張建華，蘇 晶 ，陳 卓

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)基于靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)與研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110016； 2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院·重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶 401121； 3.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 4000161）

超高效液相色譜法測(cè)定炎可寧膠囊中4組分含量

張建華1，蘇 晶2，陳 卓3

（1.沈陽(yáng)藥科大學(xué)基于靶點(diǎn)的藥物設(shè)計(jì)與研究教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，遼寧 沈陽(yáng) 110016； 2.重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院·重慶市藥物過程與質(zhì)量控制工程技術(shù)研究中心，重慶 401121； 3.重慶醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，重慶 4000161）

目的建立同時(shí)測(cè)定炎可寧膠囊中鹽酸黃柏堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚含量的超高效液相色譜（UPLC）法。方法 色譜柱為Water ACWUITY UPLC BEH C18柱（100 mm ×2.1 mm，1.7 m），流動(dòng)相為乙腈（A） -0.05 mol／L 的磷酸二氫鉀溶液（KOH 調(diào)pH ＝5.0，B），梯度洗脫，流速為 0.3 mL／min，柱溫 35℃，檢測(cè)波長(zhǎng) 244 nm。結(jié)果 鹽酸黃柏堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚進(jìn)樣量分別在0.049 30 ～ 0.086 276 g（r＝ 999 0），0.032 450 ～ 0.648 995 g（r＝ 999 9），0.004 979 ～ 0.995 88 g（r＝ 999 9），0.002 486 ～ 0.428 280 g（r＝999 8）范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，平均加樣回收率分別為 95.44%，95.20%，99.61%和95.60%。各組分基線分離，各陰性樣品無(wú)干擾，無(wú)其他組分峰影響。結(jié)論 該法可以作為炎可寧膠囊的一種多成分同時(shí)分析和質(zhì)量控制方法。

炎可寧膠囊；超高效液相色譜；鹽酸黃柏堿；黃芩苷；大黃素；大黃酚

炎可寧膠囊為常用藥，炎可寧糖衣片載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑(第七冊(cè))》，功能與主治均為清熱瀉火、消炎止痢[1]。炎可寧膠囊生產(chǎn)企業(yè)眾多，各生產(chǎn)企業(yè)的注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)多為自行申請(qǐng)的標(biāo)準(zhǔn)，檢測(cè)項(xiàng)目不一。參考文獻(xiàn)[2-6]針對(duì)制劑中的各味藥材，本研究中建立了同時(shí)測(cè)定其含量的超高效液相色譜（UPLC）法，方法操作簡(jiǎn)便，既節(jié)約時(shí)間又節(jié)約了試劑，對(duì)炎可寧膠囊質(zhì)量的整體控制具有重要意義和應(yīng)用價(jià)值，可以作為其一種多成分同時(shí)分析和質(zhì)量控制的方法。

1 儀器與試藥

Waters ACQUITY 超高效液相色譜儀（美國(guó)Waters）；AX205 型電子天平（瑞士 Mettler Toledo，0.01 mg）；BP221S 型電子天平（德國(guó) Sartorius，0.1 mg）；KQ-500B型超聲波清洗器。

炎可寧膠囊(A公司，批號(hào)分別為20160502，20160503；B 公司，批號(hào)分別為 160352，160422；C 公司，批號(hào)分別為 1507003，1607007；D公司，批號(hào)分別為ZEA1602，ZEA1601）。甲醇、乙腈為色譜純（安徽時(shí)聯(lián)特種溶劑股份有限公司）；水為實(shí)驗(yàn)室自制純化水；樣品前處理所用甲醇、乙醇、磷酸等其他試劑均為分析純（重慶川東化工＜集團(tuán)＞有限公司）。鹽酸黃柏堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)分別為 111895-201504，110715-201318，110756-201512，110796-201017，含量分別以 94.9% ，93.3% ，98.7%和99.6%計(jì)算。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件[7-10]

色譜柱：Waters ACQUITYUPLC?BEHC18柱（100 mm ×2.1 mm,1.7 μm）；流動(dòng)相：以乙腈為流動(dòng)相 A，以0.05 mol／L 的磷酸二氫鉀溶液（用氫氧化鉀調(diào) pH ＝5.0）為流動(dòng)相B，進(jìn)行梯度洗脫，見表1；檢測(cè)波長(zhǎng)：244 nm；流速：0.3 mL ／min；柱溫：35 ℃。

