何建清　張格杰　尹明遠(yuǎn)

摘要：放線菌10-4菌株對番茄早疫病具有良好的拮抗效果，為進(jìn)一步提高放線菌10-4菌株發(fā)酵液生產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的產(chǎn)量，通過單因素和正交試驗(yàn)研究發(fā)酵培養(yǎng)液、培養(yǎng)溫度、種齡、初始pH值、接種量等條件對10-4菌株抑制番茄早疫病病原菌效果的影響。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵培養(yǎng)液配比為2.000 g可溶性淀粉、0.001 g FeSO4、0.050 g NaCl、0.050 g K2HPO4、0.050 g MgSO4、0.100 g KNO3、100 mL蒸餾水。10-4菌株發(fā)酵的優(yōu)化條件：溫度為28～34 ℃，種齡為 32 h，初始pH值為8，接種量為5%。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵條件的最優(yōu)組合為A1B1C1，即發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵時間為 72 h，裝液量為60 mL（裝液瓶為250 mL），此時10-4菌株生產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的效果最好，生防放線菌10-4菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液可有效抑制番茄早疫病病原菌，抑制率高達(dá)96.2%。

關(guān)鍵詞：番茄早疫??；拮抗效果；放線菌10-4；發(fā)酵條件；優(yōu)化；抑菌活性；產(chǎn)量

中圖分類號： S436.412.1+4文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2017）14-0079-03

早疫病是番茄生產(chǎn)上重要的病害之一，由茄鏈格孢屬真菌（Alternaria solani）引起，該菌寄主范圍廣泛，除番茄外，還可感染辣椒、茄子、曼陀羅和馬鈴薯等[1]。該病常年造成番茄減產(chǎn)20%～30%，嚴(yán)重時可達(dá) 50%以上，甚至絕產(chǎn)[2]。目前生產(chǎn)上并無高抗或免疫的品種，因此運(yùn)用抗病種質(zhì)防治該病并不現(xiàn)實(shí)[3]，而化學(xué)農(nóng)藥的長期過量使用，又會導(dǎo)致病原菌抗性增強(qiáng)，對環(huán)境污染加重，以及番茄果實(shí)有農(nóng)藥殘留等現(xiàn)象，因而，探尋新的防治番茄早疫病的方法和藥劑是目前生產(chǎn)上亟待解決的問題。利用微生物來防治植物真菌病害是當(dāng)今植物真菌病害界十分熱門的研究領(lǐng)域之一。微生物防治是指通過生物間的相互作用，利用有益微生物或其代謝產(chǎn)物抑制致病微生物生長的生物防治手段[4]。微生物資源豐富、選擇性強(qiáng)、無殘留、無污染、成本低、兼防兼治、增產(chǎn)增收、保持生態(tài)平衡、起到長效的作用，所以具有廣闊的發(fā)展前景[5]。放線菌是最早被研究且應(yīng)用到生產(chǎn)中的能產(chǎn)生大量抗生素的一種生防微生物，已有利用放線菌防治番茄早疫病害的報道[6]。菌株10-4是筆者所在課題組從西藏色季拉山亞高山草甸土壤中分離篩選出的1株對番茄早疫病菌有較強(qiáng)抑制作用的菌株，初步鑒定為腐生鏈霉菌[7]。為提高其產(chǎn)素水平，為工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)提供依據(jù)，本研究采用生長速率法對不同培養(yǎng)基和發(fā)酵條件下10-4 菌株發(fā)酵液的抑菌活性進(jìn)行測定，旨在篩選適宜的培養(yǎng)基和優(yōu)化其適宜的發(fā)酵條件，以期為農(nóng)用活性物質(zhì)的開發(fā)和分離提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)菌菌株10-4，分離自西藏色季拉山亞高山草甸土壤中。

