范夢(mèng)茹，劉穎，吳文茹，汪政煜，張和平，陳霞

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018)

化學(xué)殺菌劑對(duì)乳桿菌烈性噬菌體P1的滅活效果

范夢(mèng)茹，劉穎，吳文茹，汪政煜，張和平，陳霞

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018)

使用不同濃度的化學(xué)殺菌劑（乙醇、異丙醇、次氯酸鈉、過(guò)氧乙酸）對(duì)噬菌體P1進(jìn)行滅活并在3 min內(nèi)完成其滅活效果的評(píng)估。結(jié)果顯示，除過(guò)氧乙酸外，其他3種化學(xué)殺菌劑對(duì)P1的滅活效果均隨著濃度的上升而逐漸加強(qiáng)。100%的異丙醇可使P1存活率瞬間下降到0.3%（減少3.79個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)）。當(dāng)次氯酸鈉含量達(dá)到8×10-4時(shí)，P1可完全失活。

化學(xué)殺菌劑；乳桿菌；烈性噬菌體；滅活

0 引 言

目前，乳酸菌已被廣泛用于工業(yè)發(fā)酵，然而發(fā)酵菌株都曾發(fā)現(xiàn)過(guò)宿主噬菌體[1]。植物乳桿菌發(fā)酵食品可以提高產(chǎn)品的感官特性[2,3]，而噬菌體的污染，會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品質(zhì)量下降[4]。雖然采取了一定的措施，但噬菌體仍然是導(dǎo)致乳品工業(yè)發(fā)酵失敗的主要原因之一。

工業(yè)上常采用合理設(shè)計(jì)工廠、改善衛(wèi)生等來(lái)減少噬菌體污染[4]。熱處理與高壓處理也用于滅活噬菌體，但部分噬菌體在高溫高壓條件下仍可存活[5-7]。此外，化學(xué)殺菌劑消毒原料及設(shè)備的同時(shí)使噬菌體失活，也可有效減少噬菌體數(shù)量。

乳桿菌烈性噬菌體P1分離自植物乳桿菌IMAU10120異常發(fā)酵液[8]。本文研究了食品工業(yè)用化學(xué)殺菌劑對(duì)該噬菌體的滅活效果，以期為工業(yè)生產(chǎn)中噬菌體的滅活提供一定的數(shù)據(jù)支持和理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 菌株、噬菌體及其培養(yǎng)條件

植物乳桿菌IMAU 10120在MRS中37℃下常規(guī)培養(yǎng)過(guò)夜，作為噬菌體P1的宿主菌株。將宿主菌株接入MRS-Ca培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600≈0.5后，接入噬菌體P1，對(duì)其進(jìn)行擴(kuò)增，并將噬菌體放在4℃保存。實(shí)驗(yàn)采用雙層平板法計(jì)數(shù)，單位為PFU/mL。

1.2 乙醇對(duì)烈性噬菌體P1的滅活效果

參照2009年Briggiler所描述的方法[9]配制體積分?jǐn)?shù)分別為0%，5%，15%，25%，30%，50%，75%，100%的乙醇；分裝900 μL于1.5mL EP管中，然后將100 μL噬菌體裂解液（約108PFU/mL）分別于上述濃度的乙醇中混合均勻，梯度稀釋后采用雙層平板法對(duì)不同濃度乙醇處理下的噬菌體計(jì)數(shù)（整個(gè)過(guò)程控制在3 min內(nèi)完成），37℃培養(yǎng)16～18 h，觀察噬菌斑，計(jì)算其滅活效果。

1.3 異丙醇對(duì)烈性噬菌體P1的滅活效果

配制體積分?jǐn)?shù)為0%，5%，15%，25%，30%，50%，100%的異丙醇；分裝900 μL于1.5 mL EP管中，其他步驟同1.2所述。

1.4 次氯酸鈉對(duì)烈性噬菌體P1的滅活效果

配制含量分別為0，50，100，150，200，400，600，8×10-4的次氯酸鈉，分裝900 μL于1.5 mL EP管中，其他步驟同1.2所述。

1.5 過(guò)氧乙酸對(duì)烈性噬菌體P1的滅活效果

配制體積分?jǐn)?shù)0%，0.15%，0.3%，0.45%，0.6%，0.75%，0.9%的過(guò)氧乙酸；分裝900 μL于1.5 mL EP管中，其他步驟同1.2所述。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次，使用SPSS軟件處理數(shù)據(jù)，采用單向方差分析，P＜0.05，用Excal軟件作圖。

