L，121 ℃滅菌20 min（若出現(xiàn)沉淀，需要渦旋），備用。

誘導(dǎo)培養(yǎng)基（IM）配制：2-（N-嗎啉）乙磺酸一水合物（MES）5.137 g、葡萄糖2.632 g、NaH2PO4 0.164 g，用超純水定容至500 mL，調(diào)節(jié)pH值為5.6，121 ℃滅菌20 min，待溶液冷卻后加AB鹽26.316 mL。IM當(dāng)天或提前1 d配制，500 mL IM使用前加入500 μL 200 mmol/L乙酰丁香酮、26.316 mL 20×AB鹽、500 μL 50 mg/mL卡那霉素、利福平、慶大霉素。

200 mmol/L乙酰丁香酮配制：19.6 mg乙酰丁香酮溶于500 μL二甲基亞砜（DMSO）。

乙磺酸（MES）溶液配制：MgCl2·6H2O 1.016 5 g，MES 1.066 0 g，用超純水定容至500 mL，調(diào)節(jié)pH值至5.5，121 ℃滅菌 20 min。

1.3接種方法

參照Velásquez等[12-13]的方法。

1.3.1劃板在-80 ℃冰箱中取出pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101菌液，冰上融解，分別在三抗LB瓊脂板（含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平、50 mg/L 慶大霉素）上劃線，用封口膜封好，標(biāo)注好名稱(chēng)及日期，置于28 ℃培養(yǎng)36 h左右。

1.3.2挑取單菌落培養(yǎng)準(zhǔn)備3個(gè)100 mL錐形瓶，分別加入10 mL液體LB培養(yǎng)基（含50 mg/L卡那霉素、50 mg/L利福平、50 mg/L慶大霉素），再分別挑取pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS單菌落至錐形瓶中，用封口膜封好，28 ℃、200 r/min 培養(yǎng)。

1.3.3IM搖菌按1 ∶[KG-*3]25的比例混合菌液和IM。pTRV1配制2瓶，pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS各配1瓶，28 ℃、200 r/min 培養(yǎng)27 ～37 h至菌液D600 nm值達(dá)到0.5 ～0.8。

1.3.4收集菌體將菌液分別移入50 mL離心管中，4 ℃、3 000 g 離心10 min，移除液體，加入等體積MES重懸，4 ℃、3 000 g 再次離心10 min，收集菌體，用1/2體積的MES重懸。向pTRV1內(nèi)加入200 mmol/L乙酰丁香酮，使乙酰丁香酮終濃度為400 mmol/L，按1 ∶[KG-*3]1將pTRV1分別與pTRV2 ∶[KG-*3]

00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS混合，使乙酰丁香酮終濃度為200 mmol/L，D600 nm值約為0.6，置于22～25 ℃靜置3～5 h，用于注射接種。

1.3.5接種幼苗接種前1 d澆水。接種時(shí)，在子葉中下部靠近葉脈處用2 mL一次性注射器打孔，用無(wú)針頭的一次性注射器在子葉背面注射菌液，直至整張子葉充滿水漬。注意在注射不同菌液時(shí)要更換手套與注射器，避免交叉污染。

1.3.6接種后培養(yǎng)接種后，將幼苗置于人工氣候箱中，先18 ℃、黑暗條件培養(yǎng)2 d，再將培養(yǎng)條件調(diào)至?xí)?、夜溫?2、18 ℃，光照375 μmol/（m2·s）（16 h—8 h），濕度60%條件下培養(yǎng)。接種后3 d控水以增加發(fā)病率。

1.4數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)設(shè)5次重復(fù)，采用Eppendorf BioPhotometer plus測(cè)量菌液D600 nm值，利用Excel 2007工作薄進(jìn)行數(shù)據(jù)整理分析。

2結(jié)果與分析

2.1不同LB菌液對(duì)IM菌液培養(yǎng)時(shí)間的影響

對(duì)pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS用LB培養(yǎng)基搖菌后D600 nm為1.00、1.05、1.10、1.15、1.20的菌液進(jìn)行IM搖菌，用時(shí)20～23 h。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D600 nm值在1.15時(shí)進(jìn)行IM搖菌是效率最高的（表1）。當(dāng)D600 nm值為1.00時(shí)，用IM搖菌達(dá)不到D600 nm值為0.5；隨著LB培養(yǎng)基D600 nm值的增加，用IM搖菌的效率也逐漸增加，到D600 nm值為1.15時(shí)效率達(dá)到最高；當(dāng)D600 nm值為1.20時(shí)，用IM搖菌的D600 nm值達(dá)到0.5的時(shí)間開(kāi)始增加。