1.1.2指示菌番茄早疫病菌，由西藏大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院真菌實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3培養(yǎng)基配方種子培養(yǎng)液：3 g蛋白胨，2.5 g葡萄糖，2 g CaCO3，1 000 mL 1%大豆餅粉浸汁，pH值為7.2。發(fā)酵培養(yǎng)液：選用12種發(fā)酵培養(yǎng)基（表1）[8-9]，各培養(yǎng)基 pH 值均為7.2，所有培養(yǎng)基均在 121 ℃、0.1 MPa 條件下滅菌 30 min 后備用。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1初始發(fā)酵培養(yǎng)液基篩選將菌株10-4活化，用打孔器打成直徑為5 mm的菌塊，在250 mL三角瓶中接入50 mL種子培養(yǎng)液，再將菌塊放入三角瓶中，于 28 ℃、160 r/min 培養(yǎng) 4 d，獲得種子液。在250 mL 三角瓶中分別裝入50 mL 12種發(fā)酵培養(yǎng)基，按1% 的體積分?jǐn)?shù)接入種子液，28 ℃、160 r/min 振蕩培養(yǎng)4 d后，培養(yǎng)濾液10 000 r/min 離心 25 min，上清液用直徑為 0.45 μm 的無菌過濾膜過濾，將濾液與 PDA 培養(yǎng)基按體積比1 ∶[KG-*3]9制成平板，接入直徑為 5 mm 預(yù)先活化的指示菌塊，以不加發(fā)酵液的PDA 為對照培養(yǎng)基，設(shè)3次重復(fù)。28 ℃下培養(yǎng)4 d，測量菌落直徑，計算抑菌率，評價代謝物的活性。根據(jù)菌絲生長抑制率確定最佳發(fā)酵培養(yǎng)液。菌絲生長抑制率= （對照菌落直徑-處理菌落直徑） /對照菌落直徑×100%。

1.2.2培養(yǎng)溫度對發(fā)酵液抑菌活性的影響在250 mL三角瓶中先接入50 mL“1.2.1”節(jié)中篩選出的發(fā)酵培養(yǎng)液，再接入1 %種子液，設(shè)24、26、28、30、32、34 ℃等6個溫度水平，160 r/min 振蕩培養(yǎng)4 d。按“1.2.1”節(jié)中的方法確定最佳的培養(yǎng)溫度。

1.2.3種子液種齡對發(fā)酵液抑菌活性的影響將“1.2.1”節(jié)中篩選出的培養(yǎng)基以1%的量分別接入種齡為24、28、32、36、40、44、48、52、56、60 h的種子液，28 ℃、160 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，按“1.2.1”節(jié)中的方法確定最佳的接種菌齡。

1.2.4初始pH值對發(fā)酵液抑菌活性的影響將“1.2.1”節(jié)中篩選出的培養(yǎng)基用HCl、NaOH分別調(diào)節(jié)pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，高壓滅菌，接入1 %種子液，在28 ℃、160 r/min 條件下培養(yǎng)3 d，用生長速率法測定發(fā)酵液的抑菌作用。

1.2.5接種量對發(fā)酵液抑菌活性的影響將50 mL發(fā)酵液裝于250 mL的三角瓶中，將培養(yǎng)36 h的種子液以1%、3%、5%、7%、10%、15%、20%的量（體積分?jǐn)?shù)）分別接入發(fā)酵瓶中，培養(yǎng)3 d并進(jìn)行效價的生物測定。

1.2.6發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)在以上試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵溫度、裝液量、發(fā)酵時間為主要發(fā)酵條件，設(shè)計3因素3水平的正交試驗(yàn)，結(jié)果如表2所示。按不同的發(fā)酵條件發(fā)酵培養(yǎng)后，測定發(fā)酵液抑菌率的大小。

2結(jié)果與分析

2.1發(fā)酵培養(yǎng)基的篩選

由圖1可知，10-4菌株在1號培養(yǎng)基中發(fā)酵的濾液不能抑制番茄早疫病病原菌的生長；在其余11種發(fā)酵培養(yǎng)基中發(fā)酵，菌株10-4均能產(chǎn)生抑制番茄早疫病病原菌的抗生素，其中9號培養(yǎng)基的抑菌率較高，達(dá)90.2%，因此，選擇9號培養(yǎng)基進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

2.2培養(yǎng)溫度對10-4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

在發(fā)酵過程中，菌體生長和產(chǎn)物的形成是在眾多酶的催化下進(jìn)行的，適宜的溫度是保證酶活性的基本條件，也是使產(chǎn)物高產(chǎn)的保證。由圖2可知，溫度對10-4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響較大，28～34 ℃有利于10-4菌株產(chǎn)生抑菌物質(zhì)。

2.3種子液種齡對10-4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

將種子液按不同種齡以1%的量接入搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，于28 ℃、160 r/min下振蕩培養(yǎng)3 d，測定其抑菌率。由圖3可知，種子液種齡的最佳時間為32 h，此時菌體處于生命力旺盛的對數(shù)生長期。種齡太短，菌體量太少，會使發(fā)酵周期延長；種齡太長，菌體衰老，產(chǎn)素率降低，菌體較早自溶，影響抗生素的提取。