2 結(jié) 果

2.1 乙醇對(duì)烈性噬菌體P1的滅活效果

噬菌體P1接入不同體積分?jǐn)?shù)（0%，5%，15%，25%，30%，50%，75%，100%）的乙醇中，其滅活效果如圖1所示。由圖1可以看出，體積分?jǐn)?shù)為5%的乙醇對(duì)P1的滅活效果較差，僅可使5%的噬菌體滅活（對(duì)數(shù)級(jí)基本沒(méi)變）；之后，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的逐漸增大，對(duì)噬菌體的滅活效果逐漸上升；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為100%時(shí)，P1的存活率雖為1.9%，但僅下降了1.73個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，不能使其完全失活。

圖1 乙醇對(duì)烈性噬菌體P1的滅活效果

2.2 異丙醇對(duì)烈性噬菌體P1的滅活效果

噬菌體P1接入不同體積分?jǐn)?shù)（0%，5%，15%，25%，30%，50%，100%）的異丙醇中，其滅活效果如圖2所示。由圖2可以看出，5%的異丙醇對(duì)P1基本沒(méi)有影響；當(dāng)異丙醇體積分?jǐn)?shù)上升到50%時(shí)，P1的存活率下降到5%（下降1.30個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)）；當(dāng)達(dá)到100%時(shí)，對(duì)P1的滅活效果顯著增加，此時(shí)存活率為0.3%（下降3.79個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)）。

圖2 異丙醇對(duì)烈性噬菌體P1的滅活效果

2.3 次氯酸鈉對(duì)烈性噬菌體P1的滅活效果

不同含量次氯酸鈉（0，5×10-5，1×10-4，1.5×10-4，2×10-4，4×10-4，6×10-4，8×10-4）對(duì)P1的滅活效果如圖3所示。與乙醇和異丙醇相比，5×10-5的次氯酸鈉就可使94.7%的P1失活，對(duì)數(shù)級(jí)下降為6.46 PFU/mL；但是隨著含量的增加，次氯酸鈉對(duì)P1的滅活效果卻沒(méi)有顯著增長(zhǎng)。當(dāng)次氯酸鈉含量增加到4×10-4時(shí)，此時(shí)可使P1下降2.50個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)。濃度為6×10-4時(shí)，可使P1下降2.94個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)，這時(shí)P1的存活率下降到0.12%。當(dāng)含量達(dá)到8×10-4時(shí)，可使P1完全失活。

圖3 次氯酸鈉對(duì)烈性噬菌體P1的滅活效果

2.4 過(guò)氧乙酸對(duì)烈性噬菌體P1滅活效果

不同體積分?jǐn)?shù)的過(guò)氧乙酸（0%，0.15%，0.3%，0.45%，0.6%，0.75%，0.9%）對(duì)P1的滅活效果如圖4所示。由圖4可以看出，不同體積分?jǐn)?shù)的過(guò)氧乙酸對(duì)P1的活力并沒(méi)有明顯影響（平均對(duì)數(shù)值為7.71 PFU/mL），當(dāng)體積分?jǐn)?shù)增長(zhǎng)到0.9%時(shí)，P1存活率仍在85%以上（對(duì)數(shù)值7.68 PFU/mL）。

圖4 過(guò)氧乙酸對(duì)烈性噬菌體P1的滅活效果

3 討論

關(guān)于化學(xué)殺菌劑（乙醇、異丙醇、次氯酸鈉、過(guò)氧乙酸）對(duì)乳酸菌噬菌體的滅活效果，許多學(xué)者都進(jìn)行過(guò)相關(guān)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，化學(xué)殺菌劑對(duì)噬菌體的滅活效果不盡相同。

