韋亞潔 ，李 平 ，2 ，秦 龍

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030； 2.甘肅省消化系腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030）

高效液相色譜法測(cè)定肝炎康膠囊中槲皮素含量

韋亞潔1，李 平1，2，秦 龍1

（1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院，甘肅 蘭州 730030； 2.甘肅省消化系腫瘤重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730030）

目的建立測(cè)定肝炎康膠囊中槲皮素含量的高效液相色譜法。方法 色譜柱采用Zorbax Eclipse XDB-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 m），流動(dòng)相為甲醇 -0.1%磷酸（53∶47），流速為 1.0 mL／min，柱溫為 30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)為 360 nm，進(jìn)樣量為 5 L。結(jié)果 槲皮素質(zhì)量濃度在 3.7 ～236.8 g／mL（r＝0.999 9）范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均回收率為 99.79% ，RSD 為 0.82% （n＝6）。結(jié)論 該方法準(zhǔn)確性高、專屬性強(qiáng)、重復(fù)性好，可用于肝炎康膠囊的質(zhì)量控制。

肝炎康膠囊；槲皮素；高效液相色譜法

肝炎康膠囊是在我院常年使用的臨床固定方基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)的醫(yī)療機(jī)構(gòu)制劑，由虎杖、黃芪、太子參、半枝蓮、白花蛇舌草、丹參、柴胡、水紅花子等8味藥材經(jīng)水煎提取、干燥工藝制成的中藥膠囊劑，具有益氣固本、活血化瘀、利濕解毒的功效，主要用于治療肝炎。其已建立了較為完善的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)體系，包括除水紅花子外的7種藥味的薄層色譜鑒別及大黃素的含量測(cè)定方法[1]。本制劑組方中白花蛇舌草、黃芪和水紅花子均含有槲皮素（quercetin），且其活性與本制劑的臨床主治相關(guān)。本研究中以槲皮素為檢測(cè)指標(biāo)，建立測(cè)定肝炎康膠囊中槲皮素含量的高效液相色譜（HPLC）法，擬在其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中建立大黃素和槲皮素雙成分含量限度指標(biāo)，為進(jìn)一步提高制劑的質(zhì)量控制水平提供依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技有限公司）；Mettler AB135-S型電子分析天平（十萬(wàn)分之一，瑞士梅特勒公司）；DHG-9147A型電熱恒溫干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠）；KQ3200B型超聲波清洗器（昆侖超聲儀器有限公司）。

1.2 材料

槲皮素對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為10081-201610）；肝炎康膠囊（蘭州大學(xué)第二醫(yī)院自制制劑，批號(hào)為20170205）；藥材由甘肅隴脈藥材有限公司提供，經(jīng)甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)李成義教授鑒定與檢驗(yàn)，均符合2015年版《中國(guó)藥典（一部）》及相關(guān)地方藥材標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定。甲醇（色譜純，山東禹王實(shí)業(yè)有限公司禹城化工廠）；磷酸（分析純，北京紅星化工廠）；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[2-4]

色譜柱：Zorbax Eclipse XDB-C18柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇 -0.1% 磷酸（53 ∶47）；檢測(cè)波長(zhǎng)：360 nm；柱溫：30 ℃；流速：1.0 mL ／min；進(jìn)樣量：5 μL。

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：取槲皮素對(duì)照品適量，精密稱定，置10 mL棕色容量瓶中，加甲醇制成每1 mL含370 μg的溶液，即得。

供試品溶液：取本品內(nèi)容物適量，混勻，研細(xì)，取約1.24 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為160 W，頻率為50 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：參照肝炎康膠囊處方及制法，依法制成缺白花蛇舌草、黃芪、水紅花子的陰性供試樣品，按供試品溶液項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別精密吸取2.2項(xiàng)下3種溶液各5 μL，按擬訂色譜條件注入液相色譜儀，測(cè)定。結(jié)果陰性對(duì)照品溶液色譜中，在與供試品溶液相同保留時(shí)間處未出現(xiàn)色譜峰，表明陰性對(duì)照品溶液無(wú)干擾，色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 高效液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密量取槲皮素對(duì)照品溶液0.05，0.10，0.20，0.40，0.80，1.60，3.20 mL，分別置 5 mL 棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，再用0.22 μm微孔濾膜過(guò)濾，取續(xù)濾液。分別精密吸取各5 μL進(jìn)樣，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、質(zhì)量濃度（X，C）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程 Y＝8.255 0 X-24.180， r＝0.999 9（n＝7）。結(jié)果表明，槲皮素質(zhì)量濃度在 3.7 ～236.8 μg／mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

精密度試驗(yàn)：精密吸取同一對(duì)照品溶液各5 μL，在擬訂色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次。結(jié)果峰面積的平均值為60.322 2，RSD 為 1.16%（n＝6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取同一供試品溶液各5 μL，分別于 0，1，2，3，4，5，6 h 時(shí)進(jìn)樣。結(jié)果槲皮素峰面積的平均值為 60.184 4，RSD 為 1.81% （n＝7），表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20170205）的6份樣品，每份約1.24 g，按供試品溶液制備方法制備，在擬訂色譜條件下分別進(jìn)樣各5 μL，測(cè)定峰面積并計(jì)算槲皮素含量。結(jié)果肝炎康膠囊中槲皮素的平均含量為0.415 mg／g， RSD 為 1.88% （n＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的肝炎康膠囊（批號(hào)為 20170205，含量為 0.415 mg／g）供試品溶液 6 份，分別按其槲皮素含量的80%，100%，120%精密加入槲皮素對(duì)照品溶液，搖勻。精密吸取上述溶液各5 μL，分別進(jìn)樣，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 槲皮素加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

