孫凱，黎順庚，王光光，范文桐，王玲，卞建春*

（1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州 225009；

2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009；3.江蘇溧陽市天目湖龍鑫特色農(nóng)機專業(yè)合作社，江蘇溧陽 213334）

白葉茶鮮葉制益生茶的急性、慢性毒性試驗研究

孫凱1，2，黎順庚3，王光光1，2，范文桐1，2，王玲1，2，卞建春1，2*

（1.揚州大學獸醫(yī)學院，江蘇揚州 225009；

2.江蘇省動物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚州 225009；3.江蘇溧陽市天目湖龍鑫特色農(nóng)機專業(yè)合作社，江蘇溧陽 213334）

為了探明白葉茶鮮葉制益生茶作為保健茶的毒理學安全性，以不同濃度的益生茶為原料，對SD大鼠同時進行急性和慢性毒性試驗。急性毒性試驗，清潔級SD大鼠隨機分為對照組和試驗組，試驗組每天以5 mL/kg·BW濃度5%益生茶液灌胃，對照組灌服等量生理鹽水，試驗期為14 d，觀察相關(guān)生理體征變化。慢性毒性試驗，清潔級SD大鼠隨機分為對照組和益生茶高、中、低劑量組共四組，益生茶對應(yīng)各組自由飲用濃度分別為3%、2%和1%的茶液，對照組自由飲用蒸餾水，試驗期6周，試驗結(jié)束后，檢測各組大鼠血液學和血液生化學指標及臟器系數(shù)變化。經(jīng)口急性毒性試驗中，益生茶對SD大鼠的食物利用率和生理體征無顯著影響（P〉0.05）。慢性毒性試驗中，益生茶各劑量組SD大鼠的體重、血液學、血液生化學指標值及各臟器的臟/體比值與對照組比較均無顯著性差異（P〉0.05）。益生茶各組大鼠主要臟器在外觀形態(tài)和組織學上均無異常變化。在本試驗條件下，未發(fā)現(xiàn)明顯毒性反應(yīng)和病理變化，表明白葉茶鮮葉制益生茶對雄性大鼠基本無毒。

白葉茶鮮葉；益生茶；SD大鼠；急性毒性；慢性毒性

Abstract：In order to explore the toxicological safety of probiotic tea made from fresh albino tea leaves as raw materials for health care tea，the acute and chronic toxicity tests were carried out on SD rats with different concentrations of probiotic tea.In the acute toxicity test，clean SD rats were randomly divided into the control group and the experimental group.The test group was fed with 5% （wt%）probiotics 5 mL/kg·BW per day，and the control group was fed with the same amount of normal saline.After 14 days trial period，the changes related to physiological signs were observed.In the chronic toxicity test，the SD rats were randomly divided into the control group and other three groups with high， middle and low doses of probiotics tea.The concentration of probiotics tea drink in the high，medium and low dose groups was 3%，2%and 1%，respectively.The control group was free to drink distilled water.

Keywords：Fresh albino tea leaves； Probiotic tea； SD rat； Acute toxicity； Chronic toxicityAfter 6 weeks trial period， the hematology， blood biochemical indicators and changes in the organ coefficient were detected.Results： In the oral acute toxicity test， probiotic tea had no effect on the food utilization and physical signs of SD rats（P〉 0.05）.In the chronic toxicity test， the body weight， hematology， blood biochemical indexes and the ratio of viscera to body of SD rats in each dose group were not significantly different from those in the control group （P〉 0.05）.There were no abnormal changes in the appearance and histology of the rat's main organs in each group.Under the experimental conditions，no obvious toxic reaction and pathological changes were observed.And the results showed that probiotic tea made from fresh albino tea leaves was almost nontoxic to male rats.

采用白葉1號茶鮮葉為原料而制備的龍鑫益生茶（以下簡稱益生茶），是在傳統(tǒng)茶生產(chǎn)工藝基礎(chǔ)上，通過現(xiàn)代分子標靶、益生菌分離、高通量分子篩選等高科技技術(shù)，將益生菌與優(yōu)良白葉茶鮮葉有機嫁接，經(jīng)特殊工藝深度發(fā)酵，精制而成。黑茶在減肥降脂[1-3]、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝[4]、抗氧化[5]等方面具有卓越功效。黑茶種類眾多、歷史悠久，隨著市場對黑茶的需求不斷升溫，黑茶的飲用安全性問題也有必要引起足夠的重視。據(jù)報道，各種黑茶的常規(guī)成分咖啡堿、茶多酚等都有明確的生物學毒性[6-8]。劉勤晉等[9]對普洱茶急性毒性進行了安全性評價，認為茶葉中過高濃度的咖啡堿和茶多酚可導(dǎo)致小鼠死亡，科學的飲茶法是飲茶健身的必然要求。目前，還沒有關(guān)于白葉茶鮮葉制益生茶的毒性研究的報道，為了證明白葉茶鮮葉制益生茶飲用的安全性，本試驗以龍鑫益生茶為材料，進行了白葉茶鮮葉制益生茶的急性、慢性毒性試驗研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 試驗材料