1996年，Maillard研究了乙醇對(duì)銅綠假單胞菌噬菌體F116的滅活能力，結(jié)果顯示噬菌體比細(xì)菌對(duì)醇類更具有抗性。由于乙醇主要是通過(guò)改變細(xì)菌原生質(zhì)膜的脂質(zhì)成份使微生物失活，對(duì)于噬菌體，乙醇雖然改變了噬菌體的衣殼蛋白結(jié)構(gòu)，但對(duì)DNA卻沒(méi)有損傷[10]。2000年，Binetti檢測(cè)了乙醇對(duì)不同嗜熱鏈球菌噬菌體的滅活效果，結(jié)果顯示75%的乙醇滅活效果最好，但是不同的噬菌體對(duì)其敏感度不同，滅活噬菌體021-4需要15 min，滅活噬菌體031-D和噬菌體CYM需要30 min，噬菌體021-5和噬菌體0BJ則需要更長(zhǎng)的滅活時(shí)間（大于45 min）[11]。2003年，Quiberoni利用體積分?jǐn)?shù)100%乙醇對(duì)德氏乳桿菌噬菌體BYM、YAB、LL-H和Ib3進(jìn)行了處理，結(jié)果顯示，噬菌體YAB需作用15 min，LL-H需作用30 min，其他需要45 min以上才能完全失活[12]。2010年，Ebrecht也對(duì)該種類噬菌體進(jìn)行過(guò)研究，文中表明，噬菌體Cb1/204達(dá)到完全失活至少需要100%的乙醇作用45 min[13]。關(guān)于干酪乳桿菌噬菌體，Capra在2004年和2006年均做過(guò)相關(guān)研究，結(jié)果顯示，體積分?jǐn)?shù)100%的乙醇滅活噬菌體PL-1、J-1和MLC-A均需要45 min以上。2012年，Mercanti對(duì)噬菌體iLp84和iLp1308進(jìn)行檢測(cè)，得到了與Capra同樣的結(jié)果[6,14-15]。2009年，Briggil?er用100%的乙醇滅活植物乳桿菌噬菌體B1、B2、FAGK1和FAGK2，45 min后4種噬菌體仍無(wú)法完全失活[9]。乙醇可用于空氣與地面表面衛(wèi)生的清潔，與其他殺菌劑結(jié)合后可以有更好的殺菌效果[10]。本研究通過(guò)不同濃度乙醇對(duì)乳酸菌烈性噬菌體P1進(jìn)行滅活實(shí)驗(yàn)后發(fā)現(xiàn)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，P1的存活率逐漸下降；當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到100%時(shí)，P1的存活率下降到1.9%，沒(méi)有完全失活?？赡苁怯捎谝掖俭w積分?jǐn)?shù)過(guò)高，在噬菌體表面反而形成了一層保護(hù)膜，導(dǎo)致衣殼蛋白在短時(shí)間內(nèi)無(wú)法全部分解。

異丙醇與乙醇的滅活原理一致，關(guān)于其對(duì)噬菌體的滅活效果，以下學(xué)者也做過(guò)相應(yīng)的研究。2000年，Binetti檢測(cè)了100%異丙醇對(duì)嗜熱鏈球菌噬菌體的滅活效果，結(jié)果顯示處理滅活噬菌體031-D需要15 min[11]。1999年，Quiberoni利用100%異丙醇處理瑞士乳桿菌噬菌體CNRZ 832-B1和CNRZ 0241，5 min后可使其完全失活[16]。2002年Suárez的研究表明，乳酸乳球菌噬菌體001僅需3.8 min處理即可被100%的異丙醇完全失活[17]。綜上所述，使用100%的異丙醇對(duì)噬菌體進(jìn)行滅活時(shí)，至少需要處理3.8 min，而大多數(shù)的噬菌體則需要超過(guò)45 min。本實(shí)驗(yàn)中，100%的異丙醇可使噬菌體P1的存活率瞬間下降到0.3%，基本達(dá)到完全滅活。

