陳 慶， 李向紅， 趙金燕， 盧曉寧， 薛 翔

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科， 陜西 西安 710004)

LGR5在宮頸癌發(fā)生中的作用及機(jī)制初探

陳 慶， 李向紅， 趙金燕， 盧曉寧， 薛 翔

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科， 陜西 西安710004)

目的研究富含亮氨酸重復(fù)序列的G蛋白偶聯(lián)受體5(LGR5)在宮頸癌發(fā)生中的作用及機(jī)制。方法分別采用免疫組化、Western blot檢測LGR5、β-鏈蛋白(β-catenin)在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌組織中的表達(dá)，分析LGR5與宮頸癌臨床病理特征、β-catenin的關(guān)系；通過腫瘤球形成試驗觀察LGR5對宮頸癌發(fā)生的影響。結(jié)果LGR5、β-catenin在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌中的陽性率分別為17%(5/30)，65%(11/17)，84%(54/64)以及13%(4/30)，53%(9/17)，92%(59/64)，差異均具有統(tǒng)計意義(P<0.01)。LGR5表達(dá)與宮頸癌病理分級相關(guān)，而與患者年齡、臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移無相關(guān)性。宮頸癌組織中β-catenin與LGR5的表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.69，P<0.01)。LGR5過表達(dá)的人宮頸鱗癌細(xì)胞(SiHa細(xì)胞)腫瘤球形成率高于綠色熒光蛋白(GFP)對照組(P<0.01)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論LGR5促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生，其機(jī)制可能與β-catenin高表達(dá)相關(guān)。

LGR5； 宮頸癌； β-catenin； 免疫組化； Western blot

宮頸癌是一種嚴(yán)重威脅女性健康的生殖系統(tǒng)惡性疾病，也是導(dǎo)致婦女癌癥死亡的主要病因之一。據(jù)報道，每年大約有27萬人死于宮頸癌[1]，尤其近年來，宮頸癌的發(fā)病呈現(xiàn)出低齡化趨勢。腫瘤的發(fā)生與一些干細(xì)胞相關(guān)蛋白的異常表達(dá)密切相關(guān)，富亮氨酸重復(fù)序列G蛋白偶聯(lián)受體5(leucine-rich-repeat-containing G-protein-coupled receptor 5, LGR5)是小腸及毛囊成體干細(xì)胞的一種新型標(biāo)志物[2]。據(jù)報道，LGR5在結(jié)直腸癌[3]、肝癌[4]、基底細(xì)胞癌[5]等多種類型的腫瘤組織中出現(xiàn)表達(dá)升高。目前在宮頸癌組織中尚未見報道，為探討LGR5在宮頸癌中的表達(dá)及意義，本研究通過免疫組化、Western blot等技術(shù)分析了LGR5及β-catenin在宮頸癌組織中的表達(dá)及相關(guān)性。

1 材料及方法

1.1主要試劑與材料:LGR5蛋白抗體(Abnova,臺北)；β-catenin(santa cruz，美國)，β-actin單抗(santa cruz，美國)；DMEM(高糖)培養(yǎng)基(Sigma，美國)；SiHa細(xì)胞株(ATCC，美國)；羊抗鼠/兔SP試劑盒(博士德公司，武漢)；LGR5過表達(dá)及GFP對照載體

1.2臨床資料:64例宮頸癌，17例宮頸上皮內(nèi)瘤變及30例正常宮頸組織標(biāo)本分別收集于2009年1月至2012年12月期間于西安交通大學(xué)第一、二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科住院及門診患者，患者年齡31～71歲，平均年齡48.5歲。腫瘤患者術(shù)前經(jīng)活檢確診，且術(shù)前均未接受放療及化療，手術(shù)行全子宮及雙側(cè)附件切除+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)。其中正常宮頸來自于子宮肌瘤子宮全切患者。均為宮頸鱗癌，其中病理分級Ⅰ/Ⅱ為45人，Ⅲ為19人，浸潤深度為淺間質(zhì)浸潤39人，深間質(zhì)浸潤25人；宮頸上皮內(nèi)瘤變?yōu)镃INⅠ/Ⅱ為9人，CINⅢ為8人。

1.3免疫組化檢測LGR5、β-catenin蛋白:采用免疫組織化學(xué)染色法檢測正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌組織中LGR5、β-catenin的表達(dá)。具體操作步驟參照Fan等[6]描述的方法進(jìn)行。陽性結(jié)果判定：隨機(jī)觀察5個視野，將陽性細(xì)胞百分率分為5個等級，分別評分為：<5%(0)；5%～25%(1)；25%～50%(2)；50%～75%(3)；>75%(4)；按染色強(qiáng)度分為4個等級，分別評分為：陰性：背景色相同或不染色(0)，弱：染色呈淡黃色(1)，中：染色呈黃或棕黃色(2)，強(qiáng)：染色呈黃褐色(3)。最終評分按下列公式計算：