2.2不同菌體LB搖菌隨著時(shí)間D600 nm值的變化

分別對(duì)pTRV1、pTRV2 ∶[KG-*3]00、pTRV2 ∶[KG-*3]PDS用LB培養(yǎng)基搖菌，并分別在17、18、19、20 h測(cè)量菌液D600 nm值，做3次重復(fù)，取平均值，所得結(jié)果如圖1所示，三者柱狀圖相似，說(shuō)明不同菌體之間搖菌時(shí)間與對(duì)應(yīng)D600 nm值變化相似。因此，若想探究菌體搖菌時(shí)間與對(duì)應(yīng)D600 nm值變化的關(guān)系，僅用1種菌體進(jìn)行試驗(yàn)即可。

2.3LB液體培養(yǎng)基培養(yǎng)菌液

用pTRV1探究菌體搖菌時(shí)間與對(duì)應(yīng)D600 nm值變化的關(guān)系，挑取5個(gè)單菌落（A、B、C、D、E），分別用10 mL液體LB培養(yǎng)基在100 mL錐形瓶中28 ℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)，所用時(shí)間及對(duì)應(yīng)D600 nm值見(jiàn)表2。在搖菌19.0 h時(shí)菌液C、D、E的D600 nm值已達(dá)到0.90以上，增加測(cè)量密度，19.50 h后其D600 nm值達(dá)到1.00以上，進(jìn)一步增加測(cè)量密度，結(jié)果菌液C、D在19.73 h、菌液E在19.70 h分別達(dá)到所需D600 nm值，而菌液A、B在搖菌19.00 h時(shí)D600 nm值在0.80左右，可不必增加測(cè)量密度。

根據(jù)測(cè)量結(jié)果，菌液在搖菌19.70～20.00 h后達(dá)到所需D600 nm值，若想減少測(cè)D600 nm的次數(shù)，可以在搖菌19.00 h時(shí)測(cè)D600 nm值，并根據(jù)所測(cè)值與表2中數(shù)據(jù)對(duì)比，估算再搖菌時(shí)間。如D600 nm值達(dá)到0.90，預(yù)計(jì)再搖45 min可達(dá)到所需值；D600 nm值達(dá)到1.00，預(yù)計(jì)再搖15 min即可達(dá)所需值。

2.4IM菌液培養(yǎng)時(shí)間與其濃度的關(guān)系

LB培養(yǎng)基搖菌D600 nm值達(dá)到1.15左右后，再按菌液 ∶[KG-*3]IM=1 ∶[KG-*3]25 的比例進(jìn)行混合，做5次重復(fù)，分別為菌液1、2、3、4、5，繼續(xù)搖菌。由表3可以看出，在相同起始D600 nm值下，再進(jìn)行IM搖菌，所需搖菌時(shí)間也有些差異。一般來(lái)說(shuō)，當(dāng)LB培養(yǎng)基D600 nm值達(dá)到1.15，再進(jìn)行IM搖菌，可在搖菌后27 h測(cè)量，再根據(jù)所測(cè)數(shù)據(jù)估計(jì)搖菌時(shí)間。由于IM搖菌所需時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于LB培養(yǎng)基，而且所需D600 nm值范圍并不是那么嚴(yán)格，在0.5～0.8 均可，初次測(cè)量D600 nm值時(shí)間可以稍微晚一點(diǎn)。

由于菌液在不同D600 nm值下的增長(zhǎng)速度不同，計(jì)算不同菌液在不同時(shí)間段的平均值可能與菌液的真正D600 nm值變化有所差異，因此，菌液原始的D600 nm值變化更能說(shuō)明問(wèn)題，也更方便做類(lèi)似試驗(yàn)的研究人員查閱。

2.5MES重懸對(duì)菌液濃度的影響

2.6pTRV2 ∶[KG-*3]PDS基因沉默效果

從圖2可見(jiàn)，接種pTRV2 ∶[KG-*3]PDS 3周后，辣椒幼苗葉片出現(xiàn)白化癥狀，其中第1、2張葉片的基部及主脈處明顯白化，第3張新生葉片全部白化；接種4周后，幼苗第1、2張葉片的白化范圍擴(kuò)大，第3、4張新生葉片全部白化。接種空載體（pTRV2 ∶[KG-*3]00）幼苗比接種pTRV2 ∶[KG-*3]PDS幼苗的長(zhǎng)勢(shì)稍好，而未接種植株（WT）明顯比接種植株長(zhǎng)勢(shì)旺盛。本試驗(yàn)方法能達(dá)到PDS基因沉默的目標(biāo)，可用于后續(xù)的基因功能驗(yàn)證。

3結(jié)論與討論

隨著VIGS技術(shù)的逐漸成熟，不同研究人員采用的農(nóng)桿菌接種方法有所差異，有的用LB培養(yǎng)基搖過(guò)之后就直接用MES重懸[9]，此方法雖然也可以使基因沉默，但是用IM再次搖菌可以提高菌體活性，提高沉默效率。