2.4初始pH值對10-4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

將9號培養(yǎng)基分別調(diào)節(jié)pH值為3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，高壓滅菌，按1%的量接10-4菌株的種子液于發(fā)酵瓶，在 28 ℃、160 r/min條件下培養(yǎng)3 d，用生長速率法測定抑菌作用。由圖4可知，發(fā)酵液的初始pH值對10-4菌株發(fā)酵液的抑菌活性影響較大，pH值為8時，抑菌活性達(dá)到最高點(diǎn)，pH值低于6或高于9都不利于10-4菌株生產(chǎn)抗生素。說明弱堿性有利于產(chǎn)物活性的提高。

2.5接種量對10-4菌株發(fā)酵液抑菌活性的影響

由圖5可知，最適的種子液接種量為5%，此時10-4菌株發(fā)酵液的抑菌活性最高。

2.6發(fā)酵條件的正交試驗(yàn)

在以上試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，選取發(fā)酵溫度、裝液量、發(fā)酵時間為主要發(fā)酵條件，設(shè)計3因素3水平的正交試驗(yàn)，按不同的發(fā)酵條件發(fā)酵培養(yǎng)后測定抑菌率。 由表3可知，發(fā)酵條件的最優(yōu)組合為A1B1C1，即發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵時間為 72 h，裝液量為60 mL，此時10-4菌株生產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的效率最高，生防放線菌10-4菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液可有效抑制番茄早疫病病原菌，抑制率高達(dá)96.2%。對正交試驗(yàn)的結(jié)果進(jìn)行極差分析可知，各因素對10-4菌株生產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響表現(xiàn)為發(fā)酵溫度>裝液量>發(fā)酵時間。

3結(jié)論

從不同培養(yǎng)基對10-4菌株發(fā)酵液的生物活性來看，10-4菌株的最佳初始發(fā)酵培養(yǎng)基為9號培養(yǎng)基，即2.000 g可溶性淀粉、0.001 g FeSO4 、0.050 g NaCl、0.050 g K2HPO4、0050 g MgSO4、0.100 g KNO3、蒸餾水100 mL。10-4菌株發(fā)酵液發(fā)酵過程的優(yōu)化條件：溫度為28～34 ℃，種齡為32 h，初始pH值為8，接種量為5%。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，發(fā)酵條件的最優(yōu)組合為A1B1C1，即發(fā)酵溫度為28 ℃，發(fā)酵時間為 72 h，裝液量為60 mL，此時10-4菌株生產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的效率最高，生防放線菌10-4菌株的發(fā)酵培養(yǎng)液可有效抑制番茄早疫病病原菌，抑制率高達(dá)96.2%。由正交試驗(yàn)極差分析結(jié)果可知，各因素對 10-4菌株生產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的影響表現(xiàn)為發(fā)酵溫度>裝液量>發(fā)酵時間。

發(fā)酵是抗生素產(chǎn)業(yè)化的基礎(chǔ)，這是因?yàn)楸M管生防菌產(chǎn)抗生素的性能優(yōu)良，但若缺乏合理的發(fā)酵工藝，也不能將其潛力充分發(fā)揮?？股匕l(fā)酵除受營養(yǎng)因素的限制以外，合適的發(fā)酵條件也是不可忽視的重要因素。目前，就抗生素制備的農(nóng)藥數(shù)量、質(zhì)量和品種而言，還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)發(fā)展的需求。因此，如何提高抗生素發(fā)酵的產(chǎn)量已成為近年來相關(guān)學(xué)者研究的熱點(diǎn)[10]。為了提高放線菌10-4菌株的抑菌活性，本試驗(yàn)通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)方法，對其搖床發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進(jìn)行研究。結(jié)果表明，放線菌10-4菌株在初始pH值為8的9號培養(yǎng)液中，28 ℃下持續(xù)振蕩培養(yǎng)32 h，其抑菌物質(zhì)的活性最高。

此外，由于10-4菌株發(fā)酵液中活性物質(zhì)的成分是未知的，本試驗(yàn)采用生物活性測定作為指示方法，但生物活性測定誤差較大，所以后續(xù)的研究中應(yīng)在明確活性物質(zhì)的種類后，以活性物質(zhì)的量為指標(biāo)，篩選出更佳的培養(yǎng)液配方和發(fā)酵工藝條件，以便進(jìn)一步開發(fā)利用10-4菌株。

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