王冠穎，劉志國，戰(zhàn)曉燕，薛德林,2

（1.遼寧威蘭生物技術(shù)有限責(zé)任公司，沈陽110022；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽110016）

不同蛋白酶對(duì)豆粕酶解作用效果的研究

王冠穎1，劉志國1，戰(zhàn)曉燕1，薛德林1,2

（1.遼寧威蘭生物技術(shù)有限責(zé)任公司，沈陽110022；2.中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所，沈陽110016）

為研究不同蛋白酶對(duì)豆粕的酶解作用效果，在不同的作用時(shí)間和作用溫度條件下，選用5種蛋白酶進(jìn)行試驗(yàn)，然后對(duì)酶解物進(jìn)行測定，測定的指標(biāo)包括粗蛋白質(zhì)和酸溶蛋白，并用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法對(duì)酶解物中的大豆抗原蛋白進(jìn)行定性分析。結(jié)果表明，豆粕經(jīng)蛋白酶作用后，其粗蛋白質(zhì)和酸溶蛋白的含量提高，粗蛋白質(zhì)含量提高2.32%～14.75%，酸溶蛋白含量最高達(dá)15.50%，且35℃條件下的酶解作用效果比30℃好，酶解作用時(shí)間120 h的效果比72 h好，作用時(shí)間為120 h時(shí)酸性蛋白酶和中性蛋白酶4作用效果相對(duì)較好；SDS-PAGE凝膠電泳結(jié)果表明，在試驗(yàn)條件下，這5組蛋白酶對(duì)大豆抗原蛋白幾乎沒有降解作用。

蛋白酶；豆粕；酶解物

Abstract:In order to study the effect of different proteases on the soybean meal at different temperatures and time,five kinds of proteases were selected for experiment and the hydrolysates were determined.The indicators included crude protein and acid soluble protein and the antigen of the hydrolysates was qualitatively analyzed by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE).The results showed that the content of crude protein increased 2.32%～14.75%and the content of acid soluble protein was 15.50%.Moreover the content of crude protein and acid soluble protein of each group at 35℃was significantly higher than that at 30℃and the enzymolysis time at 120 h was bettet than that at 72 h.The effect of acid protease and neutral protease 4 was better than others in this test.The results of SDS-PAGE gel electrophoresis showed that the soybean antigen had little or no degradation in the conditions of this test.

Key words:protease;soybean meal;hydrolysates

豆粕是飼料生產(chǎn)中優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)原料，其氨基酸組成合理，營養(yǎng)豐富，但是豆粕結(jié)構(gòu)復(fù)雜，存在抗?fàn)I養(yǎng)因子，消化率比較低，酶解豆粕能有效地消除大豆蛋白中一些抗?fàn)I養(yǎng)因子，有效地降低蛋白質(zhì)的分子量，提供小分子蛋白質(zhì)和小肽，可提高動(dòng)物的消化吸收率以及促進(jìn)生長，大幅提高豆粕產(chǎn)品的應(yīng)用范圍和經(jīng)濟(jì)效益[1]。目前，關(guān)于微生物發(fā)酵豆粕的研究比較多，但是微生物發(fā)酵豆粕中小肽含量較低，如果微生物聯(lián)合蛋白酶進(jìn)行豆粕發(fā)酵，會(huì)提高發(fā)酵豆粕中小肽的含量，因此篩選適合的蛋白酶對(duì)于提高發(fā)酵豆粕的品質(zhì)尤為重要。為研究不同蛋白酶對(duì)豆粕的酶解作用效果，本試驗(yàn)選用了5種蛋白酶進(jìn)行試驗(yàn)并在一定的條件下進(jìn)行豆粕的酶解作用，以期更好的發(fā)揮蛋白酶在發(fā)酵豆粕上的積極效用提供一定的依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 豆粕

豆粕購自中糧集團(tuán)。

1.1.2 蛋白酶

蛋白酶購自朝陽華星生物公司、北京昕大洋公司、昆明愛科特公司、北京科為博公司、山東隆科特公司，活性均為50 000 U·g-1。

1.2 主要試驗(yàn)設(shè)備

DH6000II電熱恒溫培養(yǎng)箱由天津市泰斯特儀器有限公司生產(chǎn)。KDN102C凱氏定氮儀由上海纖檢儀器有限公司生產(chǎn)。H1650R離心機(jī)由湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司生產(chǎn)。垂直電泳裝置由北京六一生物科技有限公司生產(chǎn)。WD-9405D脫色搖床由北京六一生物科技有限公司生產(chǎn)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶解豆粕