免疫反應(yīng)評分(IRS)=陽性細(xì)胞百分率評分×染色強(qiáng)度評分。

IRS>3定義為陽性染色，其中IRS≤3為弱，36為強(qiáng)。

1.4SiHa細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:SiHa細(xì)胞置于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液，5% CO2培養(yǎng)箱中，37℃常規(guī)培養(yǎng)。采用脂質(zhì)法轉(zhuǎn)染LGR5過表達(dá)及GFP對照質(zhì)粒(本實驗室構(gòu)建)至SiHa細(xì)胞，其操作步驟嚴(yán)格按照Lipofectamine 2000說明書進(jìn)行。陽性克隆在熒光顯微鏡下可見綠色熒光表達(dá)。

1.5Western blot檢測LGR5、β-catenin蛋白:宮頸癌組織和細(xì)胞分別于蛋白裂解液中，在冰上裂解30min，4℃12000 rpm離心15min，提取蛋白。通過BCA法進(jìn)行蛋白定量，按照Wang等[7]描述的方法進(jìn)行western blot檢測。

1.6腫瘤球形成試驗:調(diào)整細(xì)胞密度為1×104個/mL，在24孔板中，提前加好0.5mL DMEM/F12干細(xì)胞培養(yǎng)基。在24孔板每孔加入10μL細(xì)胞懸液(即100個細(xì)胞)，十字晃動24孔板使細(xì)胞分散均勻，重新放置于37℃、含5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。懸浮培養(yǎng)2周，每隔3d滴加0.2mL DMEM/F12干細(xì)胞培養(yǎng)基，在倒置顯微鏡下觀察腫瘤球的形成情況，并計算腫瘤球形成率。

2 結(jié) 果

2.1LGR5與β-catenin的表達(dá):LGR5、β-catenin在宮頸癌組織(Squamous cervical carcinoma，SCC)中的表達(dá)均高于正常宮頸(Normal cervix，NC)及宮頸上皮內(nèi)瘤變(Cervical intraepithelial neoplasias，CIN)，見圖1，且LGR5與β-catenin在NC、CIN及SCC的陽性率分別為17%(5/30)，65%(11/17)，84%(54/64)以及13%(4/30)，53%(9/17)，92%(59/64)，差異均具有統(tǒng)計意義(P<0.01)，表1。

表1 LGR5、β-catenin在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌組織的陽性表達(dá)

2.2臨床病理學(xué)特征分析:LGR5蛋白表達(dá)與宮頸癌病理分級相關(guān)(P=0.035)，與患者年齡、臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移無關(guān)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 LGR5表達(dá)與宮頸癌組織臨床病理特征的關(guān)系n(%)

注：a score ≤3, b score>3, c Chi-square test

圖1 LGR5、β-catenin在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變及宮頸癌組織中的表達(dá)

圖2 宮頸癌中LGR5與β-catenin表達(dá)的相關(guān)性

A：Western blot檢測LGR5、β-catenin在宮頸癌組織中的表達(dá)；B：LGR5、β-catenin表達(dá)的相關(guān)性分析

2.3宮頸癌組織中LGR5與β-catenin的相關(guān)分析:Western blot結(jié)果顯示，宮頸癌組織中β-catenin表達(dá)有隨LGR5表達(dá)升高而升高的趨勢，見圖2A，通過定量分析發(fā)現(xiàn)，β-catenin與LGR5蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.69，P<0.01)見圖2B。

2.4腫瘤球形成試驗:LGR5過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞，24h后，熒光顯微鏡下陽性克隆顯綠色熒光，經(jīng)G418篩選，Western blot鑒定，獲得穩(wěn)定過表達(dá)LGR5蛋白的SiHa(SiHa-LGR5)細(xì)胞株，見圖3。與對照組(SiHa-GFP)相比，SiHa-LGR5組腫瘤球形成時間早，生長速度快，見圖4A。培養(yǎng)12d后，SiHa-LGR5組腫瘤球形成率明顯高于SiHa-GFP組，經(jīng)χ2檢驗，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖4 B，C。

圖3 LGR5過表達(dá)宮頸癌細(xì)胞系構(gòu)建

A，LGR5過表達(dá)載體轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞，GFP為綠色熒光蛋白；B，Western blot鑒定LGR5在轉(zhuǎn)染細(xì)胞的表達(dá)。

圖4 LGR5對SiHa細(xì)胞體外腫瘤球形成的影響

A，SiHa細(xì)胞腫瘤球的生長，200×；B-C，LGR5對SiHa細(xì)胞腫瘤球形成率的影響，100×；*P<0.05。

2.5β-catenin在LGR5過表達(dá)細(xì)胞中的表達(dá):Western blot檢測顯示，β-catenin在SiHa-LGR5及SiHa-GFP細(xì)胞中的表達(dá)與LGR5的表達(dá)相一致，見圖5。

圖5 LGR5、β-catenin在SiHa細(xì)胞中的表達(dá)