清潔級 SD大鼠：雄性，體重80～100 g，由江蘇大學實驗動物中心（許可證號SCXK（蘇）2013-0011）提供。飼養(yǎng)環(huán)境為室溫22±2℃，相對濕度60±10%，自然光照，自由飲水和采食。

白葉茶鮮葉制益生茶：市售一級龍鑫益生茶。

電子天平（Sartorius，Germany）、全自動生化分析儀（AU480，Beckman Coulter USA）、血常規(guī)分析儀（DC-2800-VET，邁瑞）。

1.2 試驗方法

1.2.1 茶湯配制

參考相關(guān)文獻[10]，按5 g∶100 mL比例用蒸餾水配制相關(guān)茶湯 （相當于體重60 kg的成人每天飲用5 g的益生茶），85℃以上水溫浸泡30 min后紗布過濾，即得灌胃劑量，作為急性經(jīng)口毒性試驗最高劑量。同時稱取10 g、20 g和30 g益生茶分別加入蒸餾水1000 mL，85℃以上水溫浸泡30 min后紗布過濾得1%、2%與3%茶水，作為慢性毒性試驗實驗組劑量。

1.2.2 急性經(jīng)口毒性試驗

清潔級SD大鼠12只，適應(yīng)飼喂2周后隨機分成2組，每組6只。試驗組大鼠均按5 mL/kg·BW 每日1次經(jīng)口灌胃5 g∶100 mL[9]的益生茶湯，對照組灌服等量生理鹽水。灌胃前12 h禁食，不禁水。試驗期14 d，每天觀察動物的進食、活動、毛發(fā)、糞便等行為學活動情況，記錄每日攝食量。每周稱重1次，并依據(jù)5 mL/kg·BW的5%益生茶湯灌胃劑量調(diào)整體重變化大鼠的灌胃量。記錄動物毒性反應(yīng)情況和死亡動物分布。動物死亡后及時進行尸檢，若肉眼觀察異常時則進行病理檢查。

1.2.3 慢性毒性試驗

SD大鼠24只，適應(yīng)飼喂2周后，稱起始體重為250.4±6.5 g，參照農(nóng)藥登記毒理學試驗方法（GB 15670-1995）[11]將大鼠隨機分成 4組，每組6只，設(shè)置蒸餾水空白對照組、1%茶水組、2%茶水組、3%茶水組（組別編號依次為1～4），各劑量組茶水試制方法同急性試驗組，采用自由飲用法給予受試物。試驗期為6周，每周稱重1次。實驗期末禁食12 h，摘眼球取血進行血液學和血液生化檢查。檢測的血液學指標包括白細胞數(shù)目（WBC）、淋巴細胞數(shù)目（Lymph）、紅細胞總數(shù)（RBC）、血紅蛋白（HGB）、平均紅細胞（MCV）、平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC）、單核細胞數(shù)目（Mon）；檢測的血液生化指標包括血清天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、谷氨酰氨轉(zhuǎn)移酶（GGT）、尿素氮（BUN）、總蛋白（TP）、總膽紅素（T-BIL）、肌酸激酶（CK）等。 將大鼠用斷頭法處死，解剖大鼠后肉眼檢查各器官情況，取心、肝、脾、肺、腎稱重，并計算各臟器系數(shù)。

周二的班級群，既是班級工作的“吐槽大會”，又是表揚大會，在各方的批評和表揚中，形成班級的治班錦囊。有一次，幾位家長反映英語課堂紀律差。事后我了解到，原來那段時間學校的助教沒安排過來，英語老師又是外教，加上學生多、自控力差，班級紀律便較差。在群里說明問題后，峻熙媽媽主動提出來學校擔任助教工作，因為她英語過了八級，還當過老師，應(yīng)該能勝任。于是，我向?qū)W校申請，那段時間就由我們班家長暫擔助教工作。后來，英語課堂紀律果真有了極大改善，家長們紛紛點贊，希望自己也能進課堂。在吐槽和表揚中，我們共同為孩子的成長護航。