稱取豆粕500 g，加入水200 mL，再加入酶粉0.1%，混合均勻后放入電熱恒溫培養(yǎng)箱，分別在30℃、35℃條件下進(jìn)行酶解，按照各種酶酶解豆粕試驗(yàn)方案進(jìn)行，見表1，在酶解豆粕72和120 h進(jìn)行取樣，90℃烘干、粉碎以供檢測，測定的指標(biāo)包括粗蛋白質(zhì)、酸溶蛋白以及大豆抗原蛋白的定性檢測。

1.3.2 粗蛋白質(zhì)測定

執(zhí)行GB/T 6432-1994標(biāo)準(zhǔn)。

表1 各種酶酶解豆粕試驗(yàn)方案

1.3.3 酸溶蛋白的測定

酸溶蛋白的測定執(zhí)行GB/T 22492-2008標(biāo)準(zhǔn)。

1.3.4 大豆抗原的定性分析

大豆抗原蛋白定性檢測采用SDS-PAGE方法[2]。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 不同蛋白酶對(duì)豆粕中粗蛋白質(zhì)和酸溶蛋白影響

豆粕中粗蛋白質(zhì)和酸溶蛋白含量見表2，不同蛋白酶對(duì)豆粕中粗蛋白質(zhì)和酸溶蛋白的影響結(jié)果見表3、4。檢測結(jié)果均按檢測物中水分為10%計(jì)算。

表2 豆粕中粗蛋白質(zhì)和酸溶蛋白含量%

表330℃條件下不同蛋白酶對(duì)豆粕中粗蛋白質(zhì)和酸溶蛋白的影響%

表435℃條件下不同蛋白酶對(duì)豆粕中粗蛋白質(zhì)和酸溶蛋白的影響%

由表2和表3可知，在酶解作用條件相同的情況下每組粗蛋白質(zhì)和酸溶蛋白的含量不同?？梢姡饔脮r(shí)間為120 h時(shí)的粗蛋白質(zhì)和酸溶蛋白含量高于作用時(shí)間為72 h時(shí)的粗蛋白質(zhì)和酸溶蛋白含量；35℃條件下酶解作用效果比30℃好，粗蛋白質(zhì)含量提高2.32%～14.75%，酸溶蛋白含量最高達(dá)15.50%，其中酸性蛋白酶組和中性蛋白酶4組的酶解物中120 h粗蛋白質(zhì)和酸溶蛋白的含量相對(duì)較高，表明酸性蛋白酶組和中性蛋白酶4酶解作用效果相對(duì)較好。

2.2 不同蛋白酶對(duì)豆粕中大豆抗原蛋白的影響

由SDS-PAGE電泳結(jié)果可知，在酶添加量為0.1%、水添加量為40%的條件下，這5組酶解物中的大豆抗原蛋白（β-伴球蛋白和球蛋白）與原豆粕相比，幾乎沒有發(fā)生降解。

注：圖a為30℃酶解豆粕72 h SDS-PAGE電泳結(jié)果；圖b為30℃酶解豆粕120 h SDS-PAGE電泳結(jié)果；圖c為35℃酶解豆粕72 h SDS-PAGE電泳結(jié)果；圖d為35℃酶解豆粕120 h SDS-PAGE電泳結(jié)果。圖中：1：原豆粕；2：酸性蛋白酶組；3：中性蛋白酶1組；4：中性蛋白酶2組；5：中性蛋白酶3組；6：中性蛋白酶4組。