在進(jìn)行農(nóng)桿菌接種試驗(yàn)時(shí)，LB培養(yǎng)基搖菌的D600 nm值將影響后期IM搖菌的D600 nm值，本研究得出了最佳的LB培養(yǎng)基搖菌D600 nm值為1.15，而且通過(guò)所列舉IM搖菌數(shù)據(jù)可以推算所需搖菌時(shí)間，從而合理安排開(kāi)始搖菌時(shí)間，因?yàn)镮M搖菌時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)對(duì)菌體活性產(chǎn)生影響，盡量避開(kāi)搖菌結(jié)束時(shí)間在晚上，以增加菌體活性，保證最高沉默效率。

Zhang等的試驗(yàn)中僅說(shuō)明了在LB液體培養(yǎng)液振蕩培養(yǎng)時(shí)需要24～36 h，IM振蕩培養(yǎng)時(shí)需20～24 h，本試驗(yàn)探究LB培養(yǎng)基和IM搖菌時(shí)間與D600 nm值的關(guān)系，得出LB培養(yǎng)基搖菌要在搖菌17 h時(shí)測(cè)量D600 nm值，IM搖菌要在搖菌后27 h進(jìn)行測(cè)量的結(jié)論[13]。所得時(shí)間節(jié)點(diǎn)與Zhang等稍微有所差別，但根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果，在Zhang等的試驗(yàn)條件下LB液體培養(yǎng)基濃度可能比較高，難以掌控菌體最佳活性時(shí)期。本試驗(yàn)在Zhang等的基礎(chǔ)上更加精確了搖菌時(shí)間，方便研究人員參考查閱。

采用本研究方法接種，辣椒葉片白化癥狀明顯，說(shuō)明本試驗(yàn)方案可行，為應(yīng)用VIGS技術(shù)研究辣椒相關(guān)基因功能奠定了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

[1]張?jiān)銎G，姚烏蘭，辛志勇. 植物基因功能鑒定新工具——病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)的研究進(jìn)展[J]. 植物遺傳資源學(xué)報(bào)，2006，7（1）：100 -105.

[2]Burch-Smith T M，Anderson J C，Martin G B，et al. Applications and advantages of virus-induced gene silencing for gene function studies in plants [J]. Plant Journal，2004，39（5）：734-746.

[3]Tuttle J R，Idris A，Brown J K，et al. Geminivirus-mediated gene silencing from cotton leaf crumple virus is enhanced by low temperature in cotton [J]. Plant Physiology，2008，148（1）：41-50.

[4]Ratcliff F，Martin-Hernandez A M，Baulcombe D C . Technical advance：tobacco rattle virus as a vector for analysis of gene function by silencing [J]. The Plant Journal，2001，25（2）：237-245.

[5]Turnage M A，Muangsan N，Peele C G，et al. Geminivirus-based vectors for gene silencing in Arabidopsis [J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology，2002，30（1）：107-114.

[6]Holzberg S，Brosio P，Gross C，et al. Barley stripe mosaic virus-induced gene silencing in a monocot plant [J]. Plant Journal，2002，30（3）：315-327.

[7]Igarashi A，Yamagata K，Sugai T，et al. Apple latent spherical virus vectors for reliable and effective virus -induced gene silencing among a broad range of plants including tobacco，tomato，Arabidopsis thaliana，cucurbits，and legumes [J]. Virology，2009，386（2）：407-416.

[8]張慶琛，魏理，丁錦平，等. 辣椒病毒誘導(dǎo)基因沉默體系的構(gòu)建[J]. 河南師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2012，40（5）：133-136.

[9]馬紅珍，裴冬麗，耿慧霞，等. 病毒誘導(dǎo)番茄的基因沉默[J]. 西北植物學(xué)報(bào)，2009，29（8）：1531-1537.

[10]Liu Y，Schiff M，Dinesh -Kumar S P . Virus-induced gene silencing in tomato [J]. Plant Journal，2002，31（6）：777-786.

[11]張花美，朱勝男，張麗莎，等. 病毒誘導(dǎo)的基因沉默[J]. 杭州師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2001，10（3）：158-162.

[12]Velásquez A C，Chakravarthy S，Martin A G B . Virus-induced gene silencing （VIGS） in Nicotiana benthamiana and tomato [J]. Journal of Visualized Experiments，2009，28（28）：1292.

[13]Zhang Z，Li D W，Jin J H，et al. VIGS approach reveals the modulation of anthocyanin biosynthetic genes by CaMYB in chili pepper leaves [J]. Frontiers in Plant Science，2015，6：500.