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序

2.2 溶液制備

對(duì)照品溶液：稱取鹽酸黃柏堿對(duì)照品0.009 58 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為鹽酸黃柏堿對(duì)照品貯備液。同法，分別稱取黃芩苷對(duì)照品 0.010 23 mg、大黃素對(duì)照品0.010 68 mg、大黃酚對(duì)照品 0.010 75 mg，精密稱定，置100 mL容量瓶，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為黃芩苷、大黃素和大黃酚對(duì)照品貯備液。分別精密量取鹽酸黃柏堿對(duì)照品溶液、黃芩苷對(duì)照品溶液、大黃素對(duì)照品溶液和大黃酚對(duì)照品溶液 1，3，1，1 mL，置100 mL容量瓶，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為混合對(duì)照品溶液。

供試品溶液：取供試品20粒，取出內(nèi)容物，研細(xì)混勻，取約0.15 g，精密稱定，置錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲（功率240 W，頻率45 kHz）處理30 min，取出冷卻至室溫，用70%甲醇補(bǔ)足質(zhì)量，搖勻，用微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

陰性對(duì)照品溶液：取按處方比例及制備工藝，分別制備缺黃柏的陰性樣品、缺黃芩的陰性樣品和缺大黃的陰性樣品，按炎可寧片[1]制法項(xiàng)下制備，再按上述供試品溶液制備方法制備溶液，即得。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性考察：分別精密吸取對(duì)照品、供試品及陰性對(duì)照品溶液各1 μL，進(jìn)樣，記錄色譜圖。陰性對(duì)照品溶液色譜中，在與大鹽酸黃柏堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚對(duì)照品保留時(shí)間處無(wú)吸收峰，說(shuō)明陰性樣品無(wú)干擾。色譜圖見圖1。

圖1 專屬性考察液相色譜圖

線性關(guān)系考察：精密量取鹽酸黃柏堿對(duì)照品貯備液，逐級(jí)稀釋，分別配制成質(zhì)量濃度 4.930，12.325，24.650，49.301，73.951，86.276 μg ／mL 的溶液；精密量取黃芩苷對(duì)照品貯備液，逐級(jí)稀釋，分別配制成質(zhì)量濃度32.450，81.124，162.249，324.497，486.746，648.995 μg ／mL 的溶液；精密量取大黃素對(duì)照品貯備液，逐級(jí)稀釋，分別配制成質(zhì)量濃度 4.979，12.449，24.897，49.794，74.691，99.588 μg／mL的溶液；精密量取大黃酚對(duì)照品貯備液，逐級(jí)稀釋，分別配制成質(zhì)量濃度 2.486，53.535，107.070，214.140，321.120，428.280 μg ／mL 的溶液；分別進(jìn)樣1 μL 溶液，測(cè)定峰面積。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X，μg）、峰面積為縱坐標(biāo)(Y)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得鹽酸黃柏堿、黃芩苷、大黃素、大黃酚的回歸方程。結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

精密度試驗(yàn)：將含有鹽酸黃柏堿對(duì)照品9.58 μg／mL，黃芩苷對(duì)照品 10.23μg／mL，大黃素對(duì)照品 10.68μg／mL，大黃酚對(duì)照品10.75 μg／mL的混合溶液連續(xù)進(jìn)樣6針，每次1 μL，測(cè)定峰面積。結(jié)果鹽酸黃柏堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚峰面積的 RSD分別為 0.85%，0.28%，0.80%和 0.82%(n＝6)，表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取鹽酸黃柏堿、黃芩苷、大黃素、大黃酚標(biāo)準(zhǔn)品物質(zhì)，按照2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液制備方法配置成對(duì)照品的混合溶液，在 0，2，4，8，12，24 h 時(shí)分別進(jìn)樣 2 次，每次精密進(jìn)樣1 μL。結(jié)果鹽酸黃柏堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚峰面積的 RSD分別為 0.86%，0.31%，0.90%和0.79%(n＝6)，表明對(duì)照品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批次樣品混合均勻，按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，分別依法測(cè)定。結(jié)果鹽酸黃柏堿、黃芩苷、大黃素和大黃酚的含量的 RSD 分別為 1.04%，1.93%，2.49%，1.29%(n ＝6)，表明該方法重復(fù)性較好。