3 討論

蛋白酶是飼用酶制劑中較重要的一類酶，是催化蛋白質(zhì)水解的酶類，具有高效性、催化底物專一性等特點(diǎn)，在飼料工業(yè)中應(yīng)用最為廣泛[3]。蛋白酶的來源主要有3方面，動(dòng)物源性、植物源性和微生物源性，其中微生物源性的蛋白酶性質(zhì)穩(wěn)定、安全高效，而且生產(chǎn)成本相對(duì)較低，因此在飼料工業(yè)中主要應(yīng)用微生物源性的蛋白酶[4]。根據(jù)酶作用的不同pH還可將蛋白酶分為酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶，在飼料工業(yè)中多采用酸性和中性蛋白酶[5]。豆粕中的蛋白質(zhì)含量約為43%，比大豆的蛋白質(zhì)含量高，因此具有較大的開發(fā)和利用價(jià)值。蛋白酶可將豆粕中蛋白質(zhì)水解成肽和氨基酸，避免酸法或堿法水解對(duì)氨基酸的破壞作用和變旋作用，并且其作用條件緩和，能很好的控制生產(chǎn)，且能夠提高酶解的效率[6]。酸性蛋白酶和中性蛋白酶價(jià)格低廉，且具有脫苦的作用，綜合性價(jià)比，酸性蛋白酶、中性蛋白酶比較適合作為酶解豆粕的酶制劑[7]。

研究表明，在微波加熱條件下，用堿性蛋白酶和胰蛋白酶雙酶水解大豆分離蛋白可制得低分子大豆肽[8]。研究表明，利用中性蛋白酶與木瓜蛋白酶協(xié)同水解大豆蛋白可以制取低分子肽[9]。結(jié)合實(shí)際生產(chǎn)成本考慮，試驗(yàn)選擇的酶添加量為0.1%，水分添加量為40%。試驗(yàn)結(jié)果表明，在30和35℃、酶添加量為0.1%、水添加量為40%的條件下，每組酶解物中粗蛋白質(zhì)和酸溶蛋白的含量均增加，豆粕中粗蛋白質(zhì)的含量約為45%，而在30℃、120 h時(shí)，酶解物中的粗蛋白質(zhì)含量均＞49%，酸溶蛋白含量均＞8%，在35℃、120 h時(shí)，酶解物中的粗蛋白質(zhì)含量均＞50%，酸溶蛋白含量均＞10%。表明蛋白酶對(duì)豆粕有一定的酶解作用，可以分解豆粕中的大分子蛋白，使其中小分子肽的含量增加，而且酶解時(shí)間120 h時(shí)的效果比72 h的好，酶解作用溫度35℃時(shí)的效果比30℃的好。有研究表明，粗蛋白質(zhì)在豆粕酶解后沒有顯著變化[10]。但是在試驗(yàn)中，豆粕酶解后粗蛋白質(zhì)含量提高2.32%～14.75%，具體原因需要進(jìn)一步進(jìn)行試驗(yàn)研究。

豆粕中含有的大豆抗原蛋白具有很強(qiáng)的抗原性，主要包括β-伴球蛋白和球蛋白，用SDSPAGE電泳能夠定性的檢查兩種抗原組成亞基的存在情況[11]。在試驗(yàn)中，SDS-PAGE電泳結(jié)果表明，在30和35℃、酶添加量為0.1%、水添加量為40%的條件下，每組酶解物中大豆抗原蛋白并沒有發(fā)生降解，這表明在這種反應(yīng)條件下，這幾種蛋白酶并不能降解豆粕中的大豆抗原蛋白。在今后的試驗(yàn)中，應(yīng)該探索一下其他試驗(yàn)條件，或者改變酶的添加比例，或者改變反應(yīng)溫度，再進(jìn)一步評(píng)估蛋白酶分解大豆抗原蛋白的效果。

4 結(jié)論

豆粕經(jīng)蛋白酶作用后，其粗蛋白質(zhì)和酸溶蛋白的含量有所提高，粗蛋白質(zhì)含量提高2.32%～14.75%，酸溶蛋白含量最高達(dá)15.50%，而且作用時(shí)間為120 h的效果比72 h好，作用溫度為35℃的效果比30℃好。

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The Effect of Different Proteases on the Soybean Meal

WANG Guanying1,LIU Zhiguo1,ZHAN Xiaoyan1,XUE Delin1,2

（1.Liaoning Vetland Biotechnology Co.,Ltd.,Shenyang 110022,China;2.Institute of Applied Ecology,Chinese Academy of Sciences,Shenyang 110016,China）

TQ925；S816.42

A

1001-0084（2017）09-0029-04

2017-08-05

王冠穎（1988-），女，黑龍江綏化人，碩士研究生，主要從事飼用酶制劑的研發(fā)。