3 討論

3.1 流動(dòng)相考察

因加入適量的酸可以抑制槲皮素色譜峰的拖尾現(xiàn)象，故選用甲醇-磷酸體系。在參照文獻(xiàn)[2-4]色譜條件的基礎(chǔ)上，分別對(duì)甲醇 -0.1%磷酸（80∶20）、甲醇 -0.1% 磷酸（60 ∶40）、甲醇 -0.1% 磷酸（57 ∶43）、甲醇 -0.1% 磷酸（53 ∶47）、乙腈 -0.1% 磷酸（75 ∶25）和乙腈-0.1%磷酸（40∶60）等流動(dòng)相體系進(jìn)行比較。結(jié)果表明，在甲醇 -0.1%磷酸（53∶47）流動(dòng)相下，色譜中槲皮素峰與相鄰共存物質(zhì)峰的分離度良好，峰形佳，槲皮素峰與相鄰共存物質(zhì)峰的分離度（R）均大于1.5，陰性無(wú)干擾。

3.2 柱溫考察

對(duì) 25，30，35，40℃等不同柱溫進(jìn)行考察，結(jié)果表明，30℃時(shí)槲皮素與相鄰共存物質(zhì)峰能很好地分離且出峰較快，最終確定柱溫為30℃。

3.3 樣品處理方法考察

由于肝炎康膠囊內(nèi)容物為水提取物，故選用供試樣品加甲醇超聲處理（功率為160 W，頻率為50 kHz）30 min的方法處理樣品。分別超聲處理 15，30，45 min，按擬訂色譜條件檢測(cè)，結(jié)果表明，30 min時(shí)肝炎康膠囊中的槲皮素已提取較完全，故確定超聲處理時(shí)間為30 min。

3.4 研究?jī)r(jià)值

建立肝炎康膠囊中槲皮素的含量測(cè)定方法，是基于多指標(biāo)控制制劑質(zhì)量的理念，即在已建立大黃素含量限度基礎(chǔ)上增加槲皮素的含量測(cè)定項(xiàng)，提高質(zhì)量控制水平。隨著今后樣品批次的增加和檢測(cè)數(shù)據(jù)的累積，將進(jìn)一步對(duì)槲皮素的含量限度進(jìn)行研究和確定，加強(qiáng)對(duì)其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的更新。

[1]王娟弟，李 平，秦 龍，等.肝炎康膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立[J].中國(guó)藥師，2015，18（4）：559-663.

[2]白吉慶，王小平，李文連.青翹果實(shí)不同部位的有效成分比較分析研究[J].中成藥，2012，34（3）：582-585.

[3]貝偉劍，羅 杰，吳愛(ài)鑾，等.HPLC法測(cè)定柿葉浸膏中槲皮素和山奈酚[J].中草藥，2005，36（7）:1014-1015.

[4]石繼亮，單 玉，張振秋，等.HPLC法測(cè)定黃芪中槲皮素、山奈酚、芒柄花素的含量 [J].藥物分析雜志，2010，30（1）：114-116.

Content Determination of Quercetin in Ganyankang Capsules by HPLC

Wei Yajie1,Li Ping1,2,Qin Long1
(1.Lanzhou University Second Hospital,Lanzhou,Gansu,China 730030;2.Key Laboratory of Digestive System Tumors,Lanzhou,Gansu,China 730030)

ObjectiveTo establish an HPLC method for the content determination of quercetin in Ganyankang Capsules.Methods The Zorbax Eclipse XDB-C18column(250 mm × 4.6 mm,5 μm)was adopted with the mobile phase of methanol-0.1%H3PO4(53 ∶47)at flow rate of 1.0 mL ／min,the column temperature was 30 ℃ and the detection wavelength was set at 360 nm,the injection volume was 5 μL.Results The linear range of quercetin was 3.7-236.8 μg ／mL(r＝ 0.999 9)with an average recovery of 99.79%,RSD ＝0.82%(n ＝ 6).Conclusion The method is accurate,specific and reproducible,which can be used for the quality control of quercetin in Ganyankang Capsules.

Ganyankang Capsules;quercetin;HPLC

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2017)17－0021－03

10.3969 ／j.issn.1006-4931.2017.17.006

甘肅省自然科學(xué)基金[145RJZA207]；蘭州大學(xué)第二醫(yī)院2015年度院內(nèi)博士基金[ynbskyjj2015-2-17]；蘭州大學(xué)第二醫(yī)院院內(nèi)中醫(yī)藥科研項(xiàng)目[YJzy2013-26]。

韋亞潔，女，大學(xué)本科，副主任藥師，講師，研究方向?yàn)榕R床藥學(xué)與中藥制劑質(zhì)量控制，（電話）0931-8942627（電子信箱）yajiewei＠ 163.com。

李平，男，博士研究生，碩士研究生導(dǎo)師，主任藥師，研究方向?yàn)樗幬镏苿?，（電子信箱）gsliping＠163.com。

2017－05－16；

2017－06－28)