1998年，Maillard指出次氯酸鈉是通過(guò)改變噬菌體的衣殼結(jié)構(gòu)，聚集噬菌體的尾部蛋白來(lái)使其失活的，然而不同噬菌體對(duì)次氯酸鈉的耐受力卻呈現(xiàn)出一定的差異性[10]。2002年，Suárez用次氯酸鈉對(duì)噬菌體進(jìn)行滅活實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，3×10-4的次氯酸鈉可在2.7 min使噬菌體046完全失活；2×10-4ppm的次氯酸鈉則需3.1 min使噬菌體QP4失活，同時(shí)可在瞬間使噬菌體001和QF12失活[17]。對(duì)于德氏乳桿菌噬菌體，Ebrecht與Quiberoni都進(jìn)行過(guò)相關(guān)研究。2010年，Ebrecht發(fā)現(xiàn)噬菌體Cb1/204和Cb1/342對(duì)次氯酸鈉顯示出不同的耐受性。雖然完全滅活時(shí)間均為2.5 min，但滅活噬菌體Cb1/204所需濃度為2×10-4，而噬菌體Cb1/342卻為3×10-4[13]。2003年，Quiberoni發(fā)現(xiàn)，4×10-4次氯酸鈉需要5～45 min才能使德氏乳桿菌噬菌體BYM、YAB和LL-H完全失活；對(duì)于噬菌體Ib3，雖利用1.2×10-3處理45 min以上，但仍不能使其完全失活[12]。2009年，Briggiler用8×10-4的次氯酸鈉滅活植物乳桿菌噬菌體 ATCC 8014-B1、ATCC 8014-B2、FAGK1和FAGK2，結(jié)果顯示，除噬菌體ATCC 8014-B2外（需15 min），其他3種均需要滅活30 min[9]。2012年，Mercanti研究發(fā)現(xiàn)，8×10-4的次氯酸鈉對(duì)不同副干酪乳桿菌噬菌體的作用效果不同，滅活噬菌體iLp84需要30 min，iLp1308僅需5 min[6]。工業(yè)生產(chǎn)中，常用濃度為5×10-5的次氯酸鈉作為洗手液，消毒器具的濃度為1×10-4，消毒鞋靴為2×10-4～3×10-4。本實(shí)驗(yàn)中，8×10-4的次氯酸鈉可以使P1失活，但是該濃度高于工業(yè)使用范圍[9]。

過(guò)氧乙酸不僅會(huì)使噬菌體的衣殼蛋白結(jié)構(gòu)改變，而且會(huì)使噬菌體的核酸完全斷裂[10,14]。過(guò)氧乙酸可以有效滅活大部分的微生物，卻不受其他物質(zhì)的影響（如過(guò)氧化氫酶），并且其作用的溫度和pH值范圍較為廣泛[10]。關(guān)于過(guò)氧乙酸滅活噬菌體，所有的研究結(jié)果均顯示，過(guò)氧乙酸是滅活噬菌體的最佳化學(xué)試劑[6,9,11-17]，滅活2～5 min就能使噬菌體完全失活。但是在本實(shí)驗(yàn)中，不同含量的過(guò)氧乙酸對(duì)噬菌體P1卻沒(méi)有明顯的滅活效果。

4 結(jié)論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，除過(guò)氧乙酸外，隨著化學(xué)殺菌劑濃度的升高，其對(duì)P1的滅活效果增強(qiáng)。體積分?jǐn)?shù)100%乙醇雖然可滅活98.1%的噬菌體，但并不能使其完全失活。與乙醇相比，體積分?jǐn)?shù)100%的異丙醇對(duì)P1的滅活效果有所提高，可以使噬菌體P1的存活率下降到0.3%（下降了3.79個(gè)對(duì)數(shù)級(jí)），但仍無(wú)法達(dá)到完全失活效果。8×10-4的次氯酸鈉雖可使P1失活，但該濃度高于工業(yè)經(jīng)常使用的濃度，因此不適合在工業(yè)生產(chǎn)中使用。綜上所述，完全依賴單一的化學(xué)殺菌劑無(wú)法在短時(shí)間內(nèi)使P1完全失活，因此，可以適當(dāng)延長(zhǎng)化學(xué)殺菌劑作用于P1的時(shí)間，或者可以結(jié)合其他的滅活方法，以達(dá)到完全滅活P1的目的。

[1]HOLS P,HANCY F,FONTAINE L,et al.New insights in the mo?lecular biology and physiology of Streptococcus thermophilus revealed by comparative genomics.[J].FEMs Microbiology Reviews,2005,29(3):435-463.

[2]AWAD S,AHMED N,EL S M.Influence of microfiltration and ad?junct culture on quality of domiati cheese[J].Journal of Dairy Science,2010,93(93):1807-1814.

[3]BRIGGILER M M,GARNEAU J E,TREMBLAY D,et al.Charac?terization of two virulent phages of Lactobacillus plantarum.[J].Ap?plied&Environmental Microbiology,2012,78(24):8719-8734.

[4]MARCO M B,MOINEAU S,QUIBERONI A.Bacteriophages and dairy fermentations[J].Bacteriophage,2012,2(3):149-158.