1.2.4 統(tǒng)計學分析

試驗數(shù)據(jù)以平均值±標準偏差的形式給出，采用SPSS 22.0軟件進行單因素方差分析（One Way ANOVA），選擇多個實驗組和一個對照組間均數(shù)的兩兩比較方法統(tǒng)計；若方差不齊，則選用非參數(shù)分析。P〈0.05表明差異有顯著統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 急性經(jīng)口毒性試驗

2.1.1 一般臨床觀察結(jié)果

經(jīng)過14 d的觀察，全部動物活動良好，無任何中毒癥狀，無死亡，說明雄性大鼠經(jīng)口灌服益生茶的 LD50〉5 g ∶100 mL。

2.1.2 對大鼠攝食量的影響

試驗期間，試驗組大鼠采食量正常，與對照組相比無顯著性差異（P〉0.05），如表1所示。結(jié)果表明益生茶對雄性大鼠攝食量無明顯影響。

表1 益生茶對大鼠攝食量影響Table 1 Effects of Probiotic tea on food intake in rats

2.1.3 對大鼠體重的影響

試驗期間，試驗組大鼠體重的正常，與對照組比較無顯著性差異（P〉0.05），如表2所示。結(jié)果表明益生茶對雄性大鼠體重增長無明顯影響。

表2 益生茶對大鼠體重的影響Table 2 Effects of Probiotic tea on body weight in rats

2.1.4 解剖觀察主要臟器

試驗結(jié)束斷頭法處死大鼠后解剖，肉眼觀察試驗組和對照組大鼠均未發(fā)現(xiàn)臟器出現(xiàn)體積、顏色、質(zhì)地等異常改變。試驗未對大鼠血液生化、臟器、病理學組織開展進一步研究。

2.2 慢性毒性試驗

2.2.1 一般指標

益生茶各劑量組及空白組大鼠在6周試驗期內(nèi)活動、飲食、大便和皮毛光澤等情況未見異常癥狀。處死動物，剖取各組大鼠的心、肝、脾、肺、腎等臟器，首先做肉眼觀察，發(fā)現(xiàn)臟器外形、體積、色澤均屬正常，無充血、腫脹和壞死等異常表現(xiàn)。

2.2.2 對大鼠體重的影響

益生茶對大鼠體重的影響見表3。與對照組比較，試驗組大鼠體重增長正常，體重變化無明顯差異（P〉0.05），表明大鼠長期飲用益生茶對雄性大鼠食物利用率無影響。

2.2.3 對大鼠臟器系數(shù)的影響

益生茶對大鼠臟器系數(shù)的影響見表4。與對照組相比，飲用益生茶高中低劑量組大鼠的心、肝、脾、肺、腎等主要臟器系數(shù)均無明顯差異（P〉0.05），表明大鼠長期飲用白茶鮮葉制益生茶對雄性大鼠主要臟器重量無明顯影響。

表3 制益生茶對大鼠體重的影響Table 3 Effects of Probiotic tea on body weight in rats

表4 益生茶對大鼠臟器系數(shù)的影響Table 4 Effects of Probiotic tea on organ coefficient in rats

2.2.4 對大鼠血液學指標的影響

益生茶對大鼠血液學指標的影響結(jié)果見表5。與對照組相比，自由飲用益生茶高、中、低劑量組大鼠血液的白細胞數(shù)目 （WBC），淋巴細胞數(shù)目（Lymph），紅細胞總數(shù)（RBC），血紅蛋白（HGB），平均紅細胞壓積（MCV），平均紅細胞血紅蛋白濃度（MCHC），單核細胞數(shù)目（Mon）等指標均無顯著差異（P〉0.05），表明益生茶對雄性大鼠血液學指標無明顯影響。

表5 益生茶對大鼠血液學指標的影響Table 5 Effects of probiotic tea on hematological indicators in rats

2.2.5 對大鼠血液生化學指標的影響

益生茶對大鼠血液生化學指標的影響結(jié)果見表6。與對照組比較，自由飲用益生茶湯高、中、低劑量組大鼠血液的天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶 （ALT）、谷氨酰氨轉(zhuǎn)移酶（GGT）、尿素氮（BUN）、總蛋白（TP）、總膽紅素（TBIL）、肌酸激酶（CK）的檢查結(jié)果均無顯著差異（P〉0.05），揭示益生茶對雄性大鼠肝、腎功能無明顯影響。

表6 益生茶對大鼠血液生化學指標的影響Table 6 Effects of Probiotic tea on blood biochemical indexes in rats