加樣回收試驗(yàn)：分別精密量取鹽酸黃柏堿(0.0801g／L)、大黃素(0.133 0 g ／L)、大黃酚(0.124 3 g ／L)對(duì)照品的70% 甲醇溶液各 3，0.12，0.5 mL，另取黃芩苷 5.00 ～6.00 mg，精密稱定，置6個(gè)錐形瓶中，揮干溶劑，再精密量取已知鹽酸黃柏堿、黃芩苷、大黃素、大黃酚含量的樣品6份，分別加入上述錐形瓶中，按2.2項(xiàng)下供試品溶液制備的方法制備溶液，測(cè)定含量，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n＝6)

2.4 樣品含量測(cè)定

使用所得方法測(cè)定樣品，結(jié)果見表4。結(jié)果表明，所采用的超高效液相色譜法對(duì)炎可寧膠囊中鹽酸黃柏堿、黃芩苷、大黃素、大黃酚的含量進(jìn)行測(cè)定，選擇不同廠家生產(chǎn)的8個(gè)批次炎可寧膠囊進(jìn)行考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同批次的炎可寧膠囊中，各個(gè)組分差異的含量明顯。

表4 8批樣品含量測(cè)定結(jié)果(mg／g)

3 討論

3.1 提取方法考察

本試驗(yàn)中分別考察了取樣量 0.10，0.15，0.50 g，加入提取溶劑量分別為25，50，100 mL，所用提取溶劑分別為體積分?jǐn)?shù)60%，70%，80%和90%甲醇、體積分?jǐn)?shù)60%，70%，80%和90%乙醇、0.1%HCl水溶液9個(gè)溶劑系統(tǒng)，并考察了超聲提取20，40，60 min、加熱回流提取30 min和60 min和索氏提取法7個(gè)提取方案。結(jié)果表明，采用體積分?jǐn)?shù)70%甲醇50 mL，超聲（功率240 W，頻率45 kHz）處理30 min，各組分的提取效率較高，且省時(shí)、節(jié)省溶劑，因此最終采用該提取方法。

3.2 流動(dòng)相考察

本試驗(yàn)中分別考察了甲醇-水、乙腈-水、甲醇-磷酸水（pH ＝ 5.0）、乙腈 -磷酸水（pH ＝5.0）、乙腈 -磷酸緩沖鹽水溶液（以 0.05 mol／L KH2PO4，KOH 調(diào) pH ＝5.0）和甲醇 -磷酸緩沖鹽水溶液（以 0.05 mol／L KH2PO4，KOH調(diào)pH＝5.0）6個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果表明，采用乙腈-磷酸緩沖鹽水溶液（以 0.05 mol／L KH2PO4，KOH 調(diào) pH ＝5.0））流動(dòng)相系統(tǒng)，各峰的分離度較好，且基線平穩(wěn)，因此最終采用乙腈-磷酸緩沖鹽水溶液流動(dòng)相系統(tǒng)。

3.3 檢測(cè)波長(zhǎng)考察

分別對(duì)鹽酸黃柏堿、黃芩苷、大黃素、大黃酚4種對(duì)照品用Waters的PDA檢測(cè)器進(jìn)行紫外區(qū)200～400 nm波長(zhǎng)掃描，在244 nm波長(zhǎng)下，炎可寧膠囊中所有含量較高的化合物峰形良好，峰高接近，且在該波長(zhǎng)下，4種成分的色譜圖基線平穩(wěn)，分離度好。綜合比較后，選擇244 nm作為本試驗(yàn)的檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.4 應(yīng)用價(jià)值

采用超高效液相色譜法對(duì)炎可寧膠囊中鹽酸黃柏堿、黃芩苷、大黃素、大黃酚的含量進(jìn)行測(cè)定，選擇不同廠家生產(chǎn)的8個(gè)批次炎可寧膠囊進(jìn)行考察，結(jié)果不同批次的炎可寧膠囊中鹽酸黃柏堿、黃芩苷、大黃素、大黃酚的含量差異明顯。根據(jù)制劑處方[1]，黃柏使用水提醇沉工藝得到浸膏入藥；但制法中靜置時(shí)間、條件等工藝各生產(chǎn)廠家參數(shù)不一，導(dǎo)致各生產(chǎn)廠家得到的膠囊中黃柏堿含量存在差異的情況發(fā)生。同時(shí)，黃芩苷的測(cè)得結(jié)果差異也較大，可能是因?yàn)橥度氲乃幉馁|(zhì)量不符合規(guī)定或者黃芩投藥量偏少，或者非法添加黃芩苷單體化合等原因造成的。本次選取的炎可寧膠囊收集于國(guó)內(nèi)不同地區(qū)，因此本研究所建立的含量測(cè)定方法，能較好地反映出炎可寧膠囊本身的質(zhì)量情況，并對(duì)全國(guó)各地區(qū)生產(chǎn)的炎可寧膠囊質(zhì)量一致性有一定的控制意義。

[1]WS3-B-1368-93，衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)·中藥成方制劑(第七冊(cè))[S].