[5]MURPHY J,MAHONY J,BONESTROO M,et al.Impact of ther?mal and biocidal treatments on lactococcal 936-type phages.[J].Inter?national Dairy Journal,2014,34(1):56-61.

[6]MERCANTI D J,GUGLIELMOTTI D M,PATRIGNANI F,et al.Resistance of two temperate Lactobacillus paracasei bacteriophages to high pressure homogenization thermal treatments and chemical biocides of industrial application[J].Food Mi?crobiology,2012,29(1):99-104.

[7]CAPRA M L,PATRIGNANI F,QUIBERONI A D L,et al.Effect of high pressure homogenization on lactic acid bacteria phages and pro?biotic bacteria phages.[J].International Dairy Journal,2009,19(5):336-341.

[8]習(xí)羽.一株乳桿菌烈性噬菌體的分離鑒定及其生物學(xué)特性的研究.[D].內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué),2016.

[9]BRIGGILER M M,DE ANTONI G L,REINHEIMER J A,et al.Thermal,chemical,and photocatalytic inactivation of Lactobacillus plantarum bacteriophages[J].Journal of Food Protection,2009,72(5):1012-1019.

[10]GUGLIELMOTTI D M,MERCANTI D J,REINHEIMER J A,et al.Review:efficiency of physical and chemical treatments on the in?activation of dairy bacteriophages[J].Frontiers in Microbiology,2012,2(282):1-11.

[11]BINETTI A G,REINHEIMER J A.Thermal and chemical inactiva?tion of indigenous Streptococcus thermophilus bacteriophages isolat?ed from Argentinian dairy plants[J].Journal of Food Protection,2000,63(4):509-515.

[12]QUIBERONI A,GUGLIELMOTTI D M,REINHEIMER J A.In?activation of Lactobacillus delbrueckii bacteriophages by heat and bio?cides[J].International Journal of Food Microbiology,2003,84(1):51-62.

[13]EBRECHT A C,GUGLIELMOTTI D M,GUSTAVO T,et al.Temperate and virulent Lactobacillus delbrueckii bacteriophages:Comparison of their thermal and chemical resistance[J].Food Micro?biology,2010,27(4):515-520.

[14]CAPRA M L,QUIBERONI A,REINHEIMER J A.Thermal and chemical resistance of Lactobacillus casei and Lactobacillus paracasei bacteriophages[J].Letters in Applied Microbiology,2004,38(6):499-504.

[15]CAPRA M L,QUIBERONI A D L,ACKERMANN H W,et al.Characterization of a New Virulent Phage(MLC-A)of Lactobacillus paracasei.[J].Journal of Dairy Science,2006,89(7):2414-2423.

[16]SUAREZ V B,REINHEIMER J A.Effectiveness of thermal treat?ments and biocides in the inactivation of Argentinian Lactococcus lac?tis phages[J].Journal of Food Protection,2002,65(65):1756-1759.

[17]QUIBERONI A,SUAREZ V B,REINHEIMER J A.Inactivation of Lactobacillus helveticus bacteriophages by thermal and chemical treatments[J].Journal of Food Protection,1999,62(8):894-908.

Inactivation effect of chemical biocides on lactobacillus virulent phage P1

FAN Mengru,LIU Ying,WU Wenru,WANG Zhengyu,ZHANG Heping,CHEN Xia

（Key Laboratory of Dairy Biotechnology and Engineering,Ministry of Education,Inner Mongolia Agricultural Universi?ty,Hohhot 010018,China）

Different concentrations of various chemical biocides were used for the inactivation of lactobacillus virulent phage P1,and the inac?tivate effect evaulation was finished in 3 min.Besides peracetic acid,the inactivate effects of the other three biocides were increased with the increasing of biocide concentration.The survival rate of phage P1 in 100%isopropanol was reduced to 0.3%(with 3.79 log decreased)in 3 min.When the concentration of sodium hypochlorite reached 8×10-4,phage P1 can be completely inactivated.

chemical biocide;lactobacillus;virulent phage;inactivation

Q939.48

A

1001-2230（2017）08-0008-03

2016-12-06

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31301517），內(nèi)蒙古自治區(qū)自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（2013MS1207），內(nèi)蒙古自治區(qū)研究生科研創(chuàng)新資助項(xiàng)目（S20161012904）。

范夢(mèng)茹（1994-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槿槠飞锛夹g(shù)。

陳霞