3 討論

試驗以白葉茶鮮葉制益生茶為受試物進行了急性經(jīng)口灌胃和慢性毒性試驗，以期了解短時間和較長時間白葉茶鮮葉制益生茶所產(chǎn)生的毒性反應(yīng)和發(fā)揮毒性作用的靶器官。從急性毒性試驗來看，大鼠經(jīng)口灌胃5 mL/kg·BW的5%益生茶湯14 d后未觀察到大鼠有明顯中毒體征，體重增長情況與對照組相比無明顯差異（P〉0.05），無動物死亡，試驗結(jié)束解剖動物，肉眼觀察試驗組和對照組主要臟器的體積、顏色、質(zhì)地未出現(xiàn)異常，故未進一步進行病理檢查。通過急性毒性試驗可以看出益生茶基本無急性毒性，因此飲用正規(guī)渠道的益生茶具有很高的安全性，但是飲用任何物質(zhì)超過一定范圍都可能致死，大鼠經(jīng)口灌服蒸餾水的LD50為 469±51 mL/kg[12]，因此科學地飲用益生茶才是飲茶健身的必然要求。

從慢性毒性試驗來看，經(jīng)過6周大鼠連續(xù)自由飲用益生茶湯后，解剖觀察大鼠主要臟器未見異常，且作為顯示受試物靶器官重要指標的臟器系數(shù)[13-14]與對照組相比也無顯著性差異，血常規(guī)和生化檢查與蒸餾水對照相比均無明顯差異 （P〉0.05），說明益生茶對大鼠的生長發(fā)育、肝腎功能、器官組織均無明顯毒性。綜上所述，急性經(jīng)口毒性試驗顯示白葉茶鮮葉制益生茶無急性毒副作用，慢性毒性實驗顯示白葉茶鮮葉制益生茶長期使用是安全的。白葉茶鮮葉制益生茶對大鼠基本無毒性，作為保健性飲品的開發(fā)利用是安全的。后續(xù)將對白葉茶鮮葉制益生茶的保健功效進行進一步研究，以期了解白葉茶鮮葉制益生茶在抗氧化、減肥降脂方面的功效。

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浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點實驗室

浙江省茶資源跨界應(yīng)用技術(shù)重點實驗室是經(jīng)浙江省科學技術(shù)廳、浙江省財政廳和浙江省發(fā)展和改革委員會聯(lián)合發(fā)文（浙科發(fā)條【2013】165號）批準建設(shè)的重點實驗室，掛靠單位為中華全國供銷合作總社杭州茶葉研究院。實驗室2013年7月正式批復(fù)建設(shè)，2016年1月順利通過驗收。2014～2016浙江省科技廳組織的績效評價中，結(jié)果為優(yōu)秀。

重點實驗室針對茶葉資源生態(tài)高值利用和跨界含茶終端產(chǎn)品開發(fā)不足的問題，重點圍繞以下幾個方向的科技創(chuàng)新和成果孵化工作：（1）茶資源功能活性物質(zhì)制備與改性技術(shù)研究；（2）功能性終端茶制品開發(fā)與品控技術(shù)研究；（3）茶資源高效利用關(guān)鍵設(shè)備開發(fā)與應(yīng)用技術(shù)研究；（4）終端產(chǎn)品功能、安全評價及標準化研究。

聯(lián)系人：周春江 電話：0571-86040643,15868115470

Acute and Chronic Toxicity Test of Probiotic Tea Produced by Fresh Albino Tea Leaves

SUN Kai1，2， LI Shun-geng3， WANG Guang-guang1，2， FAN Wen-tong1，2， WANG Ling1，2，BIAN Jian-chun1，2*
（ 1.College of Veterinary Medicine， Yangzhou University， Yangzhou 225009， China； 2.Jiangsu Co-Innovation Center for Prevention and Control of Important Animal Infectious Diseases and Zoonoses，Yangzhou 225009， China；3.Jiangsu Liyang Tianmuhu Longxin Featured Agricultural Cooperatives， Liyang 213334， China ）

TS272.5+5；R994.4

A

2095-0306（2017）02-0011-05

2017-04-03

江蘇省溧陽市重點研發(fā)計劃-現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（LB2015005）；江蘇高校優(yōu)勢學科建設(shè)工程資助項目（PAPD）

孫凱（1993-），男，江蘇徐州人，碩士研究生，主要從事動物營養(yǎng)代謝病與中毒病研究。

*

jcbian@yzu.edu.cn