3 討 論

LGR5是一種具有七次跨膜結(jié)構(gòu)的G蛋白偶聯(lián)受體，屬于G蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，在胚胎和器官的發(fā)育以及體內(nèi)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、代謝調(diào)節(jié)方面具有重要功能[8]，現(xiàn)已被確認(rèn)為人類小腸及毛囊成體干細(xì)胞的重要分子標(biāo)志。近年來，研究表明，LGR5與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)[3]。宮頸癌作為世界上嚴(yán)重威脅女性健康的第三大惡性腫瘤[9]，在全世界每年新發(fā)病例約有50萬左右，其中絕大部分發(fā)生在發(fā)展中國家，而我國宮頸癌的發(fā)病率則位居女性惡性腫瘤之首[10]。然而，目前關(guān)于宮頸癌的發(fā)病機(jī)制尚為完全闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)，LGR5在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變及鱗狀上皮宮頸癌組織中的表達(dá)是逐漸升高的；這提示LGR5可能參與宮頸癌的發(fā)生與發(fā)展。據(jù)文獻(xiàn)報道，LGR5在結(jié)直腸癌、胃癌[4]以及基底性小細(xì)胞肺癌[5]等腫瘤組織中均呈現(xiàn)表達(dá)增高，這與本研究結(jié)果相一致。臨床病理特征分析發(fā)現(xiàn)，LGR5表達(dá)與宮頸癌病理分級之間存在顯著正相關(guān)，而與患者年齡、臨床分期及淋巴轉(zhuǎn)移等臨床特征無明顯相關(guān)，這表明LGR5可能是一個促進(jìn)宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的癌基因。體外細(xì)胞培養(yǎng)試驗表明，LGR5-SiHa細(xì)胞的腫瘤球形成率明顯高于對照組，并且腫瘤球形成時間早，生長速度快，這表明LGR5促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生。

為探討LGR5促進(jìn)宮頸癌發(fā)展的機(jī)制，本研究又分析了β-catenin在宮頸癌的表達(dá)。β-catenin是Wnt/β-catenin信號通路的關(guān)鍵信號分子，其表達(dá)高低與Wnt/β-catenin信號通路活性密切相關(guān)。Wnt/β-catenin信號通路不僅在腫瘤的發(fā)生發(fā)展方面發(fā)揮著重要作用[11]，而且與LGR5也密切相關(guān)。有報道，LGR5是Wnt/β-catenin通路的重要靶基因[12]，Wnt/β-catenin信號通路激活，可引起LGR5表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)[13]。然而，近年來也有研究報道LGR5是Wnt/β-catenin信號通路的激活劑，可增強(qiáng)Wnt/β-catenin信號通路的活性[14]。本研究發(fā)現(xiàn)，β-catenin在正常宮頸、宮頸上皮內(nèi)瘤變以及宮頸癌組織中的表達(dá)也呈升高趨勢，并且在宮頸癌組織中與LGR5的表達(dá)呈明顯正相關(guān)，這表明LGR5的促癌作用可能與β-catenin的表達(dá)相關(guān)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，β-catenin在LGR5-SiHa細(xì)胞中的表達(dá)高于對照組，與LGR5在細(xì)胞中的表達(dá)相一致，進(jìn)一步說明LGR5促癌作用與Wnt/β-catenin信號通路激活有關(guān)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)LGR5在宮頸癌組織中是高表達(dá)的，并能促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生，其機(jī)制可能與Wnt/β-catenin信號通路激活有關(guān)。這為探討LGR5在宮頸癌發(fā)生發(fā)展中的分子機(jī)制提供了線索，但宮頸癌中LGR5表達(dá)與Wnt/β-catenin信號通路激活的具體機(jī)制，尚需進(jìn)一步深入研究。

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TheRoleandMechanismofLGR5inCervicalCarcinogenesis

CHENQing,LIXianghong,ZHAOJinyan,etal

(TheSecondAffiliatedHospitalofXi'anJiaotongUniversity,ShannxiXi'an710004,China)

Objective:To investigate the role and mechanism of LGR5 in cervical carcinogenesis.MethodsThe expression of LGR5 and β-catenin in normal cervix, cervical intraepithelial neoplasias and squamous cervical cancer were determined by immunohistochemistry and western blot, and analyze the relationship between LGR5 and clinical pathological features of cervical cancer and β-catenin expression. The effect of LGR5 on cervical carcinogenesis was examined using tumorsphere formation.ResultsThe positive rate of LGR5 and β-catenin in normal cervix, cervical intraepithelial neoplasias and cervical cancer were 17% (5/30), 65% (11/17), 84% (54/64) and 13%(4/30)，53%(9/17)，92%(59/64)，respectively. The difference was statistically significant (P<0.01). The expression of LGR5 was associated with pathological grade of cervical cancer, but not with patient's age, clinical stage and lymph node metastasis. β-catenin expression in cervical cancer was positively related to LGR5 expression(r=0.69, P<0.01). Moreover, the rate of tumorsphere formation of LGR5 overexpression SiHa cell was significantly higher than the GFP control group (P<0.01).ConclusionLGR5 and promoted cervical carcinogenesis and its mechanismmay be associated with high expressio0n of β--catenin

LGR5; Cervical cancer; β-catenin; Immunohistochemistry; Western blot

1006-6233(2017)09-1455-05

A

10.3969/j.issn.1006-6233.2017.09.014

陜西省自然科學(xué)基金,(編號：2016JM8067)