[2]黃燕萍.HPLC測(cè)定炎可寧片中鹽酸小檗堿、黃芩苷和漢黃芩素的含量[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(20):97-99.

[3]高洪琳，劉小兵，肇鑫宇，等.RP-HPLC法同時(shí)測(cè)定炎可寧片中6種成分的含量[J].沈陽(yáng)藥科大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，31(11):885-890.

[4]周 新，陳會(huì)明，白 樺，等.HPLC與UPLC色譜條件轉(zhuǎn)換方法研究[J].分析試驗(yàn)室，2008，27(4):56-58.

[5]劉少華，金 郁，周大勇，等.超高效液相色譜(UPLC)用于丹參藥材水溶性成分指紋圖譜研究[J].世界科學(xué)技術(shù)-中醫(yī)藥現(xiàn)代化，2007，9(6):46-50.

[6]王文瓊.超高液相在藥物分析領(lǐng)域中的應(yīng)用[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012，9(11):13-14.

[7]汪楊麗，蘇 晶.HPLC測(cè)定八正膠囊中的大黃素與大黃酚[J].華西藥學(xué)雜志，2014，29(2):201-203.

[8]母小東，蘇 晶，汪楊麗.HPLC測(cè)定八正片中大黃素及大黃酚含量[J].食品與藥品，2014，16(3):203-207.

[9]周靜安.RP-HPLC法測(cè)定炎可寧片中黃芩苷的含量研究[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊，2005，23(2):353-354.

[10]尹永芹，嚴(yán)優(yōu)芍，沈志濱，等.炎可寧片中大黃5種蒽醌類成分的含量測(cè)定[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2010，16(6):122-124.

Simultaneous Determination of Four Components in Yankening Capsules by UPLC

Zhang Jianhua1,Su Jing2,Chen Zhuo3
(1.Key Laboratory of Structure-Based Drug Design and Discovery Ministry of Education,Shenyang Pharmaceutical University,Shenyang,Liaoning,China 110016; 2.Chongqing Institute for Food and Drug Control,Chongqing Engineering Center for Pharmaceutical Process and Quality Control,Chongqing,China 401121; 3.College of Medicine,Chongqing Medical University,Chongqing,China 400016)

ObjectiveTo establish an UPLC method for the content determination of phellodendrine chloride,baicalin,emodin and chrysophanol of Yankening Capsules at the same time.Methods The water ACQUITY UPLC BEH C18column(100 mm ×2.1 mm,1.7 μm)was adopted with acetonitrile(A)-0.05 mol／L KH2PO4(adjusted pH ＝ 5.0 by KOH,B)as mobile phase in gradient elution,the flow rate was 0.3 mL ／min,the column temperature was 35 ℃ ,the detection wavelength was set at 244 nm.Results The linear ranges of phellodendrine chloride,baicalin,emodin and chrysophanol were 0.049 30-0.086 276 μg(r＝ 0.999 0),0.032 450-0.648 995 μg(r＝ 0.999 9),0.004 979-0.995 88 μg(r＝ 0.999 9),0.002 486-0.428 280 μg(r＝ 0.999 8),respectively.The average percentages of recovery were 95.44%,95.20%,99.61% and 95.60%,respectively.The baseline was separated in each group,the negative sample had no interference,and the target peaks showed good conditions.Conclusion This method can be used for the simultaneous analysis and the quality control of Yankening Capsules.

Yankening Capsules;UPLC;phellodendrine chloride;baicalin;emodin;chrysophanol

R284.1；R286.0

A

1006－4931(2017)17－0017－04

10.3969 ／j.issn.1006-4931.2017.17.005

國(guó)家十二五重大專項(xiàng)“中藥質(zhì)量安全檢測(cè)和風(fēng)險(xiǎn)控制技術(shù)平臺(tái)”[2014ZX09304307-002]。

張建華（1991-），男，碩士研究生，主要從事天然藥物化學(xué)成分的研究，（電話）024-23986475（電子信箱）wshhzsdo07280＠ 163.com。

蘇晶（1980-），男，副主任中藥師，主要從事中藥質(zhì)量控制技術(shù)的研究，（電話）023-86072753（電子信箱）4267434＠qq.com。

2017－04－10)